半夏瀉心湯及其拆方對胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達的影響

1/1半夏瀉心湯及其拆方對胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達的影響半夏瀉心湯及其拆方對胃電節(jié)律失常大鼠胃組織縫隙連接蛋白Cx43表達的影響摘要：

目的探討半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運動的配伍規(guī)律。

方法選取90只健康SD雄性大鼠，分為正常組10只和模型組80只。

復(fù)制大鼠胃電節(jié)律失常模型，經(jīng)胃電生理學(xué)指標評價后，根據(jù)半夏瀉心湯的配伍特點，將其拆分為辛開、苦降、甘補、辛開苦降、辛開甘補、苦降甘補組，每組10只。

各給藥組按相同藥物濃度不等體積連續(xù)灌胃4周。

給藥后進行胃電參數(shù)分析，采用免疫組化法、RT-PCR檢測胃組織Cx43及其mRNA表達。

結(jié)果與正常組比較，模型組Cx43及其mRNA表達升高；與模型組比較，各給藥組胃電慢波頻率變異系數(shù)降低，各給藥組Cx43及其mRNA表達降低，其中辛開甘補組作用最為顯著。

結(jié)論半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運動機制可能與其降低縫隙連接蛋白Cx43及其mRNA表達有關(guān)，從而改變紊亂的胃電節(jié)律，達到改善胃運動功能的作用。

關(guān)鍵詞：

半夏瀉心湯；Cx43蛋白；縫隙連接；胃運動；大鼠中圖分類號：

R285.5文獻標識碼：

A文章編號：

1005-5304（2015）06-0075-05胃腸道運動功能紊亂是大多胃腸道疾病的重要臨床表現(xiàn)和發(fā)病機制，其發(fā)病率高。

半夏瀉心湯出自《傷寒論》，具有降逆止嘔、消痞散結(jié)的作用。

前期研究表明，半夏瀉心湯對胃電節(jié)律失常大鼠胃壁SCF基因表達水平、胃肌間神經(jīng)叢c-kit陽性間質(zhì)細胞（ICC）含量表達均有影響[1]。

胃腸神經(jīng)-ICC-平滑肌細胞（SMC）網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的變化對胃腸道動力障礙性疾病有重要的病理生理學(xué)意義。

在胃腸道中，縫隙連接（GJ）是介導(dǎo)SMC和ICC細胞間電化學(xué)信息交流，保證肌肉活動的協(xié)調(diào)性和同步性的特殊通道。

Cx43是構(gòu)成GJ最重要的連接蛋白，廣泛存在于胃腸Cajal與SMC之間。

Cx43基因發(fā)生突變、數(shù)量減少，會影響細胞膜上GJ通道的數(shù)量，從而妨礙細胞間信號的傳遞，導(dǎo)致胃腸道運動功能障礙。

本研究以Cx43為切入點，根據(jù)半夏瀉心湯辛開苦降甘補的配伍特點，按照藥味特點與中醫(yī)病機結(jié)合分組的原則，采用析因?qū)嶒炘O(shè)計研究半夏瀉心湯及其拆方對ICC細胞Cx43的影響，進一步揭示半夏瀉心湯調(diào)節(jié)胃運動的分子機制，闡釋經(jīng)方配伍規(guī)律。

1實驗材料1.1動物健康4周齡SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量（18020）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號0309256。

所有動物均給予大鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障動物實驗室。

1.2藥物半夏瀉心湯方的藥物劑量比例按文獻[2]換算。

法半夏55.7g，黃芩、干姜、人參、炙甘草各46.875g，黃連15.62g，大棗42g。

根據(jù)法依病機，拆方依法的研究思路[3]，將半夏瀉心湯拆分為辛開組（法半夏、干姜）、苦降組（黃芩、黃連）、甘補組（人參、炙甘草、大棗）、辛開苦降組（法半夏、干姜、黃芩、黃連）、辛開甘補組（法半夏、干姜，人參、炙甘草、大棗）及苦降甘補組（黃芩、黃連、人參、炙甘草、大棗）。

