細(xì)胞毒性試驗培訓(xùn)班用講義課件學(xué)習(xí)教案

會計學(xué)1細(xì)胞毒性試驗培訓(xùn)班用講義細(xì)胞毒性試驗的目的和意義（一）目的：評價醫(yī)療器械和材料致細(xì)胞毒性反應(yīng)的潛在性，并預(yù)測最終生物體應(yīng)用時的組織細(xì)胞反應(yīng)。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，可檢測供試品接觸細(xì)胞后細(xì)胞發(fā)生生長抑制、功能改變、溶解、死亡或其它毒性反應(yīng)。（二）意義：可在短期內(nèi)較經(jīng)濟(jì)、簡便地篩選出批量供試品的細(xì)胞毒性，它為體內(nèi)法（動物試驗）的進(jìn)行與否提供了先決條件，對新型醫(yī)療器械和生物材料的研制和應(yīng)用提供了重要保證。第1頁/共23頁國外標(biāo)準(zhǔn)簡介1979年，美國國家標(biāo)準(zhǔn)局和牙科協(xié)會（ANSI/ADA41-1979）首先發(fā)布“口腔材料生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)”，其中規(guī)定用51Cr標(biāo)記法檢測供試品的細(xì)胞毒性。1984年，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）頒布的ISO/TR7405:1984《牙科材料生物學(xué)評價》中推薦了瓊脂覆蓋、分子濾過和51Cr標(biāo)記三種試驗方法。1989年，ISO專門成立TC194技術(shù)委員會，制定了ISO10993《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》系列標(biāo)準(zhǔn)。在ISO10993-5：1992中，提出了三類細(xì)胞毒性試驗方法，即浸提液試驗、直接接觸試驗和間接接觸試驗。第2頁/共23頁國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)簡介1987年，衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS5-1-1987《醫(yī)用熱硫化甲基乙烯基硅橡膠》：瓊脂覆蓋法1996年，GB/T16175-1996《醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評價試驗方法》：細(xì)胞增殖度法1997年，衛(wèi)生部第81號文《生物材料和醫(yī)療器械生物學(xué)評價技術(shù)要求》：推薦了瓊脂覆蓋、分子濾過、細(xì)胞生長抑制三種方法。1997年，GB/T16886.5-1997等同采用國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993-5：1992第3頁/共23頁有幾類細(xì)胞毒性試驗方法？

GB/T16886.5－2003/ISO10993-5:1999中推薦了三類細(xì)胞毒性試驗：

1）浸提液試驗

2）直接接觸試驗

3）間接接觸試驗（包括瓊脂擴(kuò)散試驗、濾膜擴(kuò)散試驗）

第4頁/共23頁常用的細(xì)胞毒性試驗方法

1）浸提液試驗（四唑鹽（MTT）比色法或MTT法）：哺乳動物胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍(lán)紫色的物質(zhì)，用二甲基亞砜（DMSO）將其溶解成溶液，用酶標(biāo)儀測定其濃度，從而定量測定細(xì)胞的存活比例。該試驗用于細(xì)胞毒性細(xì)定量評價。對該試驗有干擾的供試品不適于本試驗。

2）間接接觸試驗：瓊脂擴(kuò)散法或瓊脂覆蓋法第5頁/共23頁哪些產(chǎn)品需要進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗？與人體接觸或植入體內(nèi)的醫(yī)療器械都需要進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗。接觸部位：

1）表面：皮膚、粘膜、損傷表面

2）外部接入：血路間接、組織/骨/牙、循環(huán)血液

3）體內(nèi)植入：組織/骨、血液第6頁/共23頁試驗材料：細(xì)胞系

推薦使用ATCCCCL1(NCTCclone929)[小鼠成纖維細(xì)胞]或ATCCCCL2(Hela)[人上皮細(xì)胞]。如能證明試驗的重現(xiàn)性和精確性，也可選用其他細(xì)胞系。優(yōu)先采用已建立的細(xì)胞系并應(yīng)從認(rèn)可的貯源獲取。試驗應(yīng)使用無支原體污染細(xì)胞。用選定的細(xì)胞系和培養(yǎng)基制備試驗所需的細(xì)胞。使用凍存細(xì)胞時,如加有細(xì)胞保護(hù)劑應(yīng)除去,使用前至少傳代培養(yǎng)一次。第7頁/共23頁細(xì)胞復(fù)蘇步驟1）準(zhǔn)備一杯40度的溫水。

2）將細(xì)胞從液氮罐中取出迅速放入溫水中，晃動使之溶解，注意過程控制在半分鐘內(nèi)。

3）離心，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，接種至新培養(yǎng)瓶中。第8頁/共23頁試驗材料：儀器

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、冰箱、倒置光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、蒸汽滅菌器、液氮瓶、抽濾瓶、電熱恒溫水浴鍋、96孔培養(yǎng)板、可調(diào)式微量加樣器、酶標(biāo)儀純水機(jī)、液氮罐、天平、離心機(jī)等。第9頁/共23頁試驗材料：耗材

