羥丙基殼聚糖制備的研究

PAGE2基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31071538）1作者簡介：馮煒瑋（1986-），男，陜西咸陽人，碩士研究生，研究方向：藥物生物化學(xué)。E-Mail:fweiweiking217@126.com。聯(lián)系電話：158987515343通訊作者：陳志偉（1972-），男，博士，教授,主要研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)學(xué),分析化學(xué)。E-Mail:chen@。羥丙基殼聚糖制備的研究馮煒瑋1，遲驍瑋1，孔維琴2，陳志偉3（1山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東淄博255049；2山東理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，山東淄博255049）摘要：本實(shí)驗(yàn)以異丙醇為介質(zhì)，應(yīng)用堿化交聯(lián)法制備了水溶性羥丙基殼聚糖，正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化制備反應(yīng)條件，茚三酮法測(cè)定羥丙基化取代度。結(jié)果表明：M殼聚糖：V環(huán)氧丙烷：V四甲基氫氧化銨=1：10：0.5、溫度60℃、反應(yīng)時(shí)間6h，此條件下所制得羥丙基殼聚糖平均取代度為0.42，具有良好的水溶性。關(guān)鍵詞：羥丙基殼聚糖；堿化交聯(lián)法；制備；取代度ResearchonPreparationofHydroxypropyl-ChitosanFengWei-wei1,ChiXiao-wei2,KongWei-qin2,ChenZhi-wei*(1SchoolofLifeScience,ShandongUniversityofTechnology,ZiBo,255049China;2SchoolofChemicalEngineering,ShandongUniversityofTechnology,ZiBo,255049China)Abstract:Inaddition,Hydroxypropyl-Chitosanwaspreparedbythemethodofalkalizationandcrosslinking,withisopropanolasmedium.Thereactionconditionswereoptimizedbyorthogonaldesign,thedegreeofsubstitutionwasdeterminedbytheninhydrinreaction.Asaresult,thebestreactionconditionswerelikethese:theratioofMass(chitosan):Volume(propyleneoxide):Volume(tetramethylammonium-hydroxide)were1:10:0.5,thereactiontemperaturewas60℃andreactiontimewas6h.Undertheseconditions,thedegreeofsubstitutionofHydroxypropyl-Chitosanwas0.42onaverage,andalsowithabetterwatersolubility.Keywords:Hydroxypropyl-chitosan;alkalizationandcrosslinking;preparation;degreeofsubstitution前言殼聚糖(Chitosan，簡稱CS)是天然多糖中唯一的堿性多糖，是甲殼素經(jīng)濃堿處理脫去N-乙?；漠a(chǎn)物，含有游離的一級(jí)氨基，即β-(1,4)-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，分子量一般在1×105～6×105，CS可通過體內(nèi)溶菌酶的作用，分解為葡胺糖，被人體吸收。因其來源豐富、無毒，且具有優(yōu)良的生物相容性和阻止藥物擴(kuò)散及溶出等特性，可很好地用于藥物載體[1-2]。但CS水溶性較差，只溶于弱酸，不溶于水和許多有機(jī)溶劑，很大程度上限制了它的應(yīng)用[3]。將CS羥丙基化制備成羥丙基殼聚糖(hydroxypropylchitosan，簡稱HPCS)，由于在CS分子上引入了羥丙基團(tuán)，改變了分子的空間結(jié)構(gòu)，削弱了CS分子間和分子內(nèi)的氫鍵作用，不僅保留了CS堿性和正電性，同時(shí)還提高了水溶性及反應(yīng)活性，且應(yīng)用范圍更為廣泛，已有報(bào)道HPCS應(yīng)用于離子吸附、紡織品除菌以及藥物緩釋等方面[4-8]。本實(shí)驗(yàn)采用堿化交聯(lián)法制備了水溶性羥丙基殼聚糖，并對(duì)比了其制備過程中主要條件的相互關(guān)系，為CS水溶性衍生物的進(jìn)一步制備提供了理論依據(jù)。