銀耳中銀耳多糖的測(cè)定方法 編制說(shuō)明

2安發(fā)(福建)生物科技有限公司、安諾康(福建)生物技科有限我國(guó)傳統(tǒng)的真菌食藥，享有“菌中之冠”的美譽(yù)，具有滋陰潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津、免疫調(diào)節(jié)、現(xiàn)有國(guó)內(nèi)已有各級(jí)食用菌多糖類檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)包括：《GB/T15672-20耳多糖》等團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。但這些標(biāo)準(zhǔn)有各自的適用范圍、測(cè)試對(duì)象、測(cè)試方法、方法特點(diǎn)，3例能較為準(zhǔn)確的將銀耳多糖與其它多糖區(qū)分開，以彌補(bǔ)原有苯酚-硫酸的檢測(cè)缺陷。本標(biāo)準(zhǔn)建立的方法具有專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定、無(wú)雜質(zhì)干擾，此外，該方法簡(jiǎn)單、本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)于2022年3月由全國(guó)銀耳標(biāo)準(zhǔn)化工作組提出策劃，并于2022年制訂，全國(guó)銀耳標(biāo)準(zhǔn)化工作組等6家單位協(xié)作，開展標(biāo)準(zhǔn)制訂、測(cè)試）：43.2標(biāo)準(zhǔn)起草階段(2023年8月根據(jù)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)決定下達(dá)2023年第二批的測(cè)定方法》列入推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃。2023年8月28公司、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所等9個(gè)單位組前;標(biāo)準(zhǔn)送審稿完成時(shí)間：2024年11月4曰前;標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批全國(guó)銀耳標(biāo)準(zhǔn)化工作組:負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)制定全過(guò)程的組織、協(xié)調(diào)，負(fù)責(zé)征求意見稿、5用離子色譜法對(duì)銀耳中銀耳多糖進(jìn)行定性檢測(cè)，可顯示5種單糖簡(jiǎn)單、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)；苯酚硫酸法可檢測(cè)包含5種主要單糖含量以6法食用菌中總糖含量的測(cè)定本標(biāo)準(zhǔn)適用于食用菌中總糖苯酚-硫了所有單糖或淀粉糊食用菌中粗多糖含量的測(cè)定分本文件規(guī)定了食用菌中粗多糖含量的分光光度測(cè)定方本文件適用于各種食用菌鮮品及干菇、片菇、碎菇、菇粉等初加工制品中粗多糖含量的測(cè)定;不適用于添加淀以及食用菌液體發(fā)酵或固體發(fā)酵等產(chǎn)品的測(cè)定.本文件粗多糖線性含量范圍量超范圍時(shí),可酌情減少稱樣量或加大提取液定容體積.用碘溶液進(jìn)行定性鑒-硫酸法測(cè)定粗多糖含量7食品中粗多糖的測(cè)定苯本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口植物源性食品中粗多糖含量的比色測(cè)葡萄、棗類、果汁等植物源性食品中粗多糖含量的測(cè)本標(biāo)準(zhǔn)不適用于添加淀粉、苯酚-硫用碘溶液進(jìn)行定性鑒-硫酸法測(cè)定粗多糖含量食用菌中巖藻糖、阿糖甘露醇、甘露糖、葡萄核糖的測(cè)定本標(biāo)準(zhǔn)適用于食用菌中巖藻糖、阿糖醇、海藻糖、甘露醇、甘露糖、葡萄糖、半乳食用菌中巖藻糖、阿糖無(wú)水解步驟來(lái)分解單糖及并測(cè)出各種單糖銀耳多糖產(chǎn)品中多糖含本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用苯酚硫酸法測(cè)定銀耳多糖含量的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于以門擔(dān)子菌門真菌銀耳的子實(shí)體為原料，經(jīng)過(guò)水洗、熱水浸提、過(guò)濾、沉淀分離、干燥、粉碎（和制粒)等工序而制成了所有單糖或淀粉糊8本標(biāo)準(zhǔn)適用于以門擔(dān)子菌銀耳科、銀耳屬真菌銀耳子實(shí)體為原料，制成的銀耳多4本文件規(guī)定了食品級(jí)與化妝品原料級(jí)銀耳多糖產(chǎn)品的質(zhì)本文件適用于以銀耳屬真菌銀耳的子實(shí)體為原料，經(jīng)過(guò)提取、分離純化、干燥等工法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)銀耳中銀耳多糖的測(cè)定（征求意見本文件描述了采用離子色譜法對(duì)銀耳中銀耳多糖的本文件適用于銀耳中銀耳多糖經(jīng)酸水解后的特征性單糖——巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的測(cè)法1）用離子色譜法定性鑒別銀耳多糖并顯示2)用苯酚硫酸法檢測(cè)92024年7月15日在自然資源部第三海洋研究量檢驗(yàn)所、太陽(yáng)樹(廈門)生物工程有限公司等），會(huì)后，全國(guó)銀耳標(biāo)準(zhǔn)化工作組秘書處及部分參與標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)2023年第二日前將平臺(tái)和線下征集的意見，整理分類。