培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、吸管、凍存管、離心管、濾器等。

與供試品接觸的所有器具置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃滅菌20分鐘。第10頁/共23頁試驗材料：試劑

培養(yǎng)基（MEM、DMEM、IMEM、RPMI1640等）、血清（小牛血清、新生牛血清、胎牛血清、馬血清等）、消化液、L-谷氨酰胺、抗生素液、NaHCO3溶液、二甲基亞砜、平衡鹽溶液。含血清或不含血清培養(yǎng)基應(yīng)符合選定細(xì)胞系的生長要求。注:培養(yǎng)基中允許含有對試驗無不利影響的抗生素。

第11頁/共23頁試驗材料：供試液與對照供試液：應(yīng)按產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定制備樣品浸提液。陰性對照：選用經(jīng)確認(rèn)過的不產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料，例如高密度聚乙烯。陽性對照：選用經(jīng)確認(rèn)過的可重現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)的材料，例如含有有機(jī)錫添加劑的聚氯乙烯。第12頁/共23頁試驗步驟:MTT法a)培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到其對數(shù)生長期末細(xì)胞趨于融合，用細(xì)胞消化液消化分散細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1×104個/mL的細(xì)胞懸液。取96孔培養(yǎng)板，每孔中加入100μL的細(xì)胞懸浮液。輕輕水平轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻地分散在皿孔的表面。b)置含5％二氧化碳的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi),在37℃±2℃溫度下培養(yǎng)24小時。第13頁/共23頁試驗步驟:MTT法c)棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100μL的空白對照液，陰性對照液，陽性對照液，100％和50％濃度的試驗樣品浸提液。每組至少設(shè)8孔。注：浸提原液或以培養(yǎng)基作稀釋劑的系列浸提稀釋液。采用0.9%氯化鈉注射液浸提時,建議在稀釋浸提液時使用濃縮的(如2倍或5倍)培養(yǎng)基。d)置含5％二氧化碳的二氧化碳培養(yǎng)箱,在7℃±2℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)間期可分為24h、48h、72h。第14頁/共23頁試驗步驟:MTT法e)每個培養(yǎng)間期后,每孔加入MTT溶液20μl，置含5％二氧化碳的二氧化碳培養(yǎng),在37℃±2℃溫度下培養(yǎng)5小時。f)棄去孔內(nèi)液體，每孔分別加入200μlDMSO，將培養(yǎng)板放置10分鐘，水平振搖使孔內(nèi)溶液顏色均勻。g)用酶標(biāo)儀測定吸光度，可采用雙波長測定，選用的波長可為570nm和630nm。第15頁/共23頁試驗步驟:MTT法h)結(jié)果計算：i)結(jié)果判斷：根據(jù)RGR值，判定試驗樣品的細(xì)胞毒性。陰性對照組反應(yīng)不大于1級。陽性對照組反應(yīng)至少為3級。陰性對照組和陽性對照組反應(yīng)不符合規(guī)定時應(yīng)重新試驗。

第16頁/共23頁試驗周期及費(fèi)用1）以MMT法為例：一般需要1－2周。注意：用選定的細(xì)胞系和培養(yǎng)基制備試驗所需的細(xì)胞。使用凍存細(xì)胞時,如加有細(xì)胞保護(hù)劑應(yīng)除去,使用前至少傳代培養(yǎng)一次。2）根據(jù)國家發(fā)展和改革委員會、財政部文件（發(fā)改價格[2003]213號），細(xì)胞毒性試驗的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)為2000元/項。第17頁/共23頁YZB標(biāo)準(zhǔn)中常見的問題不寫明采用什么方法進(jìn)行試驗。只寫無細(xì)胞毒性，無級別要求。無供試液的浸提條件。第18頁/共23頁試驗原則

體外細(xì)胞試驗方法較多，且各有其特點(diǎn)，各試驗方法之間很難達(dá)到完全一致。因此在選擇試驗方法時，須根據(jù)“最接近應(yīng)用狀況”的原則，盡可能合理地選擇供試品與細(xì)胞的接觸方式和檢測生物學(xué)終點(diǎn)評價方法。第19頁/共23頁有關(guān)法規(guī)

1，法規(guī)：醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例（國務(wù)院令第276號）

2，規(guī)章：醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督管理辦法（局令第12號）

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量體系考核辦法（局令第22號）

醫(yī)療器械分類規(guī)則（局令第15號）

3，規(guī)范性文件：關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械注冊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范的通知第20頁/共23頁有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)1，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

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0127.9口腔材料生物試驗方法：細(xì)胞毒性試驗（瓊脂覆蓋及分子濾過法）

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0268用于口腔的醫(yī)療器械生物相容性臨床前評價第1單元：評價與試驗項目選擇

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0325一次性使用無菌導(dǎo)尿管第21頁/共23頁有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)2，推薦性標(biāo)準(zhǔn)

GB/T16886.1醫(yī)療器械生物學(xué)評價第1部分：評