《蛋白抗體類生物大分子試劑的質(zhì)量表征與分析技術(shù)》

北京義翹神州科技股份有限公司蛋白/抗體類生物大分子試劑質(zhì)量表征及分析技術(shù)CONTENT義翹神州123生物大分子質(zhì)量表征概述質(zhì)量表征之理化性質(zhì)分析質(zhì)量表征之結(jié)合活性及生物活性分析4生物大分子開發(fā)中的質(zhì)量表征及應(yīng)用案例01義翹神州生物大分子質(zhì)量表征概述義翹神州結(jié)構(gòu)分析理化性質(zhì)生物活性結(jié)合活性序列與修飾肽圖（LC-MS/MS）N端和C端序列分析（LC-MS/MS）二硫鍵分析（LC-MS/MS）糖型分析，等電點，游離巰基分析二級結(jié)構(gòu)圓二色光譜（CD）高級結(jié)構(gòu)X射線衍射法（X-ray)核磁共振波譜法(NMR)冷凍電鏡濃度：UV,BCA純度：SDS,SEC-HPLC分子量：SEC-MALS粒徑及聚集狀態(tài)：DLS酶聯(lián)免疫吸附法：ELISA流式細胞術(shù)：FACS免疫組化：IHC免疫熒光：IF免疫印跡：WB免疫共沉淀：Co-IP表面等離子共振：SPR生物膜干涉：BLI補體依賴細胞毒（CDC）ADCC及ADCP細胞增殖試驗殺傷活性中和試驗細胞分泌試驗酶活性抑制血凝活性抑制生物大分子質(zhì)量分析及檢測技術(shù)蛋白表達技術(shù)平臺抗體開發(fā)技術(shù)平臺質(zhì)量表征分析技術(shù)平臺生物大分子技術(shù)平臺義翹神州義翹神州添加標題添加標題理化性質(zhì)細胞/酶活性結(jié)合活性

濃度及SDS純度檢測HPLC純度及相對分子量檢測MALS絕對分子量及聚集檢測DLS粒徑及均一性檢測ADCC&ADCP檢測CDC檢測

中和活性檢測

細胞增殖、分泌酶、激酶活性ELISA檢測WB/IP檢測IHC/IF檢測FACS檢測SPR/BLI親和力檢測02義翹神州質(zhì)量表征之理化性質(zhì)分析義翹神州添加標題0103050204定量：UV/BCA電泳純度、分子量：SDS尺寸排阻高效液相色譜純度、分子量：SEC-HPLC分子量、聚集態(tài)/碎片：SEC-MALS粒徑與粒徑分布：DLS穩(wěn)定性：凍融、加速、實時、模擬運輸穩(wěn)定性06義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步蛋白質(zhì)的定量方法原理紫外分光光度法（UV280）蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的氨基酸，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系BCA比色法在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將二價銅還原為一價銅，再與BCA產(chǎn)生紫色復(fù)合物福林-酚試劑法在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅產(chǎn)生復(fù)合物，還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍色化合物考馬斯亮藍法考馬斯亮藍G-250能與蛋白質(zhì)通過范德華相互作用形成蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍藍色復(fù)合物雙縮脲法在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與銅可產(chǎn)生紫色絡(luò)合物義翹神州純度/分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS尺寸排阻色譜法SEC-HPLC制備凝膠處理樣品樣品點樣電泳染色，脫色凝膠成像分析尺寸排阻色譜(SEC)常用于進行基于分子量的生物分子分離。通過比較待測蛋白和標準蛋白的洗脫保留時間計算相對分子量義翹神州蛋白絕對分子量聚集態(tài)和純度抗體/抗原結(jié)合比蛋白復(fù)合物分析多角度靜態(tài)光散射MALSMALS（fromwyatt)多角度靜態(tài)光散射應(yīng)用技術(shù)原理：散射光強度與摩爾質(zhì)量、濃度、折光指數(shù)增量（dn/dc）的二次方成正比：義翹神州SEC-MALS測定蛋白分子量、聚集態(tài)67.4kDa137.4kDa單體二聚體峰MW(kDa)質(zhì)量（μg）百分比%167.484.1297.22137.42.442.8Peak1Peak2MassesInjectedMass(μg)0.000.00CalculatedMass(μg)84.122.44MassRecovery(%)n/an/aMassFraction(%)97.22.8Molarmassmoments(g/mol)6.746×1041.374×105Mn(±0.154%)(±1.057%)6.756×1041.370×105Mp(±0.044%)(±1.012%)Mvn/an/a6.746×1041.374×105Mw(±0.153%)(±1.057%)6.746×1041.374×105Mz(±0.343%)(±2.363%)PolydispersityMw/Mn1.000(±0.217%)1.000(±1.494%)Mz/Mn1.000(±0.376%)1.000(±2.588%)rmsradiusmoments(nm)rn2.9(±66.6%)4.2(±215.6%)rw2.9(±66.5%)4.2(±214.6%)rz2.9(±66.4%)4.3(±213.6%)UVpeakstatisticsPeakArea%(channel1)(%)97.2352.765義翹神州添加標題添加標題DLS動態(tài)光散射技術(shù)應(yīng)用動態(tài)光散射技術(shù)