所有藥物均為免煎顆粒，北京康仁堂藥業(yè)有限公司。

1.3主要試劑與儀器4%多聚甲醛，solarbio公司；免疫組化通用試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；一抗Connexin43Antibody（鼠抗人，單克隆抗體）、二抗goatanti-mouseIgM-HRP，Santacruz公司；Trizol，Invitrogen公司；氯仿，索萊寶公司；異丙醇，北京益奧明科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司；SYBRGreenPCRMasterMix，ABI公司；所有引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

多導(dǎo)生理儀EGG100C（BioPac公司，美國），SPOTsoftwareV3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)（Diagnosticinstruments，美國），LD5-2A離心機（北京京立離心機有限公司），超聲勻漿機（PharmaciaBiotech），紫外分光光度儀（Pharmacia，美國），實時熒光定量PCR儀MX3000P（Stratagene，美國）。

2實驗方法2.1分組、造模與給藥將大鼠隨機分為正常組和模型組。

正常組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。

模型組80只，不規(guī)則喂養(yǎng)4周，即大鼠每逢單日正常進食、雙日禁食，以打亂其正常的飲食節(jié)律。

自由飲水，水中加入鹽酸（每升水加10mol/L鹽酸10mL），以破壞胃內(nèi)酸堿環(huán)境，制備大鼠胃電節(jié)律失常模型[4]。

大鼠不規(guī)則喂養(yǎng)4周后，參考文獻[4]進行胃電生理學(xué)評價，分析胃電慢波節(jié)律。

模型大鼠胃電節(jié)律異常，胃動過速、胃動過緩和節(jié)律紊亂，與正常組比較有顯著差異，提示造模成功。

將標記好的80只模型大鼠隨機分為模型組、辛開組、苦降組、甘補組、辛開苦降組、辛開甘補組、苦降甘補組、全方組，每組10只。

相當(dāng)于人單位體質(zhì)量原藥材量的10倍，即得大鼠每日喂食用藥量。

各給藥組每日按相同藥物濃度不等體積（5mL/kg）給予相應(yīng)藥液灌胃，每日1次，連續(xù)4周。

正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

2.2胃電生理學(xué)評價給藥4周后，大鼠禁食18h，腹腔注射3.5%水合氯醛（1mL/100g）麻醉，固定后腹部備皮，常規(guī)消毒，于劍突下正中切開腹壁1～2cm，暴露胃竇部，在距幽門0.5cm處漿膜下埋置一對Ag-AgCl電極，兩電極間距3mm，還原暴露的胃組織，接地電極插入大鼠腿部肌肉處固定。

將三股電極連接于多導(dǎo)生理儀上。

打開Acqknowledge4.1，胃電橫軸時間以1min為單位，縱軸振幅以2mV為單位進行胃電記錄，每次記錄30min。

胃電記錄完畢，用2/0縫合線縫合切口，碘伏擦拭。

術(shù)后大鼠腹腔注射青霉素40萬U/（d?只），連續(xù)3d。

術(shù)后1周取材。

胃電記錄以每10min為1個時間段，計算每只大鼠每個時間段的慢波頻率以及每只大鼠慢波頻率變異系數(shù)[4]，進行胃電參數(shù)分析。

2.3免疫組織化學(xué)法檢測胃組織Cx43表達大鼠禁食18h后，3.5%水合氯醛（1mL/100g）腹腔注射麻醉，背位固定，取出胃組織，生理鹽水沖洗干凈后，4%多聚甲醛固定。

采用SABC免疫組化檢測法胃組織Cx43表達，具體步驟按照試劑盒說明書進行。

采用SPOTsoftwareV3.0Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)，將染色后的病理切片在10倍光鏡下觀察后，在40倍鏡下每例標本隨機選擇肌間神經(jīng)叢的5個最能反映胃壁全貌的視野，觀察Cx43表達分布情況，結(jié)果進行半定量分析，檢測平均光密度值，計算積分光密度值（IOD）。

以細胞質(zhì)有明確棕色或棕黃色著色而細胞核無著色為陽性表達。

2.4RT-PCR檢測大鼠胃壁Cx43基因表達取胃組織30mg，置于冰上，加Trizol勻漿，按照常規(guī)操作順序提取總RNA，紫外分光光度計檢測OD260和OD280，計算總RNA的濃度及純度。

