蛋白免疫快速診斷應(yīng)用技術(shù)

關(guān)于蛋白免疫快速診斷應(yīng)用技術(shù)交流提綱

前言一）、免疫檢測(cè)基礎(chǔ)知識(shí)及免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述二）、快速免疫檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀和前景展望三）、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用介紹四）、思考——

胸懷大志，放眼世界，立志細(xì)節(jié)第2頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月前言：1、個(gè)人所從事的行業(yè)和專業(yè)的限制1）醫(yī)學(xué)專業(yè)、生物專業(yè)、化學(xué)專業(yè)（人）2）臨床免疫類檢驗(yàn)試劑（人用）的開(kāi)發(fā)3）對(duì)客戶/臨床需求有所了解2、有可能找到的共同點(diǎn)1）所采用技術(shù)方法具有共同點(diǎn)2）為了共同的目標(biāo)——為人類健康服務(wù)第3頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月一、免疫檢測(cè)基礎(chǔ)知識(shí)及免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫學(xué)技術(shù)的范疇1、對(duì)具有免疫活性物質(zhì)的定性、定量測(cè)定2、對(duì)免疫系統(tǒng)的組成成分的數(shù)量、狀態(tài)的測(cè)定第4頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月一、免疫檢測(cè)基礎(chǔ)知識(shí)及免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用特點(diǎn)1、對(duì)象——“包羅萬(wàn)象”2、方法——“兼容并蓄”第5頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月一、免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述

抗原的概念與屬性1、免疫原性——可識(shí)別、可反應(yīng)性（誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性）2、免疫反應(yīng)性

——選擇結(jié)合性（和免疫應(yīng)答產(chǎn)物特異性結(jié)合的特性）第6頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月一、免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述

抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1、特異性2、可逆性3、適合比例性第7頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月一、免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1、Specificity（特異）2、Sensitivity（敏感）3、Simplicity（簡(jiǎn)便）4、Safety（安全）5、Saving（節(jié)約）第8頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月一、免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展1、經(jīng)典的免疫分析技術(shù)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、溶血反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：成本低、技術(shù)簡(jiǎn)單、結(jié)果易于判斷，但不易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。2、現(xiàn)代的免疫分析技術(shù)熒光免疫標(biāo)記、放射性免疫標(biāo)記、酶免疫標(biāo)記、鑭系（稀土）元素免疫標(biāo)記、膠體顆粒標(biāo)記、臨床化學(xué)免疫分析技術(shù)、發(fā)光免疫標(biāo)記、流式免疫微球技術(shù)及生物傳感器技術(shù)等。特點(diǎn)：靈敏、特異、快速、易于測(cè)定及實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。第9頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT概念的引入POCT——PointofCareTesting不需要固定的場(chǎng)地、不需要太多的時(shí)間、也不需要特定的地方、在沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的條件下也能完成檢測(cè)。檢測(cè)可在患者身邊或者靠近患者的地方完成。Testsdesginedtobeatornearthesitewherethepatientislocated,thatdonotrequirepermanentspace,andthatareperformedoutsidethephysicalfacilitiesoftheclinicallaboratory.(美國(guó)病理家學(xué)會(huì)CollegeofAmericanPathologists）

第10頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT技術(shù)已使用了上千年1、約公元前1500年法老的私人醫(yī)生注意到有些人的尿液吸引了很多螞蟻，而另一些人的尿液則沒(méi)有。2、后來(lái)發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與尿液中的葡萄糖濃度有關(guān)第11頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)美國(guó)FDA對(duì)簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)的定義1988年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室改良法案：臨床豁免權(quán)1、全自動(dòng)化儀器直接使用未處理過(guò)的標(biāo)本/毛細(xì)管血（指尖血）、鼻拭子或尿液；2、對(duì)標(biāo)本只需進(jìn)行基本的、無(wú)技術(shù)要求的處理，包括去污；3、對(duì)試劑只需要進(jìn)行基本的、無(wú)技術(shù)要求的處理，例如，將試劑A和試劑B混勻4、分析步驟不需要操作者干預(yù)5、不需要技巧或?qū)ｉT知識(shí)第12頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)美國(guó)FDA對(duì)簡(jiǎn)便實(shí)驗(yàn)的定義6、無(wú)需電子或機(jī)械設(shè)備保養(yǎng)7、所得結(jié)果不需要操作者校準(zhǔn)、解釋和計(jì)算8、結(jié)果易讀，例如陽(yáng)性或陰性，直接讀出數(shù)值，線條很明顯或無(wú)線條存在，即等級(jí)明顯9、試驗(yàn)性能可與可溯源的參考方法相比較10、有用戶可看懂的快速參考指南

