AbMole 新型環(huán)狀RNA circCGNL1在胰腺癌進(jìn)展中的作用及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

AbMole|新型環(huán)狀RNAcircCGNL1在胰腺癌進(jìn)展中的作用及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究胰腺癌（PancreaticCancer,PC）是一種高度惡性的腫瘤，具有低生存率和高死亡率的特點(diǎn)。由于缺乏有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，胰腺癌的治療一直面臨巨大挑戰(zhàn)。近年來(lái)，環(huán)狀RNA（circRNA）在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關(guān)注。由中國(guó)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胰腺中心普外科的HaoYuan,ChuangChen,HaonanLi等人發(fā)表了名為《RoleofanovelcircRNA-CGNL1inregulatingpancreaticcancerprogressionviaNUDT4–HDAC4–RUNX2–GAMT-mediatedapoptosis》的文章，本文主要描述了一項(xiàng)關(guān)于新型環(huán)狀RNAcircCGNL1（hsa_circ_0035435）在胰腺癌中的功能及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果。其中使用了AbMole的CCK-8（M4839）產(chǎn)品。首先，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了circCGNL1在胰腺癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常胰腺細(xì)胞和組織相比，circCGNL1在胰腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)提示circCGNL1可能在胰腺癌中發(fā)揮抑癌作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circCGNL1的穩(wěn)定性，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了RNaseR和放線菌素D處理實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，circCGNL1能夠抵抗這兩種酶的降解，顯示出比線性CGNL1更高的穩(wěn)定性。這一特性為circCGNL1作為潛在生物標(biāo)志物的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。圖1PC細(xì)胞和組織中circCGNL1的鑒定和特性。為了明確circCGNL1在胰腺癌細(xì)胞中的功能，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了一系列功能實(shí)驗(yàn)。首先，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和BxPC-3中過(guò)表達(dá)circCGNL1，并通過(guò)CCK-8和EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，circCGNL1過(guò)表達(dá)顯著抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖。接著，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)TUNEL、DAPI染色、流式細(xì)胞術(shù)和透射電鏡等多種方法檢測(cè)了circCGNL1對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，circCGNL1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的凋亡，表現(xiàn)為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例增加、DAPI染色下細(xì)胞核形態(tài)改變以及透射電鏡下凋亡小體的形成。圖2circCGNL1抑制PC細(xì)胞增殖，促進(jìn)PC細(xì)胞凋亡。為了揭示circCGNL1發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了RNApulldown和質(zhì)譜分析，鑒定出與circCGNL1相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，磷酸酶NUDT4是circCGNL1的一個(gè)重要結(jié)合蛋白。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，circCGNL1與NUDT4的Nudix水解酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，且這種結(jié)合不依賴于miRNA海綿作用。圖3circCGNL1與PC細(xì)胞中的NUDT4蛋白發(fā)生物理相互作用。NUDT4作為一種磷酸酶，能夠調(diào)控其下游靶蛋白的磷酸化狀態(tài)。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)Co-IP和GSTpulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NUDT4能夠促進(jìn)組蛋白去乙?；?（HDAC4）在Ser632位點(diǎn)的去磷酸化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，circCGNL1通過(guò)招募NUDT4增強(qiáng)了HDAC4的去磷酸化過(guò)程，并促進(jìn)了HDAC4的核轉(zhuǎn)位。這一發(fā)現(xiàn)揭示了circCGNL1通過(guò)NUDT4調(diào)控HDAC4定位的新機(jī)制。圖4NUDT4調(diào)節(jié)HDAC4蛋白的去磷酸化。核內(nèi)的HDAC4能夠介導(dǎo)RUNX2（RUNXFamilyTranscriptionFactor2）的去乙?；徒到?。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了HDAC4與RUNX2的相互作用，并發(fā)現(xiàn)circCGNL1過(guò)表達(dá)降低了RUNX2的乙酰化水平和表達(dá)量。進(jìn)一步分析表明，RUNX2作為轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到GAMT（guanidinoacetateN-methyltransferase）的啟動(dòng)子上抑制其表達(dá)。因此，circCGNL1通過(guò)HDAC4-RUNX2軸間接上調(diào)了GAMT的表達(dá)。圖5circCGNL1通過(guò)與NUDT4相互作用增強(qiáng)HDAC4去磷酸化。GAMT是一種在肌酸生物合成途徑中發(fā)揮重要作用的酶。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，GAMT在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著下調(diào)。通過(guò)過(guò)表達(dá)GAMT并檢測(cè)相關(guān)凋亡信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)GAMT能夠激活A(yù)MPK并抑制AKT和Bad的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。這一過(guò)程涉及caspase-3的切割和活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。圖6circCGNL1促進(jìn)HDAC4誘導(dǎo)的RUNX2去乙?；筒环€(wěn)定。為了在體內(nèi)驗(yàn)證circCGNL1的抑癌作用，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了circCGNL1過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并將其注射到裸鼠皮下進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，circCGNL1過(guò)表達(dá)顯著抑制了胰腺癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量的減小。進(jìn)一步通過(guò)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，circCGNL1過(guò)表達(dá)組中Ki67和PCNA（增殖細(xì)胞核抗原）的表達(dá)降低，而cleavedcaspase-3的表達(dá)增加。這些結(jié)果證實(shí)了circCGNL1在體內(nèi)的抑癌作用。圖7RUNX2轉(zhuǎn)錄抑制GAMT表達(dá)。最后，研究團(tuán)隊(duì)收集了胰腺癌患者的臨床樣本，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了circCGNL1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，circCGNL1低表達(dá)的患者預(yù)后較差。進(jìn)一步通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，circCGNL1是胰腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素之一。這一發(fā)現(xiàn)為circCGNL1作為胰腺癌預(yù)后標(biāo)志物提供了臨床證據(jù)。圖8circCGNL1在體內(nèi)抑制PC腫瘤生長(zhǎng)。綜上所述，本研究揭示了新型環(huán)狀RNA