DLS干涉增強現(xiàn)象干涉減弱現(xiàn)象摘自懷雅特培訓資料技術(shù)原理：圖譜解析：粒徑與粒徑分布（均一性、純度、聚集體識別）濃度依耐性（蛋白分子自聚、臨界膠束濃度）分子間膠體相互作用義翹神州添加標題DLS測定蛋白粒徑及均一性Peak%Pd%Intensity%MassDiameter(nm)Peak1(True)11.910010059.3HPV35蛋白DLS結(jié)果X重組蛋白DLS結(jié)果分散度大，同一樣品兩次檢測差異大，樣品均一性差窄分布，樣品均一性較好義翹神州添加標題穩(wěn)定性穩(wěn)定性的研究為產(chǎn)品的生產(chǎn)、工藝、制劑處方、包裝材料、貯存、運輸條件等方面提供依據(jù)。凍融穩(wěn)定性加速穩(wěn)定性實時穩(wěn)定性模擬運輸穩(wěn)定性評價方式：外觀濃度、純度生物活性雜質(zhì)、產(chǎn)物評價指標：凍融試驗25℃加速試驗37℃加速試驗實時1年及模擬運輸試驗IL-1beta（Cat：GMP-10139-HNAE）蛋白穩(wěn)定性數(shù)據(jù)03義翹神州質(zhì)量表征之結(jié)合活性及生物活性分析義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步

酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測

免疫印記（Westernblot）檢測

免疫共沉淀（Co-IP)檢測

免疫組化（IHC）檢測

流式細胞術(shù)（FCM）檢測親和力檢測（SPR/BLI）檢測

抗體依賴的細胞介導的細胞毒性/吞噬作用ADCC&ADCP檢測

補體依賴的細胞毒性作用CDC檢測

中和活性檢測

細胞增殖、分泌、遷移酶、激酶活性結(jié)合活性生物活性義翹神州一、結(jié)合活性檢測酶聯(lián)免疫吸附法ELISAB.競爭ELISAB酶標二抗抗體藥靶點蛋白/biotin待測抗體C.夾心ELISACaptureantibodyDetectionantibody靶點蛋白SubstrateantibodyConjugatedenzymeSignalantigenA.間接ELISA服務(wù)內(nèi)容：蛋白受體、配體結(jié)合活性檢測抗原抗體結(jié)合活性檢測PK及ADA方法開發(fā)及方法學驗證試劑盒定制開發(fā)義翹神州免疫印記法WesternblotOdysseyFluorChemE化學發(fā)光(FlourChemE)Odyssey普通顯色二抗HRP標記紅外染料標記HRP標記封閉液milk