取2g總RNA，在鳥類成髓細胞瘤反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）和Oligo（dT）條件下進行反轉(zhuǎn)錄，70℃10min，4℃5min，42℃30min，95℃5min，4℃5min，獲得cDNA。

以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20L，含2LcDNA，10mol/L上下游引物各1L，5SYBRGreenPCRMasterMix10L。

根據(jù)文獻[5]設(shè)計引物。

Cx43引物序列：

上游5’-ACTTCAGCCTCCAAGGAGTTC-3’，下游5’-CATGTCTGGGCACCTCTCTTT-3’，產(chǎn)物長度80bp；以GAPDH作為內(nèi)參照。

上游5’-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGA-3’，下游5’-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3’，產(chǎn)物長度95bp。

2條引物擴增效率均為90%～100%。

GAPDH、Cx43擴增條件為：

95℃5min預(yù)變性；95℃30s，55℃30s，72℃30s，40個循環(huán)；95℃1min，55℃30s，95℃30s，1個循環(huán)。

每個樣品設(shè)立3個復(fù)孔，取均值。

將所得Ct值按照2-Ct的方法進行均一化處理后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。

實驗數(shù)據(jù)用―xs表示，所有數(shù)據(jù)剔除隨機誤差及人為因素導(dǎo)致的過高或過低的測量值，隨后進行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)分布時，采用非參數(shù)K個獨立樣本檢驗；服從正態(tài)分布時，進行方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗；各給藥組與模型組比較采用Dunnett’sT3檢驗；各給藥組之間兩兩比較采用Tukey’sMultipleComparisonTest檢驗；各給藥組之間是否有交互作用采用析因分析。

P本實驗結(jié)果表明，模型組與正常組比較慢波頻率變異系數(shù)顯著增高，各給藥組與模型組比較慢波頻率變異系數(shù)有不同程度降低，提示半夏瀉心湯及其各拆方組具有調(diào)節(jié)胃電節(jié)律的作用。

電節(jié)律紊亂的模型組其Cx43在胃組織上的分布表達顯著高于正常組，且分布不均勻，提示胃電節(jié)律紊亂引起的胃動過速可能與Cx43異常增高表達有密切關(guān)聯(lián)。

半定量分析結(jié)果顯示，各給藥組均對Cx43表達量有不同程度降低作用，辛開甘補組Cx43陽性表達顯著降低。

各給藥組與模型組比較，Cx43陽性表達均有不同程度的降低，提示各給藥組對胃組織縫隙連接Cx43的表達分布均具有不同程度降低作用。

本實驗結(jié)果還表明，半夏瀉心湯及其拆方干預(yù)可以影響Cx43mRNA的表達，各給藥組都可以有效降低胃組織Cx43mRNA的異常增高表達，其中苦降甘補組對Cx43mRNA的抑制最顯著，提示半夏瀉心湯組方抑制Cx43mRNA表達，主要通過苦降藥物與甘補藥物的協(xié)同配伍來實現(xiàn)。

相關(guān)研究表明，采用苦寒瀉下法建立的大鼠脾氣虛模型，胃肌層Cx43表達降低[8]，也提示苦瀉藥物對Cx43的表達有抑制作用。

綜合上述結(jié)果，模型組慢波頻率變異系數(shù)增高，Cx43表達增強，基于Cx43表達增高對胃腸運動有促進作用。

因此，我們推測Cx43表達異常增高會誘導(dǎo)胃電節(jié)律紊亂引起胃動過速，從而導(dǎo)致胃運動功能亢進。

半夏瀉心湯通過辛開、苦降、甘補藥物協(xié)同配伍作用從而降低Cx43的表達。

由此我們推測半夏瀉心湯方不僅能治療胃動過緩導(dǎo)致胃運動功能障礙的心下痞證，還能通過抑制Cx43過表達有效抑制胃電節(jié)律紊亂引起的胃動過速，從而改善胃運動功能亢進癥狀，對胃運動功能起雙向調(diào)節(jié)的作用。

各拆方組間協(xié)同作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

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