白介素8對(duì)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的影響

1/1白介素8對(duì)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的影響白介素8對(duì)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的影響作者：

齊曉勇孟存良李英肖黨懿劉惠良王天紅袁華兵倪艷輝劉光武振朝郜利會(huì)【摘要】目的觀察白介素8（IL8）水平對(duì)兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的影響。

方法新西蘭大白兔36只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、IL8單克隆抗體治療組、對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)組和治療組動(dòng)物通過(guò)穿刺股動(dòng)脈送入球囊拉傷腹主動(dòng)脈。

治療組動(dòng)物通過(guò)耳緣靜脈注射IL8單克隆抗體進(jìn)行干預(yù)。

對(duì)照組動(dòng)物只進(jìn)行股動(dòng)脈穿刺和留置鞘管，不進(jìn)行球囊擴(kuò)張拉傷。

分別于實(shí)驗(yàn)前,實(shí)驗(yàn)后4h、1d、3d，1w、2w、4w，耳緣靜脈采血4ml，檢測(cè)三組動(dòng)物血清IL8水平，4w后處死動(dòng)物進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和計(jì)算機(jī)病理圖像分析系統(tǒng)分析測(cè)定以下指標(biāo)：

內(nèi)膜中膜厚度、面積，計(jì)算血管狹窄程度。

結(jié)果實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物球囊損傷4h后IL8水平即開始升高，術(shù)后1d達(dá)到峰值，持續(xù)增高4w，且明顯高于治療組和對(duì)照組。

治療組和對(duì)照組動(dòng)物IL8水平無(wú)上述變化規(guī)律。

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腹主動(dòng)脈明顯狹窄，組織學(xué)檢查內(nèi)膜面積和中膜面積、血管狹窄程度等指標(biāo)大于治療組和對(duì)照組（Plt;0.01），治療組管腔狹窄，對(duì)照組動(dòng)物管腔無(wú)明顯變化，治療組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05)。

相關(guān)分析顯示，IL8水平與內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積、中膜厚度、中膜面積等呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.894，0.783，0.801，0.912，均Plt;0.01)。

結(jié)論IL8水平高表達(dá)引起腹主動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的產(chǎn)生，經(jīng)IL8單克隆抗體治療后動(dòng)脈狹窄程度明顯減輕。

IL8水平與動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)，是發(fā)生腹主動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

【關(guān)鍵詞】腹主動(dòng)脈；動(dòng)脈粥樣硬化；炎性反應(yīng)；白介素8；單克隆抗體【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsofinterleukin8(IL8)onatherosclerosis(AS)ofabdominalaortainrabbits.MethodsThirtysixNewZealandwhiterabbitswererandomlydividedintoexperiment,treatmentandcontrolgroups,eachgroup12cases.Rabbitsinexperimentandtreatmentgroupswereinjuriedinabdominalaortabyballooninflationafterpuncturedinfemoralartery.MonoclonalantibodyofIL8wasinjectedbyvenousinrabbitsoftreatmentgroup.Rabbitsincontrolgroupwerepuncturedonlyinfemoralartery.Peripheralbloodwascollectedbeforeexperimentand4h,1,3d,1,2,4wlater.ThelevelofIL8wasmeasuredbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)respectively.Theluminalsofabdomialaortainthreegroupswereobserved4wlater.Histopathologicexaminationwasperformed.Suchcontentsasfollowswereassayedbylightmicroscopeandcomputerimageanalysissystem:luminalarea,intimaandtunicamediaarea,angiostenosisofbloodvessel.ResultsThelevelofIL8wasraisedin4handachievedtopeakin1dafterballooninflationinrabbitsofexperimentgroup.Thehigherlevelofthisinflammatoryfactorlasted4w.Therewasnovariationaboveintreatmentandcontrolgroups.Itwasobservedthatabdominalaortabecamestenosisobviouslyinexperimentgroup.Theareaofintimaandtunicamediaaswellastheextentofstenosisinexperimentgroupwerebiggerthanthoseintreatmentandcontrolgroups.Therewasnostatisticaldifferencebetweentreatmentandcontrolgroups.CorrelationanalysisindicatedthattherewerepositiverelationsbetweenIL8andthickness,areaofintimaandtunicamediasrespectively(r=0.894，0.783，0.801，0.912，Plt;0.01).MultipleregressionanalysisofLogisticindicatedthatIL8wasanindependentriskfortheAS（Plt;0.01）.ThehighlevelsofIL8leadedtoASinabdominalaortaofrabbits.TheseverityofstenosisbecamelessenafterinterventionbymonoclonalantibodyofIL8.PositivecorelationwasfoundbetweenthelevelofIL8andseverityofarterialstenosis.IL8wasoneofindependentrisksfactorleadingoccurrenceanddevelopmentofAS.ConclusionsThehighlevelsofIL8leadstoASinabdominalaortaofrabbits.TheseverityofstenosisbecomeslessenafterinterventionbymonoclonalantibodyofIL8.PositivecorelationisfoundbetweenthelevelofIL8andseverityofarterialstenosis.IL8isoneofindependentrisksfactorleadingoccurrenceanddevelopmentofAS.【Keywords】Abdominalaorta;Atherosclerosis;Inflammatoryreaction;Interleukin8;Monoclonalantibody目前研究已經(jīng)證實(shí)，炎性反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的發(fā)生與發(fā)展中起到重要的作用。

