表柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響

1/1表柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響表柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響畢曉軍李健范連慧劉龍何龍（沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院泌尿外科，中國(guó)，沈陽(yáng)，110016）【摘要】目的：

表柔比星是膀胱灌注輔助治療膀胱癌的常用藥物，本研究主要通過研究表柔比星對(duì)膀胱癌細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響，從而探討表柔比星治療膀胱癌的作用機(jī)制。

方法：

本研究通過向膀胱腫瘤細(xì)胞中加入不同濃度表柔比星培養(yǎng)細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中miR-21表達(dá)量的變化情況。

結(jié)果：

隨著表柔比星濃度的增加，膀胱癌細(xì)胞5637中的miR-21的表達(dá)水平下降。

觀察組不同濃度與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），隨著表柔比星濃度的增加，人膀胱癌5637細(xì)胞中的miRNA-21的表達(dá)水平下降，即呈劑量依賴趨勢(shì)。

結(jié)論：

表柔比星能夠抑制膀胱癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，并呈濃度依賴趨勢(shì)。

【關(guān)鍵詞】膀胱腫瘤；miR-21；表柔比星TheeffectofepirubicinontheexpressionofmiR-21inbladdercancercellsTheeffectofepirubicinontheexpressionofmiR-21inbladdercancercellsBiXiaojun，LiJian，F(xiàn)anLianhui，LiuLong，Helong（DepartmentofUrologySurgery,theGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang,110016,China）【【Abstract】Objective:Epirubicinisacommonlyuseddrugassistedbladderperfusiontreatmentofbladdercancer,thisstudymainlythroughthestudyofepirubicinonexpressionofmiR‐21inbladdercancercells,soastoexplorethemechanismofepirubicininthetreatmentofbladdercancer.Method:Thisstudybyaddingdifferentconcentrationsofepirubicininculturedcellstobladdercancercells,detectedtheexpressionlevelofmiR‐21.Result:TheexpressionlevelofmiR‐21inbladdercancercell5637isdecreasedwiththeincreaseoftheepirubicin.Observedgroupsofdifferentconcentrationsandthecontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P0.05),withepirubicinconcentrationincreased,expressionlevelinhumanbladdercancer5637cellsmiRNA‐21decreased,i.e.inadosedependenttrend.Conclusion:EpirubicincaninhibittheexpressionofmiR‐21inbladdercancercells,andadose‐dependenttrend.【【Keywords】:bladdercancer;miR-21；epirubicin膀胱癌是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤。

是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。

占我國(guó)泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率的第1位，膀胱腫瘤具有較高的復(fù)發(fā)率和侵襲能力，多以浸潤(rùn)方式生長(zhǎng)。

近年來隨著人口老齡化等膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上級(jí)趨勢(shì)[1]。

MicroRNAs（miRNAs，微小RNA）是一類在病毒、植物和動(dòng)物等生物體中廣泛存在的進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)小RNA。

在RNA的降解以及蛋白抑制方面有著非常重要的作用，從而影響細(xì)胞的增值、分化和凋亡等過程[2]。

已有研究表明miR-21在膀胱癌中存在過表達(dá)。

目前非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌多以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)術(shù)后輔助表柔比星灌注化療為主。

本文通過研究表柔比星與microRNA的關(guān)系的基礎(chǔ)研究，希望在分子生物學(xué)水平找到一條新的預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)的道路。

1材料和方法1.1材料5637細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，所有細(xì)胞采用貼壁細(xì)胞法培養(yǎng)、傳代及保留，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

表柔比星購(gòu)于浙江海正藥業(yè)股份有限公司，PCR試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)于大連Takara公司。

引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，simiR-21及si-negativecontrol均由上海吉瑪制。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640，在95%濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、條件下培養(yǎng)。

將5105的5637細(xì)胞接種至6孔板中，用2ml的培養(yǎng)液（含10%血清和抗生素）培養(yǎng)。

24小時(shí)后，向各組細(xì)胞中加入表柔比星，用PBS作為對(duì)照。

各組別的藥物終濃度分別為0.0ug/ml,0.25ug/ml,0.5ug/ml,1.0ug/ml,2.0ug/ml.培養(yǎng)48h后，裂解細(xì)胞并分析其miR-21的表達(dá)。