1材料與方法1.1材料與儀器殼聚糖（粘度<100cps，脫乙酰度>90.0%，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；環(huán)氧丙烷（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；四甲基氫氧化銨（分析純，上海科豐化學(xué)試劑有限公司）；異丙醇（分析純）；無水乙醇（分析純，）；丙二醇（分析純，天津博迪化工股份有限公司）；茚三酮（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；丙酮；NaOH水溶液、鹽酸；濃硫酸（分析純，山東萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）。增力電動(dòng)攪拌器（江蘇金壇雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠，JJ-1型）；加熱磁力攪拌器（江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠，78-1型）；真空干燥機(jī)（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DZF-6020型）；傅立葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet儀器公司，Nicolet7500型）；電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠，）；比色管（上海申玻儀器公司，25mL型）；紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司，TU-1810型）；分析天平（上海天平儀器廠，F(xiàn)A-1640型）；隔膜真空泵（天津騰達(dá)過濾器件廠，GM-0.33型）。1.2方法1.2.1HPCS的制備準(zhǔn)確稱取2gCS與反應(yīng)容器中，先后加入適量30%的NaOH溶液和異丙醇，混合均勻，室溫勻速攪拌1h，4℃密封冷藏過夜。加入1mL催化劑四甲基氫氧化銨，勻速攪拌環(huán)境下緩慢滴加過量環(huán)氧丙烷，于60℃攪拌反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。用鹽酸調(diào)節(jié)pH到7，沉淀、抽濾，用無水乙醇充分洗滌，60℃真空干燥即得到白色或淡黃色固體粉末HPCS[9]。反應(yīng)式如圖1所示：圖1HPCS制備反應(yīng)原理[9]Fig1ReactionPrincipleofHPCS1.2.2HPCS的定型鑒定采用碘仿反應(yīng)進(jìn)行定性鑒定：碘仿反應(yīng)是指某些含有特殊基團(tuán)的有機(jī)化合物與次碘酸鹽作用產(chǎn)生淡黃色碘仿的反應(yīng)，這類有機(jī)化合物中含有CH3CH(OH)-R或者CH3CO-連于H或C上的結(jié)構(gòu)[10]。在試管中加入適量的HPCS溶液，再加入3~5滴I2-KI試液，緩慢振蕩至均勻，逐滴加入10%的NaOH溶液，直到溶液呈淺黃色時(shí)停止滴加，堿性條件下I2-KI能與羥丙基團(tuán)[-CH2CH(OH)CH3]發(fā)生呈色（淺黃色）反應(yīng)，若不顯色則溶液中不存在羥丙基團(tuán)。1.2.3丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定制備1.00mg/mL的1-2丙二醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取2mL、4mL、6mL、8mL、10mL此標(biāo)準(zhǔn)溶液于50mL容量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，得到濃度依次為40ug/mL、80ug/mL、120ug/mL、160ug/mL、200ug/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述5種標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL于25mL具塞比色管中，冰水浴下緩慢加入8mL濃硫酸，混合均勻后于100℃水浴加熱3min，立即放入冰浴中冷卻，小心沿管壁加入3%茚三酮溶液，立即搖勻，25℃水浴10min，在用濃硫酸稀釋至刻度，傾倒混勻（切記不要振蕩，以免發(fā)生危險(xiǎn)）。靜置5min，用1cm比色皿于595nm處測(cè)定吸光度值，作出吸光度-濃度曲線。1.2.4取代度（DS）的測(cè)定稱取適量HPCS于50mL容量瓶中，加入25mL1mol/L的H2SO4溶液，置于沸水浴中加熱至樣品溶解成透明溶液，冷卻，蒸餾水定容，用相同方法處理CS。分別準(zhǔn)確量取1mL上述CS溶液，HPCS溶液及丙二醇標(biāo)液（1.2.3所配制）于具塞的25mL比色管中。