參與AS形成的炎性因子眾多，且互相影響，因此觀察炎性因子的變化規(guī)律，了解炎性因子與AS病變的關(guān)系與作用機(jī)制，有助于尋找臨床干預(yù)AS的新方法。

白細(xì)胞介素8（Interleukin8，IL8）是體內(nèi)重要的炎性因子，可促使血液中單核細(xì)胞聚集到內(nèi)膜上及向內(nèi)膜下轉(zhuǎn)移。

本研究擬采用IL8單克隆抗體進(jìn)行干預(yù)治療，觀察干預(yù)治療后IL8水平變化以及對(duì)腹主動(dòng)脈AS狹窄的影響，為臨床治療AS性疾病提供新思路。

1材料與方法1.1動(dòng)物與分組選取8～12月齡新西蘭大白兔36只，雌雄不拘，體質(zhì)量2.50～3.25kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：

SCXK(冀)20031003)。

以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為球囊拉傷組（實(shí)驗(yàn)組,n=12）和IL8單克隆抗體干預(yù)組（治療組,n=12）以及對(duì)照組（n=12）。

1.2方法1.2.1兔腹主動(dòng)脈AS模型的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前12h禁食，不禁水，稱體重。

常規(guī)建立耳緣靜脈輸液通路，以10g/L戊巴比妥鈉3.0～3.5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，麻醉后動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，以20%硫化鈉雙側(cè)腹股溝脫毛。

常規(guī)消毒鋪巾后，seldinger技術(shù)穿刺股動(dòng)脈并留置鞘管，經(jīng)鞘管注入普通肝素200單位抗凝，沿導(dǎo)引鋼絲逆行插入球囊，連接手推式壓力表，造影后將球囊定位，置于髂動(dòng)脈以上2個(gè)椎體處，以405.30～607.95kPa壓力擴(kuò)張球囊，同時(shí)注射造影劑證實(shí)球囊完全擴(kuò)張堵閉腹主動(dòng)脈，自近心端緩慢回拉(拉傷長(zhǎng)度4cm)，反復(fù)3次，每次球囊擴(kuò)張持續(xù)時(shí)間20s，每次間隔15s，撤出球囊，拔除動(dòng)脈鞘管，壓迫止血15min后，繃帶包扎固定，4h后解除繃帶包扎。

1.2.2IL8單克隆抗體的干預(yù)治療干預(yù)組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前開始通過(guò)耳緣靜脈注射IL8單克隆抗體2mg/kg，連續(xù)3d。

1.2.3病理學(xué)檢查剝離腹主動(dòng)脈大體標(biāo)本（胸主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處）。

剪除血管外結(jié)締組織及脂肪，生理鹽水沖洗殘血。

截取成形部位及對(duì)照組血管標(biāo)本，立即放入10%福爾馬林溶液內(nèi)浸泡固定。

常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成3m厚連續(xù)切片24h，給予蘇木素伊紅（HE）染色。

利用HE染色的切片，隨機(jī)選取5個(gè)視野，在40倍光鏡下，利用微機(jī)圖像處理測(cè)量系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行圖像攝取和轉(zhuǎn)換，測(cè)量斑塊纖維帽及新生內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度(MT)、內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)，計(jì)算血管狹窄程度、IT/MT比值，以及IA/MA比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件包完成統(tǒng)計(jì)處理，先進(jìn)行組間均衡性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以xs表示，采用2檢驗(yàn)。