10月16日(1)標(biāo)準(zhǔn)提出單位改為：“中華全國(guó)供銷合作總社”。(2)范圍改為：葡萄糖、木糖和甘露糖的測(cè)定。”修改理由：增加“半乳糖、葡萄糖、木糖”的測(cè)定(3)結(jié)構(gòu)調(diào)整和“4.4.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制”一并調(diào)整為“5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”；“4.3儀器”②“4.5結(jié)果計(jì)算”改為“8分析結(jié)果的表述”；“4.6重并列項(xiàng)表述；增加“7.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、7.2.在制定過(guò)程中，需要把握三項(xiàng)原則：一是需要明確在適用性方面本標(biāo)準(zhǔn)充分考慮了離子色譜的工作原理及特點(diǎn)，具有專屬性、根據(jù)銀耳多糖各單糖色譜圖的保留時(shí)間和峰面積與各實(shí)驗(yàn)方法：選擇三種型號(hào)的色譜柱：CarboPacTMPA10色譜柱(250×4.6mm，PA20和PA100色譜柱，各個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品，依萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)，可以達(dá)到分離效果，由于P但分離效果越差。在NaOH濃度為20mmol/L時(shí)，各個(gè)單糖標(biāo)離度影響(見圖7~8)，隨著流動(dòng)相的流速增大時(shí)，雖然保留譜柱使用以及儀器的運(yùn)行造成影響，因此選擇流速為0.色譜柱：CarboPacTMPA20(250×2.3mm，5μCarboPacTMPA20(50×3mm，5使用DIONEXICS-5000+SP-5系統(tǒng)，檢測(cè)器：脈沖波形：Carbohydrates(St流動(dòng)相：以水、50mmol/LNaOH溶液NaOH(%)02222溶液0.5mL，于110℃條件下水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1吹干，加水溶解轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，用水定容至刻度，采用離子考慮3倍量乙醇醇沉比例是否偏少，擬加大酒精比例進(jìn)行醇沉，5倍量乙醇沉淀單糖總量分別為：8.29%、9.25%、9.33%，從3-4倍量乙所測(cè)定單糖總合略有增長(zhǎng)；從4-5倍乙醇沉淀時(shí)，所測(cè)定的單糖總合基針對(duì)水解可能會(huì)對(duì)單糖進(jìn)行破壞問(wèn)題，我們補(bǔ)充了單糖水解破壞試驗(yàn)，結(jié)果表明，精密稱取巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品各5m量瓶中，用水定容至刻度，得濃度均為0.5mg/mL的單糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。5mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得各單糖濃度均為100μg/mL的混吸取0.5mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于水解管中，加入2mo3實(shí)驗(yàn)方法：準(zhǔn)確稱取粉碎銀耳樣品（過(guò)二號(hào)篩取上清液加水定容至一定體積，各取0.5mL提取液于水解管中，加入2mo0.5mL，于110℃條件下水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮在4h之后，增長(zhǎng)趨勢(shì)不明顯，單糖總量出現(xiàn)了下降。這可能由于當(dāng)加入50mL水，分別于60、70、80、90、100上清液加水定容至一定體積，各取0.5mL提取液于水解管中，加入2mol/L的mL，于110℃條件下水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖11表明，隨著溫度的升高，銀實(shí)驗(yàn)方法：準(zhǔn)確稱取粉碎銀耳樣品（過(guò)二號(hào)篩）1.0000g，置于125mL錐形瓶中，于100℃水浴中攪拌4h，分別選取料液比1：20、1：30、1：40、1：50、1：60（g/mL）加入水，提取結(jié)束后，冷卻離心，取上清液加水定容至一定體積，各取水解管中，加入2mol/L的TFA溶液0.5mL，于110℃條件下水解3h至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適宜濃度，采加，多糖溶出達(dá)到飽和，會(huì)趨于平穩(wěn)或者緩慢下降，因此最佳料液比選擇1:40(g/mL)。