將比色管插入水中，小心加入濃硫酸8mL混勻，擰緊管塞，沸水浴加熱3min，立即置于冰浴冷卻10min，準(zhǔn)確量取0.5mL3%茚三酮溶液，沿管壁加入，振蕩均勻，25℃水浴中恒溫100min使之顯色，然后用濃硫酸定容，分光光度計(jì)在595nm下測(cè)定吸光度A。以丙二醇用量-吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式計(jì)算取代度，計(jì)算式如下：（1）（2）式（1）中羥丙基%由式（2）中計(jì)算而得；式（2）中ρ（丙二醇）為吸光度A所對(duì)應(yīng)的丙二醇質(zhì)量濃度μg/mL；m為羥丙基殼聚糖質(zhì)量g；0.7763為丙二醇轉(zhuǎn)換成羥丙基的轉(zhuǎn)換值[11]。1.2.5紅外光譜分析分別稱取少量充分干燥后的CS和HPCS固體粉末，KBr壓片，中紅外光譜儀測(cè)定，波數(shù)為0~4000cm-1。2結(jié)果與討論2.1HPCS定性檢測(cè)2.1.1碘仿反應(yīng)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)產(chǎn)物溶液中滴加I2-KI試液和10%NaOH溶液（兩者可結(jié)合成次碘酸鈉），產(chǎn)生了少量淡黃色的沉淀物，說明發(fā)生了碘仿反應(yīng)，即產(chǎn)物中存在著[-CH2CH(OH)CH3]結(jié)構(gòu)，而反應(yīng)物原料殼聚糖中不存在伯羥基，可以定性證明生成了HPCS產(chǎn)物。2.1.2FTIR測(cè)試結(jié)果傅立葉變換中紅外測(cè)定CS與HPCS，紅外分析結(jié)果見圖2。圖2殼聚糖與羥丙基殼聚糖的紅外光譜Fig2FTIRpictureofCS&HPCS圖2為HPCS和CS的FTIR疊加譜圖，a、b均在3400cm-1處存在強(qiáng)的-OH和N-H疊加的伸縮振動(dòng)吸收峰，1640cm-1和1585cm-1處的N-H變形振動(dòng)吸收峰幾乎沒有發(fā)生變化。b圖中，2968cm-1和1480cm-1處出現(xiàn)了極為明顯的新吸收峰，這兩處分別是-CH3的伸縮振動(dòng)和不對(duì)稱形變，證明在CS上引入了羥丙基基團(tuán)，羥丙基取代后引入了大量的甲基。同時(shí)，位于1000～1200cm-1范圍內(nèi)的吸收峰有不同程度的減弱或消失。1095cm-1處出現(xiàn)典型的醚鍵，說明反應(yīng)沒有發(fā)生在-NH2上，而是在C6上。2.2HPCS羥丙基取代率及產(chǎn)量2.2.1丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig3Standardcurveofpropanediol根據(jù)1.2.3實(shí)驗(yàn)操作，繪出如圖3所示丙二醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=0.0043X+0.2040，（R2=0.9957），線性良好。由曲線趨勢(shì)可知，吸光度值隨著丙二醇濃度增大而增大。2.2.2HPCS制備結(jié)果本試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及主要結(jié)果見表1。編號(hào)環(huán)氧丙烷（mL）反應(yīng)時(shí)間（h）反應(yīng)溫度（℃）HPCS產(chǎn)量（g）取代度（DS）水溶性1104301.88340.0879+--2106452.10510.1568+--3108602.09450.2209+--4204453.40630.4013+++5206603.66200.4224+++6208302.27350.3729++-7304602.71050.3884++-8306302.69820.3156++-9308453.21500.3675++-表1HPCS實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1ResultoftheexperimentationofHPCS注：---為不溶，+--為少量溶解，++-為大部分溶解，+++為完全溶解根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，以及表1正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：環(huán)氧丙烷加入量為10mL時(shí)，產(chǎn)物HPCS的產(chǎn)量和取代度均比較低，且隨體系溫度與反應(yīng)時(shí)間變化的增長趨勢(shì)較小，原因可能由于環(huán)氧丙烷加入量不足，導(dǎo)致體系反應(yīng)活性受限，HPCS生成量以及取代度較低；環(huán)氧丙烷取20mL時(shí)，HPCS產(chǎn)量明顯提高，取代度及相應(yīng)水溶性也大幅提高，且當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時(shí)間為6h，HPCS平均產(chǎn)量達(dá)到3.6620g，平均取代度為0.4224，水溶性良好[12]；環(huán)氧丙烷為30mL時(shí)，HPCS產(chǎn)量及取代度有下降趨勢(shì)，可見環(huán)氧丙烷加入量過大亦不利于HPCS的生成和取代度的提高。