先行方差分析，然后再作多組均數(shù)的q檢驗(yàn)，相關(guān)資料采用相關(guān)分析法計(jì)算相關(guān)系數(shù)，并進(jìn)行多元Logistic回歸分析。

2結(jié)果2.1三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間體重、月齡、性別、血脂等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見(jiàn)表1。

表1三組動(dòng)物一般情況比較(略)2.2三組動(dòng)物術(shù)前、術(shù)后IL8水平比較術(shù)前三組IL8水平無(wú)明顯差異；術(shù)后4h實(shí)驗(yàn)組IL8水平較術(shù)前以及干預(yù)組和對(duì)照組明顯升高，術(shù)后1d達(dá)到峰值，持續(xù)增高4w。

干預(yù)組與治療組無(wú)上述變化趨勢(shì)，干預(yù)組顯著低于實(shí)驗(yàn)組（Plt;0.01），與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05)，見(jiàn)表2。

表2三組之間不同時(shí)間點(diǎn)IL8水平(略)2.3三組動(dòng)物病理形態(tài)學(xué)改變HE染色可見(jiàn)對(duì)照組動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮下有少量結(jié)締組織，無(wú)平滑肌細(xì)胞存在，中膜平滑肌細(xì)胞成梭形，環(huán)繞管腔排列；實(shí)驗(yàn)組兔內(nèi)膜、中膜明顯增厚，管腔明顯狹窄，內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞明顯增生，而且排列不規(guī)則，內(nèi)皮及內(nèi)皮下層水腫變性，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，斑塊隆起明顯，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞；治療組內(nèi)膜、中膜亦有不同程度的增厚，管腔有所狹窄，較多中膜平滑肌細(xì)胞增生遷移至內(nèi)膜下，但增生以及狹窄程度均明顯輕于模型組。

見(jiàn)圖1。

表3三組之間動(dòng)脈狹窄程度、內(nèi)膜中膜厚度面積比較(略)2.4三組之間動(dòng)脈狹窄程度、IT、MT、IA、MA比較實(shí)驗(yàn)組與治療組和對(duì)照組比較，動(dòng)脈狹窄程度、IT、、MT、TA、MA顯著增高（Plt;0.01），治療組雖高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。

見(jiàn)表3。

表4腹主動(dòng)脈狹窄的多元回歸分析(略)2.6腹主動(dòng)脈狹窄的多元回歸分析以術(shù)后腹主動(dòng)脈是否發(fā)生＞50%狹窄為因變量，月齡、術(shù)前體重、術(shù)后體重，術(shù)前、后甘油三酯（TG），術(shù)、前后總膽固醇（TC），術(shù)前、后高密度脂蛋白膽固醇（HDLC），術(shù)前、后低密度脂蛋白膽固醇（LDLC），術(shù)前、后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IL8水平等均作為自變量，進(jìn)行多元Logistic逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入模型的變量為術(shù)后1dIL8水平，其對(duì)于腹主動(dòng)脈狹窄發(fā)生的危險(xiǎn)性比值（RR）為1.674（95%可信區(qū)間1.164～2.530，P=0.001）。

表明術(shù)后IL8峰值為腹主動(dòng)脈狹窄發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

3討論炎性反應(yīng)在AS中的作用越來(lái)越受到人們重視，AS形成的炎癥學(xué)說(shuō)〔1〕認(rèn)為，炎癥是AS發(fā)病的重要原因，參與AS斑塊的形成、破裂及血栓形成，各階段均出現(xiàn)血管損傷的炎性反應(yīng)〔2〕。

炎癥反應(yīng)可同時(shí)存在于斑塊局部及全身炎癥系統(tǒng)。

研究已經(jīng)證明IL8等趨化因子及其特異性受體在AS中起重要作用〔3〕。

IL8主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，可刺激C反應(yīng)蛋白（CRP）、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM1）表達(dá)，并抑制金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）的活性，加強(qiáng)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等，導(dǎo)致患者臨床表現(xiàn)不穩(wěn)定。

組織中高濃度的IL8可以增強(qiáng)中性粒細(xì)胞黏附、移行，而循環(huán)中的IL8阻止中性粒細(xì)胞的游走并黏附于內(nèi)皮細(xì)胞〔4，5〕，研究表明在凝血因子激活和細(xì)胞活素級(jí)聯(lián)之間，IL8是二者相互作用的一個(gè)關(guān)鍵因素。