or

BSAmilkmilk

or

BSA開機需降溫，時間長圖掃描時間長無圖片黑白彩色（綠色，紅色）黑白顯色液需要不需要需要顯色需底物，自動曝光，靈敏度高無需底物，直接上機，條帶直觀可見需底物，暗室曝光，不易操作，易黑成一片信號信號不持久，膜不易長時間保存信號持久，膜可保存半年以上信號不持久，膜不易長時間保存半定量可以半定量半定量更準確不可電泳濕法轉(zhuǎn)膜結(jié)果抗體孵育分析流程：kDaAB3510055402515顯色ActinHNRNPK40——100——70——55——kDaABCD義翹神州裂解液（細胞、動物組織）proteinXproteinYmagneticbeads免疫共沉淀法Co-IP自主偶聯(lián)磁珠產(chǎn)品，讓您檢測快速省時免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。1.偶聯(lián)蛋白的磁珠：ProA、ProG、ProA/G、ProL及其他蛋白2.偶聯(lián)抗體的磁珠——可定制磁珠試劑盒自主研發(fā)磁力架產(chǎn)品，吸力強，耗時短MAGS001MAGS003義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步免疫組化法IHC生物組織自動脫水機（Leica-TP1020）石蠟包埋機（TaiVa-TB-718）石蠟切片機（Leica-RM2235）冰凍切片機（Thermo-NX50）共聚焦熒光顯微鏡（Nikon-A1）全片掃描成像系統(tǒng)（KF-PRO-400）樣本處理脫水石蠟包埋冰凍切片石蠟切片切片成像義翹神州添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步IHC單染檢測：利用免疫學中抗原抗體特異性結(jié)合的原理，來確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及定量的研究。HE染色檢測：HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。免疫組化多重染色檢測：在同一組織切片樣本上對多個靶標進行區(qū)別標記。特殊染色檢測：包括:膠原纖維染色、肌肉組織染色、脂肪染色、糖原染色(PAS)等。細胞固定組織石蠟切片白片石蠟包埋塊細胞可爬片制備細胞蠟塊足量的10%中性福爾馬林固定24*75mm尺寸大小的常規(guī)切片，厚度4μm通用型常規(guī)大小的石蠟包埋塊樣本類型染色方式義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步流式細胞術(shù)FCM細胞表面抗原檢測細胞增殖檢測細胞凋亡檢測胞內(nèi)細胞因子檢測流式細胞術(shù)（FlowCytometry）利用流式細胞儀檢測細胞內(nèi)特異標記的熒光信號，從而測定細胞的多種生化物質(zhì)（如膜表面受體、抗原、離子或DNA/RNA表達等）特性的方法，同時也是一項可以把具有相同熒光信號特性的某些細胞亞群從多細胞群體中分離和富集出來的細胞分析技術(shù)。細胞表面抗原檢測細胞內(nèi)抗原、細胞因子檢測細胞活性檢測細胞凋亡檢測細胞增殖檢測服務(wù)項目ADCP效率檢測抗體篩選多因子檢測流式分選……義翹神州添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步表面等離子共振技術(shù)-SPR

生物膜層光學干涉-BLI

Biacore動態(tài)、實時傳感圖OctetRed檢測過程大分子相互作用分析義翹神州濃度定量抗體篩選、表征Fc受體蛋白與抗體親和力測定表位分析大分子/小分子相互作用技術(shù)優(yōu)勢：無須標記靈敏度高實時監(jiān)測精確的動力學數(shù)據(jù)檢測類型：樣品要求：01樣品充分水溶，處于均一的、不聚集的狀態(tài)02純度（>90%），蛋白濃度>0.2mg/mL；明確等電點/分子量03告知抗體亞型及蛋白標簽類型04分析物樣品中不能含有甘油、蔗糖、咪唑等高折光的成分；氨基偶聯(lián)的配體溶液中不能含有Tris、NaN3、甘氨酸等成分義翹神州二、基于細胞的生物活性檢測添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步細胞增殖細胞分泌補體依賴的細胞毒性抗體依賴的細胞介導的細胞毒性/吞噬ADCC&ADCPCDC義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步ADCC/ADCPCDCJToxicolPathol.2015Jul;28(3):133–139.抗體介導的免疫效應(yīng)義翹神州添加標題添加標題ADCP，抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（Antibody-DependentCellularPhagocytosis）ADCC，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（Antibody-DependentCell-mediatedCytotoxicity）1、ADCC&ADCPPBMC或NK細胞接近真實情況細胞來源有限、制備過程繁瑣、實驗變異性大，背景讀值高等傳統(tǒng)方法穩(wěn)定表達FcγRIIIa、FcγRIIa細胞系均質(zhì)檢測，簡單方便，減少實驗組間變異性生物發(fā)光法，靈敏，信噪比高報告基因法義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步抗ErBb2抗體ADCC(靶細胞：BT474)抗CD38抗體ADCP(靶細胞：Daudi)義翹神州從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步2、CDC檢測抗體是否能夠介導CDC，分析抗體介導CDC活性的強弱，已成為抗體藥物研發(fā)及其質(zhì)量控制過程中至關(guān)重要的一步。CDC，補體依賴的細胞毒性作用（ComplementDependentCytotoxicity）義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步Anti-EGFR靶細胞：A431細胞Anti-CD20靶細胞：Daudi細胞義翹神州蛋白生物活性細胞因子酶、激酶催化中心結(jié)合中心義翹神州細胞因子本質(zhì)低分子質(zhì)量蛋白或多肽產(chǎn)生作用由免疫原、絲裂原或其它刺激劑誘導多種細胞合成并分泌途徑自分泌旁分泌內(nèi)分泌用于細胞間信號傳導和相互作用分類白細胞介素（IL）干擾素（IFN）腫瘤壞死因子（TNF）集落刺激因子（CSF）趨化因子生長因子參與免疫細胞的分化與激活類胰島素生長因子(IGF)表皮生長因子(EGF)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)有胰島素樣功能，促進細胞分化和增殖粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)粒細胞集落刺激因子(G-CSF)刺激造血祖細胞增殖、分化TNF-αTNF-β促炎性細胞因子Ⅰ型Ⅱ型IFN-γIFN-αIFN-β巨噬細胞、DC、骨髓單核細胞NK、Th1、T、B1、細胞因子類義翹神州添加標題IL4R增殖抑制實驗IL1β促因子分泌C5a因子促酶釋放IL4細胞增殖活性義翹神州添加標題2、酶、激酶SEActivesiteESP1P2E＋＋MMP2酶活性，workConc:0.2μg/mL備注：E4，F(xiàn)4是復(fù)孔；G4是空白對照義翹神州添加標題添加標題PrincipleoftheADP-Glo?KinaseAssay（Promega）GSK3β激酶活性04義翹神州生物大分子開發(fā)中的質(zhì)量表征及應(yīng)用案例義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步案例01：針對新冠SpikeS1蛋白中和抗體的開發(fā)123抗體質(zhì)量分析及鑒定免疫原SARS-CoV-2SpikeS1的理化性質(zhì)分析

