尖孢鐮刀菌生長特性的研究

PAGEPAGE4中國農(nóng)學通報尖孢鐮刀菌生長特性的研究朱育菁，肖榮鳳，蘇明星，黃曉蕓，劉波，藍江林基金項目：基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2006AA10A211）；福建省自然科學基金(2006J0068)；福建省發(fā)改委重點項目(閩發(fā)改投資[2006]781號)，福建省科技廳閩寧合作項目（2004Y034）。第一作者簡介：朱育菁，女，1972年出生，福建省福州市人，副研究員，博士。從事植物病蟲害生物防治研究。*通訊作者：藍江林，女，1972年出生，副研究員，博士，通訊地址：福建省福州市五四路247號，350003。E-mail:laeptb@163.com收稿日期：2006-4-20，修回日期：（福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，福州350003）摘要：【研究目的】研究尖孢鐮刀菌的生長特性，尋找培養(yǎng)過程的異質(zhì)性指標?！痉椒ā抗┰嚲隇辄S瓜尖孢鐮刀菌F-H.6.5-030318-J2和花生尖孢鐮刀菌F-P.5.0-030710，培養(yǎng)基采用PSA培養(yǎng)基，裝液量為100ml/250ml，接菌量從培養(yǎng)7d的平板上打取3個6mm的菌片，培養(yǎng)溫度為25±1℃，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，培養(yǎng)10d，觀察測定發(fā)酵液顏色、OD值、pH值、菌絲干重變化，并利用聚類分析方法劃分生長階段?！窘Y(jié)果】在培養(yǎng)過程中，尖孢鐮刀菌發(fā)酵液的顏色、OD值、pH值和菌絲干重都會隨著培養(yǎng)時間而變化。在相同的培養(yǎng)條件下，來源于不同寄主的尖孢鐮刀菌菌株之間在顏色和OD值變化存在著顯著性差異，而pH值和菌絲干重變化未表現(xiàn)出顯著性差異。來自黃瓜和花生的尖孢鐮刀菌菌株的生長分為3個階段：1～2d為適應階段，3～5d為對數(shù)生長階段，6～10d為穩(wěn)定階段?！窘Y(jié)論】尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過程的色素變異和OD值的變化可作為菌株培養(yǎng)的表征性特征。關鍵詞：尖孢鐮刀菌；生長特性中圖分類號：文獻標識碼：AStudyonGrowthCharacteristicsofFusariumoxysporumSchl.ZhuYujing,XiaoRongfeng,SuMingxing,HuangXiaoyun,LiuBo,LanJianglin(InstituteofBiotechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou350003，China)Abstract：[OBJECT]tostudythegrowthcharacteristicsofFusariumoxysporumSchl.andfindoutthedifferenceindexesduringtheculturalcourse.[METHOD]F.oxysporumisolateF-H.6.5-030318-J2fromcucumberandF-P.5.0-030710frompeanutwereselected.Thestandardculturalconditionsweresetasfollow:theculturemediawerePSA,theliquidvolumesforculturingwere100ml/250/ml,inoculationamountoffungiwere3×6mmfungualpatchescuttedfromthesolidculturalmediawherethefungushadgrowedfor7days,thetemperaturewas25±1℃,therotatespeedwas110r/min.Theculturesofthefungiwereconductedfor10days.Thecolors,ODvaluesandpHvaluesofthefermentationliquidwereobserved,aswellasthedryweightsofmechlialofthefungiweredetectedateachday.Finally,theclusteranalysiswasusedtodividethegrowthphasesofF.oxysporum.