/cdrh/ovid/guidance/1171.pdf第13頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT的術(shù)語(yǔ)1、護(hù)理點(diǎn)/床邊/即時(shí)檢驗(yàn)（PointofCareTesting)2、近患者檢驗(yàn)(NearPatientTesting)3、醫(yī)務(wù)室檢驗(yàn)(PhysiciansOfficeTesting)4、床邊檢驗(yàn)(BesideTesting)5、實(shí)驗(yàn)室外檢驗(yàn)(Extra-laboratoryTesting)6、分散檢驗(yàn)(DecentralizedTesting)7、機(jī)構(gòu)外檢驗(yàn)(OffsiteTesting)8、輔助檢驗(yàn)(AncillaryTesting)9、替換點(diǎn)檢驗(yàn)(AlternativeSiteTesting)第14頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)看看發(fā)生了什么變化？不需要專業(yè)的操作者需要專業(yè)的操作者不需要專業(yè)的裝置需要專業(yè)的裝置第15頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT產(chǎn)品都在哪里應(yīng)用日間病房救護(hù)車醫(yī)生研究室血庫(kù)社區(qū)衛(wèi)生診所環(huán)境實(shí)驗(yàn)室健康義診家庭康復(fù)機(jī)構(gòu)消防隊(duì)康復(fù)中心第16頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)為什么要推動(dòng)POCT產(chǎn)品？護(hù)理過(guò)程最佳化病人護(hù)理產(chǎn)出災(zāi)難救助測(cè)試平臺(tái)法規(guī)要求工業(yè)吸引力勞動(dòng)力問(wèn)題第17頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)操作人員不需要技術(shù)背景周轉(zhuǎn)時(shí)間的改善提高了治療的忠誠(chéng)度檢測(cè)越好，做的越頻繁樣品量少經(jīng)濟(jì)利益減少住院天數(shù)減少并發(fā)癥第18頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)：周轉(zhuǎn)時(shí)間摘自Price,BMJ2001的文章試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室POCT分鐘（變化%）尿液分析404-36（90）妊娠785-71（94）葡萄糖106-4（60）第19頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT產(chǎn)品的缺陷操作者無(wú)技術(shù)背景結(jié)果質(zhì)量差，與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果有一定差異不經(jīng)濟(jì)資料不便記錄第20頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)當(dāng)前POCT的應(yīng)用（1）1、乳膠凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為10-15分鐘快速、基本不需要儀器試劑可以冷凍敏感性差8-10%的反應(yīng)結(jié)果不好解釋2、直接熒光抗體試驗(yàn)30-60分鐘，需要多個(gè)步驟需要有昂貴的熒光顯微鏡及熟練的操作人員第21頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)當(dāng)前POCT的應(yīng)用（2）3、FISH(熒光原位雜交）需要一段已知的DNA序列需要一臺(tái)熒光顯微鏡，且有熟練顯微鏡操作的人員步驟多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1-2小時(shí)4、免疫層析（滲濾）試驗(yàn)敏感性高、特異性強(qiáng)總實(shí)驗(yàn)時(shí)間5-15分鐘不需要儀器、也不需要基本的培訓(xùn)樣品不需要特殊處理免疫層析（滲濾）產(chǎn)品是繼尿試紙條和血糖試條之后，當(dāng)前最為受歡迎的POCT產(chǎn)品第22頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)免疫滲濾試驗(yàn)主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測(cè)抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。A：金標(biāo)記抗體B：標(biāo)本中的抗原C：包被抗體D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒第23頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)免疫層析試驗(yàn)免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流（lateralflow）)向另一端移動(dòng)。移動(dòng)過(guò)程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無(wú)關(guān)物質(zhì)則越過(guò)該區(qū)域而被分離，然后通過(guò)標(biāo)記物顯色來(lái)判定試驗(yàn)結(jié)果，以膠體金為標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)稱為膠體金免疫層析試驗(yàn)。第24頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月二、快速免疫檢測(cè)技術(shù)的過(guò)去、現(xiàn)狀和未來(lái)POCT的未來(lái)？？？？微流體技術(shù)？納米技術(shù)？第25頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹能用來(lái)做什么傳染病抗原或抗體測(cè)定腫瘤標(biāo)志物測(cè)定激素測(cè)定農(nóng)藥殘留測(cè)定抗生素測(cè)定毒素測(cè)定藥物濫用（毒品）測(cè)定第26頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹針對(duì)檢驗(yàn)、我們能做什么傳染病抗原或抗體測(cè)定腫瘤標(biāo)志物測(cè)定？？？？激素測(cè)定農(nóng)藥殘留測(cè)定抗生素測(cè)定毒素測(cè)定藥物濫用（毒品）測(cè)定立足需求，充分考慮和整合各種優(yōu)勢(shì)資源！第27頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹我們要怎么去做調(diào)研：我們要做采用什么平臺(tái)技術(shù)平臺(tái)建設(shè)：我們建立快速免疫層析技術(shù)平臺(tái)項(xiàng)目：我們要做什么項(xiàng)目？準(zhǔn)備：我們擁有了哪些資源，我們還缺少什么資源？第28頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹免疫層析技術(shù)平臺(tái)硬件：實(shí)驗(yàn)室；設(shè)備；生產(chǎn)車間？軟件：SOP?人員：專業(yè)培訓(xùn)、團(tuán)隊(duì)建設(shè)第29頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹如何去開(kāi)發(fā)一個(gè)膠體金層析產(chǎn)品