1.3qRT-PCR檢測(cè)用TRIzol試劑提取5637細(xì)胞系總RNA，用miR-21檢測(cè)試劑盒檢測(cè)miR-21表達(dá)水平。

首先取10ng總RNA與3ul逆轉(zhuǎn)錄酶混合，在15ul反應(yīng)體系中，16℃30min，42℃30min，85℃5min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

然后將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA150倍稀釋，取2ul稀釋的cDNA150與2ulTaqMan引物混合，在20ul反應(yīng)體系中，95℃變性10min；95℃15s，60℃60s，40個(gè)循環(huán)。

細(xì)胞中miRNA表達(dá)用Ｕ6snRNA為內(nèi)對(duì)照，相對(duì)miRNA表達(dá)水平用２－Ct計(jì)算改變倍數(shù)，相對(duì)miRNA表達(dá)水平用２－Ct計(jì)算改變倍數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P值＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1miRNA-21及內(nèi)參U6的基因表達(dá)譜目的基因（miRNA-21）的溶解擴(kuò)增曲線見(圖1)，溶解曲線見(圖2)；內(nèi)參基因（U6）的擴(kuò)增曲線見(圖3)，溶解曲線見(圖4)。

圖1，miR-21的擴(kuò)增曲線圖2，miR-21的溶解曲線圖3，U6擴(kuò)增曲線圖4，U6溶解曲線2.2加入不同濃度表柔比星后，5637細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平變化觀察組中表柔比星終濃度分別為0.0ug/ml,0.25ug/ml,0.5ug/ml,1.0ug/ml,2.0ug/ml，對(duì)照組用PBS溶液培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)上述標(biāo)本中miRNA-21的表達(dá)水平。

隨著表柔比星濃度的增加，膀胱癌細(xì)胞5637中的miR-21的表達(dá)水平下降。

觀察組不同濃度與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）(表1)。

對(duì)所得結(jié)果作直線回歸的統(tǒng)計(jì)推斷，可建立回歸方程，對(duì)回歸方程作假設(shè)檢驗(yàn)，F(xiàn)=24.924，作出統(tǒng)計(jì)推斷，得P＜0.01，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可確定表柔比星濃度與miR-21之間有直線回歸關(guān)系。

即觀察組用不同濃度表柔比星培養(yǎng)，在一定濃度內(nèi)隨著表柔比星濃度的增加，人膀胱癌5637細(xì)胞中的miRNA-21的表達(dá)水平下降，即呈劑量依賴趨勢(shì)(圖5)。

表柔比星（ug／ml）均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差t值P值010.0000000.250.4063010.02762226.336791＜0.050.50.1650240.0347714.700604＜0.0510.1277270.00360512.565801＜0.0520.0871720.0113585.960168＜0.05表1不同濃度表柔比星轉(zhuǎn)染后，各組細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平圖5，不同濃度表柔比星對(duì)膀胱癌HTB-9細(xì)胞miRNA-21的表達(dá)水平。

3討論miRNA是在存在于廣泛動(dòng)植物體內(nèi)的一種非編碼小RNA，包含大約1000個(gè)短小核苷酸片段和18-25個(gè)長(zhǎng)核苷酸片段的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后控制水平與特定信使RNA轉(zhuǎn)錄物的互補(bǔ)序列結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)[3、4]。

可調(diào)控人類基因的60%。

一種miRNA可有多種靶點(diǎn)，許多種miRNA也可有一個(gè)共同靶點(diǎn)[5]。

主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，通過與其目標(biāo)mRNA分子的非編碼區(qū)域互補(bǔ)匹配降解靶mRNA或抑制其翻譯。

在被miRNA調(diào)控的基因中，大約有50%的基因與腫瘤相關(guān)基因區(qū)或脆弱基因區(qū)相關(guān)聯(lián)[6]。

不同腫瘤組織中，miRNA呈現(xiàn)不同基因序列。

Let-7家族的多種成員在多種腫瘤組織中呈抑制性表達(dá)。

體內(nèi)、外模型試驗(yàn)提示let-7可以使腫瘤維持現(xiàn)狀或抑制腫瘤生長(zhǎng)。

腫瘤幾乎對(duì)所有化療藥物都可以產(chǎn)生抵抗。

研究表明，miRNA能調(diào)解腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。

Blower等[7]采用轉(zhuǎn)染miRNA和反義核酸抑制的方法，發(fā)現(xiàn)let-7i、miR-16、miR-21影響化療藥物的療效高達(dá)4倍。

