cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE培訓(xùn)課件

技術(shù)背景基本RACE原理和方法樣品要求RACE產(chǎn)物的鑒定和全長(zhǎng)cDNA

的獲得基本RACE原理8/23/20241cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE技術(shù)背景得到某基因的片段、全長(zhǎng)或近全長(zhǎng)cDNA的方法：建立和篩選cDNA和DNA文庫(kù)。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)序列標(biāo)簽(expresssequencetags,ESTs)拼接出全長(zhǎng)或近全長(zhǎng)cDNA。是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即PCR。cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)。用RNase保護(hù)、S1核酸酶譜和引物延伸等方法來(lái)保證mRMA5′末端的獲取，但又需要大量的mRNA。8/23/20242cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE基本RACE原理和方法利用Oligo(dT)對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的同時(shí)在兩頭加上通用接頭(引物)，從而可利用基因特異的引物

(genespecificprimer，GSP)

通過(guò)PCR反應(yīng)快速獲得目的序列的5′端和

3′端。8/23/20243cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACERACE流程8/23/20244cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE5′-RACE法

原理圖

（1）（2）（3）（4）RNaseH8/23/20245cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE樣品要求：

提取TotalRNA的材料要新鮮，采樣后立即放入液氮中速凍或加入樣品穩(wěn)定劑。

TotalRNA無(wú)降解，OD260/280=1.8~2.0。

提供盡量多的實(shí)驗(yàn)材料：3′RACETotalRNA＞15μg；5′RACETotalRNA＞25μg。如果基因的含量較低或者未知序列較長(zhǎng)，樣品量需相應(yīng)增加。8/23/20246cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACERACE產(chǎn)物的鑒定和全長(zhǎng)cDNA的獲得3′或5′雙鏈cDNA限制性內(nèi)切酶酶切Southernblot分析克隆3′和5′重疊序列的連接RACE產(chǎn)物的3′和5′末端序列的分析合成相應(yīng)引物PCR獲得全長(zhǎng)cDNA8/23/20247cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACESMARTRACEcDNAsynthesisKit8/23/20248cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACESMARTRACEcDNAsynthesisKit堿基互補(bǔ)配對(duì)原則AT之間形成兩個(gè)氫鍵GC之間形成三個(gè)氫鍵poly(C)替代poly(A)增加5′接頭與cDNA第一鏈的結(jié)合牢固性增加模板中有效雙鏈豐度提高目的基因獲取幾率8/23/20249cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACESMARTRACEcDNAsynthesisKit原理8/23/202410cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACEcDNA第一鏈的合成機(jī)制8/23/202411cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACESMARTerRACE流程

8/23/202412cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE5’RACE流程圖8/23/202413cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE3’RACE流程圖8/23/202414cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACEGSP與cDNA模板的關(guān)系GSP要求：23–28nt50–70%GCTm≥65℃；降落式（touchdown）PCR，Tm>70℃與通用引物的3’-末端不互補(bǔ)8/23/202415cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACEGSP與cDNA模板的關(guān)系GSP1：5’-RACEPCR的反義引物GSP2：3’-RACEPCR的正義引物合適的酶切位點(diǎn)100~200bp注意：GSP1與GSP2的Tm值要相似8/23/202416cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACEGSP與cDNA模板的關(guān)系NGSP：槽式（Nested）PCR引物8/23/202417cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE擴(kuò)增后的預(yù)期：8/23/202418cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE具體實(shí)驗(yàn)方法cDNA第一鏈的合成陽(yáng)性對(duì)照RACEPCR實(shí)驗(yàn)cDNA末端的快速擴(kuò)增RACE產(chǎn)物鑒定試劑盒試劑8/23/202419cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)RACE比較用GSPs和NGSPs