[RESULTS]Duringtheculturalcourse,allofthecolor,ODvalue,pHvalueandthedryweightsofmechlialofF.oxysporumchangedasthetimeextended.Underthesameculturalcondition,theF.oxysporumfromdifferenthostshowedsignificantdifferencesonthechangesofcolorsandODvalues,whilenosignificantdifferencewasfoundonthechangesofpHvaluesanddryweightofmechlial.ThegrowthesofthetwoisolatesofF.oxysporumfromcucumberandpeanetcouldbedividedinto3phases:1-2daysasadaptionphase,3-5daysaslogarithmicgrowthphaseand6-10daysasstabilizationphase.[CONCLUSION]ThechangesofcolorandODvalueduringtheculturalcoursecouldbeusedassignificantcharacteristicsforF.oxysporum.Keywords:Fusariumoxysporum,Growthcharacteristic植物枯萎病是由鐮刀菌寄生引起的一種世界性的真菌土傳病害，其主要致病菌是尖孢鐮刀菌（FusariumoxysporumSchl.），原菌從根部為害植物，引起維管束病害，造成植株枯死，在植株的全生育期均可發(fā)生[1]。以瓜類枯萎病為例，病田一般減產(chǎn)20～30％、嚴重田塊可達50～60％，甚至絕產(chǎn)[2]。目前，在世界范圍已報道的被嚴重為害的經(jīng)濟作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黃瓜、節(jié)瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜、絲瓜、白瓜(越瓜)、苦瓜、葫蘆瓜、哈密瓜、四季豆、豇豆等[3-4]。尖孢鐮刀菌是一類既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的兼性寄生真菌[5]。和其它植物病原菌一樣，存在著種下分化，可侵染許多植物寄主，具有多種?；?。不同?；驮诓煌貐^(qū)的分布又有所不同，這種差異反應了尖孢鐮刀菌對生長環(huán)境的選擇，表現(xiàn)在其對不同環(huán)境利用的生長特性上[6-7]。對尖孢鐮刀菌的生長特性的研究，將有助于了解其培養(yǎng)特性的差異，尋找培養(yǎng)過程的異質(zhì)性指標，為研究尖孢鐮刀菌的致病機理提供相關依據(jù)[8]。尖孢鐮刀菌在特定的培養(yǎng)條件下，生長過程發(fā)酵液的OD值、pH值、菌絲干重等變化，都反應了尖孢鐮刀菌的生長特性。本研究選擇黃瓜和花生上分離的尖孢鐮刀菌，研究了其生長特性。1材料與方法1.1試驗時間、地點試驗于在2003年在福建省農(nóng)科院生物技術研究所進行。1.2試驗材料供試菌株及來源見表1。培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基。表1供試尖孢鐮刀菌的來源菌種名稱寄主植物采集地點F-H.6.5-030318-J2黃瓜漳州詔安F-P.5.0-030710花生泉州鯉城1.3試驗方法尖孢鐮刀菌的標準培養(yǎng)程序為：將尖孢鐮刀菌在PDA平板上培養(yǎng)至7d，從平板上打取3個6mm的菌片，置于盛有100mlPSA液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，每天取3瓶，過濾去除菌絲，收集發(fā)酵液。觀察測定指標：1）觀察尖孢鐮刀菌生長過程發(fā)酵液顏色的變化；2）測定尖孢鐮刀菌生長過程OD650值的變化，將發(fā)酵液在8000r/min條件下離心20min，取上清液，采用島津Spectrumlab22PC分光光度計測定OD650值；3）測定尖孢鐮刀菌生長過程pH值的變化；4）測定尖孢鐮刀菌生長過程菌絲干重的變化，收集菌絲，將菌絲烘干至恒重，稱其重量。