——以尿妊娠試紙（HCG)為例第30頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)的反應(yīng)原理圖雙抗體夾心法第31頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)的產(chǎn)品研發(fā)準(zhǔn)備1、生物材料的準(zhǔn)備：配對(duì)的單克隆抗體（特異性針對(duì)HCG-α,β亞基)二抗2、主要生產(chǎn)材料硝酸纖維素膜（特定孔徑、流速）樣品墊結(jié)合墊吸收墊（吸水紙）、片材（PVC襯板）等第32頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)的研發(fā)準(zhǔn)備3、主要設(shè)備點(diǎn)膜儀噴金儀干燥設(shè)備粘帖裝置切刀第33頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制1、特異性的單克隆抗體親和力特異性穩(wěn)定性第34頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制2、標(biāo)記物與蛋白偶聯(lián)顆粒大小顆粒的均一性顆粒的形狀標(biāo)記物與蛋白的最佳比例標(biāo)記影響影響因素考慮第35頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制蛋白與膠體金的偶聯(lián)：最佳pH測(cè)定：取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10；加入過(guò)量待標(biāo)記蛋白；取96孔培養(yǎng)板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100μl加入孔中，重復(fù)三次；每孔分別加入20μl濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH第36頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制蛋白與標(biāo)記物的偶聯(lián)：最佳偶聯(lián)比例確定：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml10%氯化鈉。第37頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制3、樣品墊

玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無(wú)紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。樣品墊的作用：減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布；去除樣品中雜質(zhì)顆粒；調(diào)節(jié)樣品等。樣本墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗(yàn)的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹?、粘性增強(qiáng)劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復(fù)雜辨識(shí)劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測(cè)一步完成。第38頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制4、結(jié)合墊玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無(wú)紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為：

-吸附一定量的標(biāo)結(jié)合物顆粒；

-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；

-保持標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；

-保證標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。第39頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制5、硝酸纖維素膜(Nitrocellulose)：推薦使用Millipore，S&S等國(guó)外公司的硝酸纖維素膜。

NC膜的作用：-在檢測(cè)線和對(duì)照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動(dòng)并與試劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)；

-反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測(cè)結(jié)果

NC膜的重要參數(shù)：孔徑、對(duì)稱性、層析速度、蛋白結(jié)合力、強(qiáng)度、表面質(zhì)量、厚度、批間均一性等。第40頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制5、硝酸纖維膜硝酸纖維膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(μm和s)μm:指的是膜孔徑，此說(shuō)法實(shí)際上是沿用了一直以來(lái)的一個(gè)形象稱呼。

s:以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時(shí)間是**s.

換算情況大致為：8μm=135s；6μm=180s不同秒數(shù)的膜對(duì)反應(yīng)的影響通過(guò)速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時(shí)還有一個(gè)問(wèn)題是，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。

135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競(jìng)爭(zhēng)法.

第41頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制5、硝酸纖維膜如何選擇物理性能膜的物理性能主要是2個(gè)參數(shù)，膜厚度和寬度厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴(kuò)散性能，點(diǎn)出來(lái)的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速；寬度(檢測(cè)區(qū)的長(zhǎng)度)和爬速及靈敏度的關(guān)系跑水性能注入足夠溶液到槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標(biāo)記（總長(zhǎng)大于4cm）并放到傾斜支架，整個(gè)支架下端放入溶液槽，膜開(kāi)始吸液，計(jì)時(shí)。記錄每個(gè)標(biāo)記處的通過(guò)時(shí)刻，并與對(duì)照組比較。跑板時(shí)，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測(cè)是否有波浪傾斜或包圍潤(rùn)濕等反常現(xiàn)象。點(diǎn)樣測(cè)試

C/T線出線時(shí)間和靈敏度

第42頁(yè),共51頁(yè)，星期六，2024年，5月三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料