Rornuk等〔6〕研究冠心病患者的血漿IL8水平變化，發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定型心絞痛患者的血IL8水平明顯高于穩(wěn)定型心絞痛患者和對(duì)照組，提示IL8在一定程度上反映冠狀A(yù)S斑塊的穩(wěn)定性。

IL8的釋放可能是心絞痛患者冠狀動(dòng)脈病變局部炎性激活和凝血異常反應(yīng)的標(biāo)志，也是冠狀動(dòng)脈病變不穩(wěn)定的信號(hào)。

研究證實(shí)〔7〕，心絞痛（UA）患者血漿IL8表達(dá)在A型、B型、C型病變組依次增加，并與冠狀動(dòng)脈狹窄直徑呈正相關(guān)。

有研究證實(shí)，AS形成過(guò)程中IL8可以吸引T淋巴細(xì)胞，同時(shí)它也是血管生長(zhǎng)因子，能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖、移行〔8〕，對(duì)中性粒細(xì)胞有激活作用，可誘導(dǎo)其變形、趨化、脫顆粒、胞質(zhì)內(nèi)鈣短暫上升等。

此外，IL8也可以對(duì)T淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞有趨化作用，因此，IL8在炎癥局部發(fā)揮了重要的作用〔9〕。

Koch等〔10〕研究認(rèn)為，IL8可能通過(guò)其血管生長(zhǎng)因子特性參與AS的病理過(guò)程。

Rus等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)AS管壁中IL6和IL8的蛋白和基因表達(dá)都比正常管壁中高。

聶永梅等〔12〕通過(guò)建立AS模型,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了整個(gè)AS過(guò)程中IL8的蛋白和基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL8的蛋白和基因上調(diào)主要是在高脂血癥家兔AS模型的脂紋期。

由此可見(jiàn)，AS與IL8的升高密切相關(guān)。

IL8和黏附分子家族中的重要成員VCAM1參與了AS的形成過(guò)程〔13，14〕。

IL8能刺激中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞趨化、游走，而且和MCP1一起促進(jìn)牢固的單核細(xì)胞附壁〔15〕。

有研究表明，IL8可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮，而單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附可以誘導(dǎo)二者的激活，使其在無(wú)需其他刺激的情況下就能產(chǎn)生IL8，加劇了局部的炎癥病變〔16，17〕。

在轉(zhuǎn)基因高TC血癥的老鼠敲除了IL8的趨化因子受體（CXCR）2，可以縮小AS斑塊〔18〕。

本文前期研究中發(fā)現(xiàn)，兔腹主動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)后引起炎性反應(yīng)的發(fā)生與增強(qiáng)，在參與其中的炎性因子中，包括IL8、IL6、TNF、CRP等，IL8最先升高，達(dá)峰值時(shí)間最短，相關(guān)分析顯示IL8水平與IL6等表達(dá)呈正相關(guān)。

推測(cè)在上述炎性反應(yīng)中，IL8可能起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

在本研究中，球囊損傷兔腹主動(dòng)脈后引起IL8水平的高表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，同時(shí)腹主動(dòng)脈狹窄程度、IT及MT、IA及MA等明顯增加。

在兔球囊擴(kuò)張術(shù)后進(jìn)一步采用IL8單克隆抗體經(jīng)耳緣靜脈注射干預(yù)治療后，IL8水平與實(shí)驗(yàn)組比較顯著下降，峰值消失。

病理檢查結(jié)果顯示，腹主動(dòng)脈狹窄程度以及IT、MT、IA及MA和上述二者的比值等指標(biāo)均明顯下降，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。

直線相關(guān)分析顯示，IL8水平與上述動(dòng)脈狹窄指標(biāo)均呈正相關(guān)，多元Losgitic回歸分析表明，IL8水平是引起腹主動(dòng)脈狹窄的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明IL8在引起AS發(fā)展的病理進(jìn)程中，起到了關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了IL8和AS病變之間的關(guān)系，提示IL8單克隆抗體治療可有效降低IL8水平，抑制炎性反應(yīng)激活程度，阻遏AS的發(fā)展，有必要進(jìn)行下一步的深入研究，為臨床干預(yù)治療AS性疾病尋找新的治療方向。

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