通過體外試驗(yàn)研究藥物抵抗的機(jī)制，可以幫助我們提高臨床治療水平。

miRNA通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制廣泛參與了各種生命活動(dòng)進(jìn)程。

miRNA-21對(duì)腫瘤的致癌作用具有普遍性，在膀胱癌中也扮演重要角色，其主要定位于細(xì)胞核，呈高度表達(dá)，并在膀胱癌細(xì)胞分級(jí)機(jī)臨床分期中扮演重要角色。

miRNA-21是最常見的表達(dá)上調(diào)miRNA，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用。

與膀胱癌密切相關(guān)的細(xì)胞凋亡因子4（PDCD4）和抑癌基因（PTEN）及TPM1，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21可對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，從而證明miRNA-21與膀胱癌關(guān)系密切[8-10]。

戰(zhàn)鵬等[11]通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)miRNA-21在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于膀胱正常組織，并隨著臨床分期和細(xì)胞分級(jí)增高，miRNA-21的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高，說明其表達(dá)與膀胱癌的惡性程度和嚴(yán)重性呈正相關(guān)，與年齡和性別無關(guān)。

本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)了不同濃度表柔比星條件下膀胱癌5637細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示表柔比星能夠有效的降低膀胱癌細(xì)胞5637中的miR-21的表達(dá)，并且呈Dosedependent趨勢(shì)。

不但從再次證實(shí)了膀胱癌細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)高于正常組織，更從分子生物學(xué)水平證實(shí)了表柔比星在抑制膀胱癌復(fù)發(fā)方面的有效性。

膀胱癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)或進(jìn)展是導(dǎo)致膀胱癌預(yù)后不佳的重要因素[12]。

雖然目前已發(fā)現(xiàn)較多膀胱癌的復(fù)發(fā)原因，并通過聯(lián)合用藥等多種方法治療膀胱癌，雖可在一定程度上抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)，但臨床效果欠佳。

在臨床治療過程或治療結(jié)束后，膀胱癌往往復(fù)發(fā)。

目前關(guān)于抗腫瘤的藥物機(jī)制多集中在抗腫瘤藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響，并且對(duì)其機(jī)制的解釋往往不能使人信服。

本實(shí)驗(yàn)首次關(guān)注了抗腫瘤藥物對(duì)膀胱癌相關(guān)基因表達(dá)影響。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果分析，表柔比星能抑制miR-21的表達(dá)，并呈濃度依賴趨勢(shì)。

因此，給將來研究新的抗腫瘤藥物提供了一種新的途徑，可以在分子生物學(xué)水平上驗(yàn)證抗腫瘤藥物的有效性。

1CheungG,SahaiA,BilliaM,etal.Recentadvancesinthediagnosisandtreatmentofbladdercancer[J].BMCMed.2013January17;11:13.2ChenPS,SuJL,HungMC.DysregulationofMicroRNAsincancer[J].JBiomedSci,2012,19(1):90.3桂瑞豐,胡文輝.miRNA在肝癌患者血清中的表達(dá)及意義[J].安徽醫(yī)藥,2016,20(1):126-128.4JinB,LiuY,WangH.AntagonismofmiRNA-21SensitizesHumanGastricCancerCellstoPaclitaxel[J].CellBiochemBiophys,2015,72(1):275-82.5FriedmanRC,FarhKK,BurgeCB，etal.MostmammalianmRNAsareconservedtargetsofmicroRNAs[J].GenomeRes.2009,19(1):92-105.6WuS,HuangS,DingJ,etal.MultiplemicroRNAsmodulatep21Cip1/Waf1expressionbydirectlytargetingits3untranslatedregion[J].Onco-gene.2010,29(15):2302-2308.7BlowerPE，ChungJH，VerducciJS，etal．MicroRNAsmodulatethechemosensitivityoftumorcells[J].MolCancerTher,2008,7(1)：

1-9．8LiT，LiD，ShaJ，etal．Mi