分析尖孢鐮刀菌的生長特性。為分析尖孢鐮刀菌的生長階段，以尖孢鐮刀菌培養(yǎng)時間為樣本，以菌株F-H.6.5-030318-J2和F-P.5.0-030710的OD值、pH值、菌絲干重為指標，構建矩陣。以歐氏距離為相關尺度，用類平均法進行聚類分析。1.3統(tǒng)計分析采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件[9]進行數(shù)據(jù)方差分析。2結(jié)果與分析2.1尖孢鐮刀菌生長過程發(fā)酵液顏色的變化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同寄主的尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過程顏色不同；同一尖孢鐮刀菌生長過程發(fā)酵液顏色會發(fā)生階段性變化。在發(fā)酵初期（1～3d），黃瓜尖孢鐮刀菌F-H.6.5-030318-J2和花生尖孢鐮刀菌F-P.5.0-030710的發(fā)酵液顏色與培養(yǎng)基配置時的顏色相同，沒有明顯的變化。在發(fā)酵中期（4～6d），兩個菌種發(fā)酵液的顏色發(fā)生明顯變化，菌株F-H.6.5-030318-J2發(fā)酵液在4d時變?yōu)槟厅S色，在6d時顏色加深，轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色；而菌株F-P.5.0-030710發(fā)酵液在4d時則變?yōu)榈仙?，?d時顏色加深轉(zhuǎn)變?yōu)楹肿仙Ｔ诎l(fā)酵后期(7d以后)，兩株菌保持在發(fā)酵6d時的顏色，沒有明顯變化。2.2尖孢鐮刀菌生長過程OD值的變化試驗結(jié)果見圖1。尖孢鐮刀菌培養(yǎng)過程OD值的總體變化趨勢都是隨著培養(yǎng)發(fā)酵時間的延長而增高，不同菌種表現(xiàn)出顯著性差異；在發(fā)酵中期出現(xiàn)最高峰值，但是不同的菌株出現(xiàn)峰值的時間不同。黃瓜尖孢鐮刀菌F-H.6.5-030318-J2和花生尖孢鐮刀菌F-P.5.0-030710分別在第3d和第5d達到最高值0.0845和0.1195，而后下降后趨于平緩。2.3尖孢鐮刀菌生長過程pH值的變化試驗結(jié)果見圖2。尖孢鐮刀菌生長過程，pH值逐漸增高，從初期的6.20～6.30逐漸升高為后期的8.40～8.45，不同的菌株在培養(yǎng)過程的pH變化無顯著性差異。從測定的結(jié)果可以看出，兩種尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過程中pH值的變化趨勢基本相同，培養(yǎng)初期（1～3d）pH在6.20～6.75之間；培養(yǎng)中期（4～6d），pH在6.75～8.15之間，此時pH值上升最快；培養(yǎng)后期（7～10d），pH在8.20～8.45之間，變化最小。在培養(yǎng)的第2d的pH值有所下降，黃瓜尖孢鐮刀菌F-H.6.5-030318-J2的pH值為5.70，而花生尖孢鐮刀菌F-P.5.0-030710的pH值為6.05，均比發(fā)酵第1d的pH值低，而后隨著培養(yǎng)進程，pH值逐漸上升，但其中略有波動，從培養(yǎng)的第6d開始，兩個菌株的pH值的變化趨于平緩，在pH8.00～8.50之間達到一個平衡狀態(tài)。aba圖1尖孢鐮刀菌培養(yǎng)過程中OD650值的變化aba*曲線旁邊的不同數(shù)字表示在P<0.05水平下有顯著性差異。aaaaaa圖2尖孢鐮刀菌培養(yǎng)過程中pH值的變化*曲線旁邊的相同數(shù)字表示在P<0.05水平下無顯著性差異。2.4尖孢鐮刀菌生長過程菌絲干重的變化試驗結(jié)果見圖3。尖孢鐮刀菌培養(yǎng)過程，菌絲干重逐漸增加，增加量最大的時間是2-4d；不同菌株的菌絲干重變化無顯著性差異。黃瓜尖孢鐮刀菌F-H.6.5-030318-J2和花生尖孢鐮刀菌F-P.5.0-030710培養(yǎng)過程中菌絲干重的變化趨勢基本相同，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲干重逐漸增加，兩個菌株在培養(yǎng)到第8d時，菌絲干重達到最大值，隨后的變化趨于平緩。