2.2.3反應(yīng)條件與HPCS取代度的關(guān)系根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析主要實(shí)驗(yàn)條件及因素并進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，可分別獲得各反應(yīng)條件與產(chǎn)物特征指標(biāo)（取代度）的關(guān)系特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4、5、6。圖4HPCS取代度與環(huán)氧丙烷反應(yīng)量的關(guān)系Fig4TherelationshipbetweenDSandthereactionvolumeofPO圖5HPCS取代度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系Fig5TherelationshipbetweenDSandthereactiontime圖6HPCS取代度與反應(yīng)溫度的關(guān)系Fig6TherelationshipbetweenDSandthereactiontemperature由圖4、5、6可知，反應(yīng)體系中環(huán)氧丙烷的加入量對(duì)產(chǎn)物HPCS取代度的影響最大，反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)其影響相對(duì)較小。環(huán)氧丙烷加入量較大，時(shí)間過長時(shí)，產(chǎn)物平均取代度均呈下降趨勢(shì)，這可能與原料隨反應(yīng)進(jìn)行而部分損失或揮發(fā)有關(guān)，當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，HPCS平均取代度最大（DS=0.3439）。3結(jié)論利用環(huán)氧丙烷與殼聚糖反應(yīng)，制備了水溶性良好的羥丙基殼聚糖，正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探索了最佳的反應(yīng)條件及相應(yīng)的影響趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳條件為：M殼聚糖：V環(huán)氧丙烷：V四甲基氫氧化銨=1：10：0.5，反應(yīng)時(shí)間6h，溫度60℃，此條件下制備出的羥丙基殼聚糖平均取代度最高（DS=0.42），且主要反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物取代度影響關(guān)系為：V環(huán)氧丙烷>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間。不足之處為HPCS產(chǎn)量并不與其取代度呈線性關(guān)系，原因可能是反應(yīng)過程中部分原料的揮發(fā)所致（環(huán)氧丙烷沸點(diǎn)為34℃），且隨著反應(yīng)時(shí)間與體系溫度的變化，揮發(fā)量也不盡相同，從而造成實(shí)際反應(yīng)量不足，近而致使產(chǎn)物的產(chǎn)量下降。因此，獲得理想取代度及相應(yīng)產(chǎn)量的羥丙基殼聚糖，其制備技術(shù)和工藝仍需要不斷改進(jìn)和完善。參考文獻(xiàn)[1]SzczubialkaK,ZomerskaK,KarewiczA,eta1.Noveldrugcarrierchitosangelmicrosphereswithcovalenttyattachednicotinicacid[J].JournalofControlledRelease,2006,116(2):13-15.[2]XuYM,DuYM.Effectofmolecularstructureofchitosanonproteindeliverypropertiesofchitosannanoparticles[J].InternationalJournalofPharmaceutics,2003,250(1):215-226.[3]PrabaharanM.Chitosanderivativesaspromosingmaterialsforcontrolleddrugdelivery[J].JournalofBiomaterialsApplications,2008,23(1):5-36.[4]居成學(xué),尹建偉,黃凌,等.聚乳酸/羥丙基淀粉復(fù)合降解型材料的制備和表征[J].塑料,2008,37(6):67-69.[5]LingK,ZhengF,LiJL,etal.Effectsofsubstitutiondegreeofphotoreactivegroupsonthe