polβ高表達(dá)與食管癌細(xì)胞耐藥的相關(guān)性

1/1polβ高表達(dá)與食管癌細(xì)胞耐藥的相關(guān)性pol高表達(dá)與食管癌細(xì)胞耐藥的相關(guān)性【關(guān)鍵詞】DNA聚合酶；轉(zhuǎn)染；食管腫瘤；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；抗藥性，腫瘤；四甲基偶氮唑藍(lán)DNA聚合酶beta(polymerasebetagene，pol)廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞核內(nèi)，是一條Mr為39103的單肽鏈小分子蛋白，由355個氨基酸組成，是目前已知的最小的DNA聚合酶.在堿基切除修復(fù)，DNA復(fù)制，跨損傷合成中發(fā)揮重要作用，還與基因組不穩(wěn)定性有關(guān)［1-4］.近年來的研究表明在多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞株內(nèi)polmRNA的表達(dá)都明顯增加［5-6］.pol與腫瘤細(xì)胞耐藥性的關(guān)系也逐漸引起人們的注意.本實(shí)驗(yàn)通過研究人食管癌順鉑(concentrationofcisplatin,cDDP)耐藥細(xì)胞系Ec9706/cDDP和穩(wěn)定高表達(dá)人野生型pol的Ec9706細(xì)胞中pol的表達(dá)水平及其對抗腫瘤藥cDDP的敏感性，旨在進(jìn)一步探討pol高表達(dá)與食管癌細(xì)胞耐藥的相關(guān)性.1材料和方法1.1材料人食管癌細(xì)胞株Ec9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供；cDDP山東齊魯藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)液Gibco/BRL公司生產(chǎn)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為美國Sigma產(chǎn)品；pEGFPC3(Clonetech公司)；野生型人pol重組綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFPAC3(微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室趙國強(qiáng)教授惠贈)；G418(寶生物公司)；6TG(美國Sigma公司)；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；引物2對，由上海生工公司合成：

polRNA檢測引物：

上游5TGTTTGCCAGCTTCCCAGTA3，下游5CTCCAGTGACTCCCAAGGGA3，擴(kuò)增長度206bp；actin引物:上游5TCAAGATCATTGCTCCTCCTGA3，下游5CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG3，擴(kuò)增長度113bp.1.2方法1.2.1cDDP誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞系Ec9706/cDDP的建立采用cDDP中等濃度、間歇作用方法建株.以終濃度為2mg/L的cDDP培養(yǎng)基沖擊對數(shù)生長期的Ec9706細(xì)胞，48h后棄去含藥培養(yǎng)基，PBS洗3次，換新鮮培養(yǎng)基.1～2d換液1次，洗去死亡細(xì)胞，待形成細(xì)胞克隆時傳代，恢復(fù)穩(wěn)定生長后提高cDDP濃度再次沖擊，如此反復(fù)作用直至細(xì)胞可在濃度為0.5mg/L的cDDP培養(yǎng)液中維持培養(yǎng).1.2.2穩(wěn)定高表達(dá)人野生型pol的Ec9706細(xì)胞系的建立取對數(shù)生長期Ec9706細(xì)胞以2.5105個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融和度達(dá)60%～70%時，以正常Ec9706細(xì)胞作對照，分組轉(zhuǎn)染pEGFPC3(空質(zhì)粒)和pEGFPAC3，按轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000操作說明書進(jìn)行.4～6h后，棄轉(zhuǎn)染液換2mL含10mL/L胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng).48h后以含750mg/LG418的培養(yǎng)液篩選，約14d后對照Ec9706細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染組改用含200mg/LG418的培養(yǎng)液，陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，建立穩(wěn)定傳代轉(zhuǎn)染細(xì)胞系.轉(zhuǎn)染pEGFPC3,pEGFPAC3的細(xì)胞分別用Ec9706C3,Ec9706AC3表示.1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察普通倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞綠色熒光.1.2.4RTPCR檢測polmRNA的表達(dá)取細(xì)胞各1瓶，按Trizol試劑盒說明書抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系30L：