在同等條件下，花生上分離的F-P.5.0-030710151菌株的生長速度高于后者，培養(yǎng)到第3d后，花生上分離的F-P.5.0-030710151菌株的菌絲干重為520mg/100ml，比黃瓜上分離的F-H.6.5-030318-J2菌株高36.84%。適應期對數(shù)期穩(wěn)定期aaaλ=277.22圖3尖孢鐮刀菌適應期對數(shù)期穩(wěn)定期aaaλ=277.22*曲線旁邊的相同數(shù)字表示在P<0.05水平下無顯著性差異。λ=277.22歐氏距離λ=277.22歐氏距離圖4尖孢鐮刀菌生長階段的聚類分析2.5尖孢鐮刀菌生長階段聚類分析聚類結(jié)果見圖4。分析結(jié)果表明，可將尖孢鐮刀菌的生長劃分為3個階段，第1階段為適應期，培養(yǎng)時間為1～2d，菌株的OD值、pH值、菌絲干重變化較小，菌株生長處于適應階段。第2階段為對數(shù)期，培養(yǎng)時間為3～5d，菌株的OD值、pH值、菌絲干重變化最大，菌株處于對數(shù)生長階段。第3階段為穩(wěn)定期，培養(yǎng)時間為6-10d，菌株的OD值、pH值、菌絲干重變化平緩，菌株生長處于穩(wěn)定階段。3討論與小結(jié)尖孢鐮刀菌病菌生理小種的鑒定和寄主品種抗病性的研究都需要進行人工培養(yǎng)該菌，以獲得大量分生孢子，因此，很有必要對影響尖孢鐮刀菌最佳生長和產(chǎn)孢因素等生長特性作進一步探索性研究[10]。藍江林等（2003）研究了溫度對幾種作物尖孢鐮刀菌菌株生長的影響[11]；馬國斌等（1996）探討了培養(yǎng)條件對西瓜枯萎病菌鐮刀菌酸產(chǎn)生的影響[12]；朱育菁等（2004）則進行了通氣量對西瓜枯萎病病原尖鐮刀菌生長的影響[13]；燕嗣皇等（2001）研究了三唑酮對西瓜根際木霉菌與尖孢鐮刀菌競爭定殖的影響[14]。鄭肖蘭等（2006）年報道了尖孢鐮刀菌西瓜?；途甑纳飳W特性[10]。本研究的試驗結(jié)果表明：尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液的顏色、OD值、pH值和菌絲干重都會隨著培養(yǎng)時間而變化。在相同的培養(yǎng)條件下，來源于不同寄主的尖孢鐮刀菌菌株之間在顏色和OD值存在著顯著性差異，而pH值和菌絲干重變化未表現(xiàn)出顯著性差異。尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)過程色素變異和OD值的變化，與其生理特性有關，因此可作為菌株培養(yǎng)的表征性特征。這些性狀的變化與尖孢鐮刀菌的萌發(fā)、侵染以及傳播等生物學特性之間的關系有待于進一步的研究。藍江林等（2004）報道當將來自甜瓜、西瓜、網(wǎng)紋甜瓜、黃瓜、甜椒、花生、豇豆和辣椒8種寄主植物的尖孢鐮刀菌在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，在25±1℃的條件下，菌株的生長過程分3個階段:0～24h為生長初期，菌株的生長速度緩慢；24～72h為生長中期，菌落直徑迅速擴大；72～120h為生長后期，菌株的生長速度變慢[11]。本研究采用PSA液體培養(yǎng)基，在25±1℃的條件下，來自黃瓜和花生的兩個尖孢鐮刀菌菌株的生長也同樣分為3個階段：1～2d為適應階段，菌株的OD值、pH值、菌絲干重變化較?。?～5d為對數(shù)生長階段，菌株的OD值、pH值、菌絲干重變化最大；6～10d為穩(wěn)定階段，菌株的OD值、pH值、菌絲干重變化平緩。因此在進行尖孢鐮刀菌的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，需注意在對數(shù)生長階段的營養(yǎng)供給和培養(yǎng)條件的控制。參考文獻郝曉娟，劉波，謝關林．植物枯萎病生物防治研究進展[J]．中國農(nóng)學通報，2005，21(7)：319-322，337．高軍，高增貴，趙世波，等．甜瓜枯萎病菌的抗藥性及致病力測定[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006(4)：39-40．林抗美，車建美，劉波，等．不同寄主尖孢鐮刀菌培養(yǎng)濾液對黃瓜胚根萌發(fā)的影響[J]．中國農(nóng)學通報，2006，22(1)：246-248