加入50mL水，于100℃水浴中攪拌4h，提取結(jié)束后，冷卻離心，留提取液于水解管中，加入2mol/L的TFA溶液0.5mL，于110℃條件下后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適實(shí)驗(yàn)方法：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)響112335110203000400050116017000809000010101100001011001量對(duì)提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)的回=10.72+3.50A+3.33B+1.90C+3.18AB+3.24AC+0.035BC+0.000A2-3.04B通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的結(jié)果對(duì)銀耳多糖溶液提取工藝的回歸方程9A1BBCC773344注:“*”表示差異顯著注:“*”表示差異顯著(P＜0.05)；“**”表示差異極顯著P值均小于0.01，說(shuō)明存在顯著性。二次項(xiàng)中，A2影響不顯著(P＞0.05)，B2(P＜0.01)，C2影響極顯著(P＜0.01)。校正模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9940可知試值和模擬預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性很高，表明該方程的模擬性較好。根據(jù)三種因單糖總量單糖總量B:B:溫度A:時(shí)A:時(shí)單糖總量單糖總量C:料液比A:時(shí)單糖總量單糖總量C:料液比C:料液比B:溫通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳提取條件為提取時(shí)間4.94比1：58.8（g/mL）。為了驗(yàn)證工藝參數(shù)的可靠性，結(jié)合實(shí)際操作的藝參數(shù)調(diào)整為提取時(shí)間5h、提取溫度92℃、液料比1：59（g/mL采取3組試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，多糖提取率19.15%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相近，誤差為0.52%，說(shuō)明程具有良好的預(yù)測(cè)性，其優(yōu)選出的最佳提取個(gè)因素為響應(yīng)因子建立正交實(shí)驗(yàn)，單糖總量為衡量指標(biāo)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適宜濃度，采色譜分析，以單糖總量為衡量指標(biāo)。結(jié)果見圖1是酸溶劑中單糖組成最多，且單糖總量最高，因此，選擇三氟乙酸為酸水解最佳溶劑。超過(guò)2mol/L，單糖總量出現(xiàn)了平緩下降情況。TFA濃度過(guò)低，多糖水解不完全，只能水過(guò)2mol/L后部分單糖開始分解，以至于單糖總量有所下降。故選擇2mol2.0、2.5mL的2mol/LTFA溶液，于110℃條件下水解2h，反應(yīng)結(jié)加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適宜濃度，采用離子色實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由圖17可知，當(dāng)TFA用量為0.5~糖總量出現(xiàn)了降趨勢(shì)。這是TFA用量過(guò)低時(shí)，多糖水解還不夠完全溶液。取0.5mL多糖溶液于螺紋管中，加入2mol/LTFA溶液1.0m度較高會(huì)使多糖碳化，出現(xiàn)分解不利于水解反應(yīng)。因此，選擇110℃為最佳水解溫度。下水解0.5、1、2、3、4h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮解，稀釋至適宜濃度，采用離子色譜分析，以單糖總量為衡量解2h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹分別氮吹1、2、3次，用超解，稀釋至適宜濃度，采用離子色譜分析，以單糖總量為衡量A/(mol/L)123BCD111112122231333421235223162312731328321393321R為C＞D＞A＞B，即水解溫度對(duì)單糖總量的影響最大，水解時(shí)間和T水解溫度110℃、水解時(shí)間3h。對(duì)最佳組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，在此單糖總量8123456葡萄糖、木糖、甘露糖的峰面積RSD分別為1.88、2液，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。進(jìn)樣量10μL，按照色譜條加入量/μg檢測(cè)量/μg131313加入量/μg檢測(cè)量/μg1231231高23加入量/μg檢測(cè)量/μg131313加入量/μg檢測(cè)量/μg123123123中中高加入量/μg檢測(cè)量/μg131313本標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)內(nèi)硫酸-苯酚法及衍生化方法進(jìn)行五、主要試驗(yàn)(或驗(yàn)證)的分析、綜述報(bào)告耳中銀耳多糖含量，使其更好地應(yīng)用于生活和生產(chǎn)無(wú)十、貫徹該標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議(包括組織措施、技術(shù)措施、過(guò)渡辦法等內(nèi)容)。無(wú)[11]HANCK,CHIANGHC,LanticanceractivitiesindifferentstrainsofTremellafuciformisBAmericanJournalofChineseMedicine,015,43(8):1637-16ctsofex