10buffer3L，dNTP2.4L，上下游引物各0.5L，Taq酶0.5U，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5L.PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，35個循環(huán)后，72℃延伸5min.15g/L瓊脂糖凝膠電泳.SYNGENE凝膠分析系統(tǒng)軟件分析電泳結(jié)果，用pol與actin積分吸光度值的比值表示pol基因的相對表達(dá)水平.1.2.5MTT法測細(xì)胞對cDDP敏感性的變化常規(guī)MTT法檢測，酶標(biāo)儀以波長550nm測各孔A值，計(jì)算相對抑制率（％）＝（1-加藥孔A值/對照孔A值）100％，用IC50計(jì)算器軟件計(jì)算50%細(xì)胞生長抑制所需的藥物濃度(IC50)，耐藥指數(shù)(RI)=待測細(xì)胞IC50/Ec9706細(xì)胞IC50.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以xs表示，t檢驗(yàn)，=0.05.2結(jié)果2.1各組細(xì)胞形態(tài)經(jīng)過9mo的體外誘導(dǎo)篩選獲得了在含0.5mg/L的cDDP培養(yǎng)液中生長良好的耐藥細(xì)胞系Ec9706/cDDP.誘導(dǎo)過程中在加入cDDP后24h倒置顯微鏡下可見大部分細(xì)胞因死亡而漂浮起來，培養(yǎng)液略渾濁，殘留貼壁細(xì)胞發(fā)生明顯改變，大小不均勻，有巨細(xì)胞產(chǎn)生，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞突起及部分細(xì)胞質(zhì)中黑色顆粒較多，生長緩慢，于20d左右可形成細(xì)胞克隆，傳代后逐漸接近原來細(xì)胞形狀（圖1）.此外，倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，均呈多角形或圓形；在熒光顯微鏡488nm波長下Ec9706AC3與Ec9706C3細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，而對照Ec9706細(xì)胞則無熒光.2.2RTPCR結(jié)果耐藥細(xì)胞Ec9706/cDDP與親本細(xì)胞RTPCR后電泳結(jié)果見圖2.經(jīng)灰度掃描后兩種細(xì)胞內(nèi)polmRNA與actin相比其相對表達(dá)水平分別為0.490.09，0.810.16，Ec9706/cDDP中pol的表達(dá)高于親本細(xì)胞（Plt;0.05），是親本細(xì)胞的1.65倍；轉(zhuǎn)染細(xì)胞RTPCR后電泳結(jié)果見圖3.經(jīng)灰度掃描后Ec9706，Ec9706C3及Ec9706AC3細(xì)胞內(nèi)polmRNA與actin相比，其相對表達(dá)水平分別為0.520.13，0.480.11，1.210.15，表明Ec9706AC3細(xì)胞內(nèi)pol的表達(dá)高于Ec9706及Ec9706C3細(xì)胞（Plt;0.05），是Ec9706細(xì)胞的2.33倍；而Ec9706C3細(xì)胞內(nèi)pol的表達(dá)與Ec9706細(xì)胞相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）.A:正常不加藥的Ec9706細(xì)胞；B:加藥后24h細(xì)胞；C:加藥后20d左右形成的克??；D:Ec9706/cDDP細(xì)胞.2.3各組細(xì)胞對cDDP的敏感性經(jīng)MTT法檢測，人食管癌cDDP耐藥細(xì)胞系Ec9706/cDDP的耐藥指數(shù)為15.70.而Ec9706AC3對cDDP的耐藥指數(shù)為1.78，與Ec9706相比對cDDP的敏感性顯著降低（Plt;0.05），而對照轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Ec9706C3的IC50是Ec9706的0.97倍，與Ec9706相比對cDDP的敏感性無明顯改變（Pgt;0.05）.3討論腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制有多種，包括藥物的蓄積降低、細(xì)胞解毒功能的增強(qiáng)、藥物靶蛋白（如拓?fù)洚悩?gòu)酶TPO）量或活性的改變等.通常MRP,mdr1,GST,TPO與二氫葉酸還原酶等基因的異常表達(dá)與腫瘤的耐藥關(guān)系密切［7-8］.