動物免疫及抗體制備篩選流程義翹神州添加標題免疫原SARS-CoV-2SpikeS1的理化性質(zhì)分析

SARS-CoV-2S1protein,HisTagonSDSunderreducing(R)condition.Thepurityoftheproteinisgreaterthan90%PeakRadius(nm)%Pd%Intensity%Mass%NumberPeak1(True)5.310.89099.8100Peak2(True)324.413.3100.20#RT(min)峰面積(mAU·s)峰面積%峰高(mAU)對稱性峰寬(min)信號114.49720127.15100305.0061.27939.483DAD1AMakerSARS-CoV-2S1

SDS純度結(jié)果HPLC-SEC純度結(jié)果DLS粒徑檢測結(jié)果義翹神州添加標題SEC-MALS檢測結(jié)果ELISA結(jié)合活性檢測結(jié)果SARS-CoV-2S1protein,HistagELISAImmobilizedHumanACE2,FcTag(Cat:10108-H05H)at2μg/mL(100μL/well)canbindSARS-CoV-2S1protein,HisTag(Cat:40591-V08H),theEC50is330ng/mL.Molarmassmoments(g/mol)1.075×105Mn(±0.277%)1.080×105Mp(±0.276%)Mvn/aMw1.076×105(±0.276%)Mz1.076×105(±0.616%)PolydispersityMw/Mn1.000(±0.391%)Mz/Mn1.001(±0.676%)rmsradiusmoments(nm)rn6.3(±24.9%)1.076×105rw6.3(±24.8%)rz6.3(±24.7%)義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步BLI表征抗體親和力：

SARS-CoV-2S1vsAntibodyAb-01KD(M)=

5.15E-11Ab-02KD(M)=6.54E-11LoadedBiotinylatedRecombinantSARS-CoV-2S1

protein,HisTag(Cat:40591-V08H-B)onSABiosensor,canbindAb-01

withanaffinityconstantof51.5pMasdeterminedinaBLIassay(SartoriusOctetRed384).LoadedBiotinylatedRecombinantSARS-CoV-2S1

protein,HisTag(Cat:40591-V08H-B)onSABiosensor,canbindAb-02

withanaffinityconstantof65.4pMasdeterminedinaBLIassay(SartoriusOctetRed384).抗體質(zhì)量分析及鑒定義翹神州Ab-01,withnegativecontrolAb-02,withnegativecontrolFlowcytometricanalysisof