近年來，DNA修復(fù)能力增強(qiáng)（如pol表達(dá)增強(qiáng)）與耐藥性的關(guān)系也逐漸引起人們的注意.pol于1971年由Weissbach等［9］在牛胸腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，通常情況下在體內(nèi)恒定低水平表達(dá)，主要參與DNA修復(fù)，在堿基切除修復(fù)（baseexcisionrepair,BER）的過程中填補(bǔ)單核苷酸缺口，堿基摻入過程有很高的錯誤率，體外DNA聚合反應(yīng)中單堿基錯誤摻入率為1/1000～1/6600，是哺乳動物體內(nèi)復(fù)制保真度最低、最不精確的一種DNA聚合酶［10-11］.細(xì)胞為了正常分化以及DNA的正常復(fù)制與修復(fù)，pol在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平必須維持到一個適量的穩(wěn)定水平.當(dāng)pol高表達(dá)時，可導(dǎo)致細(xì)胞自身突變率增加、遺傳不穩(wěn)定性的發(fā)生以及對一些抗癌藥物產(chǎn)生耐受.有學(xué)者報(bào)導(dǎo)，將表達(dá)pol的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染如中國倉鼠卵巢細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對cDDP等化療藥物的敏感性降低［3］.對cDDP耐藥的卵巢癌細(xì)胞株中pol的表達(dá)比親本細(xì)胞增加了8倍［12］.本研究誘導(dǎo)建立了人食管癌cDDP耐藥細(xì)胞系Ec9706/cDDP，該細(xì)胞耐藥指數(shù)達(dá)15.70，細(xì)胞內(nèi)pol表達(dá)是親本食管癌細(xì)胞Ec9706的1.65倍；同時采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將人野生型pol重組綠色熒光蛋白表達(dá)載體pEGFPAC3導(dǎo)入食管癌細(xì)胞Ec9706后，其pol表達(dá)是Ec9706細(xì)胞的2.33倍，對cDDP的敏感性降低，耐藥指數(shù)為1.78.這些均表明pol的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對cDDP等的耐藥有關(guān)，pol的高表達(dá)可引起耐藥性的產(chǎn)生，耐藥細(xì)胞中pol的表達(dá)也會增高.同時，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染有pol表達(dá)載體的Ec9706AC3細(xì)胞內(nèi)pol的表達(dá)高于耐藥細(xì)胞Ec9706/cDDP，而其耐藥指數(shù)卻低于Ec9706/cDDP細(xì)胞，說明體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥細(xì)胞Ec9706/cDDP的耐藥機(jī)制有除pol外其它機(jī)制的參與.【參考文獻(xiàn)】［1］IdrissHT,AlAssarO,WilsonSH.DNApolymerasebeta［J］.IntJBiochemCellBiol,2002,34(4):321-324.［2］CanitrotY,FrechetM,ServantL,etal.OverexpressionofDNApolymerasebeta:Agenomicinstabilityenhancerprocess［J］.FASEBJ,1999,13(9):1107-1111.［3］CanitrotY,CazauxC,FrechetM,etal.OverexpressionofDNApolymerasebetaincellresultsinamutatorphenotypeandadecreasedsensitivitytoanticancerdrugs［J］.ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(21):12586-12590.［4］趙繼敏,金戈,黃幼田,等.不同類型的DNA聚合酶基因?qū)HO細(xì)胞的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(19):1805-1807.［5］SrivastavaDK,HusainI,ArteagaC,etal.DNApolymerasebetaexpressiondifferencesinselectedhumantumorsandcelllines［J］.Carcinogenesis,1999,20(6):1049-1054.［6］董子明,趙國強(qiáng),趙勤,等.人食管癌中pol基因突變的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志,2002,82(13):899-902.［7］AkiyamaS.Mechanismsofdrugresistanceandreversaloftheresistance［J］.HumCell,2001,14(4):257-260.［8］GottesmanMM.Mechanismsofcancerdrugresistance［J］.AnnuRevMed,2002,53:615-627.［9］WeissbachA,SchlabachA,FridlenderB,etal.DNApolymerasesfromhumancells［J］.