SARS-COV-2SpikeoverexpressedHEK293Cells

andnegativecontrolwerestainedwithpurified

anti-SARS-COV-2SpikeNeutralizingMAb,thenaFITC-conjugatedsecondstepantibody.Thefluorescencehistogramswerederivedfromgatedeventswiththeforwardandsidelight-scattercharacteristicsofintactcells.FACS檢測抗體與過表達SARS-CoV-2Spike細胞的結(jié)合Negative

controlSARS-COV-2SpikeoverexpressedHEK293CellsNegative

controlSARS-COV-2SpikeoverexpressedHEK293CellsAb-01:Ab-02:ImmunochemicalanalysisofSpikeoverexpresssedHEK293Cellsandnegativecontrolwerestainedwithpurifiedanti-SARS-CoV-2SpikeMab,thenaHRP-conjugatedsecondstepantibody.IHC檢測抗體與過表達SARS-CoV-2Spike細胞的結(jié)合義翹神州添加標題添加標題非競爭競爭待測抗體Anti-His/HRPS1待測抗體Anti-His/HRPACE2HisACE2HisS1ELISA方法檢測抗體中和活性SerialdilutionsofAnti-SARS-CoV-2antibodywasaddedACE2/S1

bindingreactions.Thesignalwasneutralizedbyincreasingconcentrationsofantibody.Thehalfmaximalinhibitoryconcentration(IC50)wasdetected.義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步新冠假病毒的包裝使用HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)載體轉(zhuǎn)染293細胞后，包裝成新冠Spike假病毒（Cat:

PSV001），表面表達新冠Spike蛋白，并攜帶有熒光素酶報告基因。

Transfection&PackagingHarvestPseudovirus

Preparationstagepackagingplasmids293cellsTransferandPackagingplasmidsHarvestPseudovirus假病毒方法檢測抗體中和活性義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步新冠Spike假病毒與待檢樣品孵育后侵染293T-ACE2細胞，采用化學發(fā)光法檢測Luciferase發(fā)光值RLU，根據(jù)Luciferase發(fā)光值計算待檢樣品的假病毒中和抑制率，評價待檢樣品的中和效果。中和檢測原理示意圖義翹神州案例02：上市藥物IL-1RAP:IL-1R1:IL-1α

信號通路功能驗證添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步TIRD1D2D3IL-1R1IL-1αIL-1RAPActiveIL-1Rcomplex＋signallingTIRTIRTIRTIR義翹神州添加標題SDS蛋白純度IL-1RAP蛋白純度及活性驗證#RT(min)Area%Height(mAU)Width(min)111.1344.06712.9861.941211.7285.17412.0411.08313.26890.759235.0713.651IL-1RAP

protein,FcTagonSDSunderreducing(R)condition.Thepurityoftheproteinisgreaterthan90%.SEC-HPLC蛋白純度義翹神州添加標題MeasuredbyitsbindingabilityinafunctionalELISA.WhenrecombinanthumanIL-1RAP/IL-1R3Fc(Cat:10121-H02H)isimmobilizedat30nM(100μL/well),inthepresenceofrecombinanthumanIL-1α(Cat:10128-HNCH),itbindstorecombinanthumanIL-1R1histag(Cat:10126-H08H)withanEC50

of17.1nM.IL-1RAP細胞活性IL-1RAP:IL-1R1:IL-1α

ELISA活性Measured

by

its

ability

to

inhibit

IL-1α-induced

IL-8

secretion

in

HepG2

human

hepatocellular

carcinoma

cells

in

the

presence

of

1

μg/mL

of

recombinant

human

IL-1

R2

(Cat:10111-H08H)

and

50

pg/mL

rhIL-1α(Cat:10128-HNCE).義翹神州添加標題添加標題從研發(fā)到生產(chǎn)、質(zhì)控，貫穿生物試劑及醫(yī)藥研發(fā)的每一步兩款上市藥物與IL-1RAP蛋白親和力驗證Drug-AvsIL-1RAPDrug-BvsIL-1RAPImmobilized

humanIL-1RAP/IL-1R3Fc(Cat:10121-H02H)on

CM5

chip,

can

bind

drug-A

with

an

affinity

constant

of

0.48

nM

as

determined

in

SPRassay

(BiacoreT200)

.Imm