3.1重組DNA技術的基本工具課件高二下學期生物人教版選擇性必修3(1)2

3.1重組DNA技術的基本工具第3章基因工程1944年艾弗里證明了遺傳物質是DNA。1961年尼倫伯格和馬太破譯了第一個編碼氨基酸的密碼子。1970年，發(fā)現(xiàn)了第一個限制性核酸內切酶。1972年，伯格成功構建了第一個體外重組DNA分子。1982年，第一個基因工程藥物批準上市。1953年沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結構模型。1967年，科學家發(fā)現(xiàn)，質粒有自我復制能力，可以轉移。20世紀70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。1973年，基因工程正式問世。1985年，穆里斯等人發(fā)明PCR?；蚬こ贪l(fā)展歷程Historyofgeneticengineering是指按照人們的愿望，通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。從技術操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作重組DNA技術?；蛑亟M②操作水平：③操作結果：①操作原理：DNA分子水平定向地改造生物遺傳性狀，獲得人們所需的生物類型和生物產品基因工程環(huán)狀病毒侵染的番木瓜番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵害。當番木瓜受到這種病毒感染后，產量會大大下降。科學家通過精心設計用“分子工具”培育出了轉基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？載體——“分子運輸車”限制性內切核酸酶

——“分子手術刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基本工具：1.來源：2.功能：3.作用的化學鍵：磷酸二酯鍵一“分子手術刀”——限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）主要從

中分離純化出來，目前分離出數(shù)千種。識別雙鏈DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵原核生物注意：限制酶是一類酶，而不是一種酶。（專一性）EcoRⅠ：專一識別GAATTC的序列，并使G和A之間的磷酸二酯鍵斷開。幾種常見的限制酶的識別序列及切割位點：①大多數(shù)限制酶的識別序列由

個核苷酸組成，少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。

②限制酶的名字的由來P726EcoRⅠBamHⅠTaqⅠHindⅢEcoRⅠ種加詞頭兩個字母菌株型號數(shù)字表示分離出來的第幾種限制酶屬名首字母大腸桿菌R型菌株分離出來的第一種限制酶限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線(如圖)，中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向對稱重復排列的，稱為回文序列。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’能被限制性酶特異性識別的序列一般都是回文序列：即正反讀順序相同，圍繞一條軸線對稱排列。讀：5’→3’【反饋練習】下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（）A．GAATTC

B．GGGGCCCC

CTTAAG

CCCCGGGGC．CTGCAG

D．CTAAATC

GACGTC

GATTTAGD一“分子手術刀”——限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）4.切割結果：EcoRⅠ中軸線粘性末端平末端SamⅠ產生黏性末端或平末端【問題探究1】請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端。黏性末端？…CTAG…TTAA…TCGA…CTAG【思考】同種限制酶切割產生的黏性末端是否相同？

不同限制酶切割產生的黏性末端是否一定不同？相同可能會相同【問題探究2】選擇限制酶的注意事項(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類。①應選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶。②不能選擇切割位點位于目的基因內部的限制酶。③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用

和

兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切割位點)。如圖甲可選擇

。如圖甲不能選擇

。PstⅠSmaⅠPstⅠEcoRⅠ【問題探究3】為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？含某種限制酶的細菌的DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。拓展思維：1.要想從一個DNA分子中獲得某個特定的基因需要有幾個酶切位點？產生幾個末端？

24CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT使用EcoRⅠ酶剪切目的基因識別序列GAATTC在切割含目的基因的DNA分子時，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內切酶切割，會產生4個末端。G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

G

AA

TT

C

GGC

TT

AA

用同種限制酶切割(EcoRⅠ)拓展思維：2.把兩種來源不同的DNA進行重組，應該怎樣處理？

缺口怎么辦？“分子縫合針”——2.分類：將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。1.作用:類型來源作用相同點差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端既能連接黏性末端又能連接平末端(效率較低)二DNA連接酶重組DNADNA連接酶★思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶回顧：DNA聚合酶的作用DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵DNA連接酶與DNA聚合酶的比較：基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”三1.作用：將目的基因送入受體細胞

2.最常用的載體——質粒質粒：一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外，并具有自我復制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質?；蜻M入受體細胞的載體——“分子運輸車”三★思考：質粒為什么適合作為載體？作為載體需要具備那些條件？質粒3.載體需具備的條件—供外源DNA片段（目的基因）插入其中?真正被用作載體的質粒，都是在天然質粒的基礎上進行過人工改造的。②能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。①有一個至多個限制酶切割位點③具有標記基因——便于重組DNA分子的篩選——鑒別和篩選含有目的基因的受體細胞標記基因的作用導思考：噬菌體或某些動植物病毒作為載體，其原理是

。病毒對宿主細胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對宿主細胞的侵染性物種（組織）特異若用家蠶作為某基因表達載體的受體細胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細胞是細菌，而不是家蠶基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”三來源不同，在大小、結構、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差別4.種類：質粒(常用）、噬菌體、動植物病毒重組DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能因為基因的長度一般在100個堿基對以上。1.“分子手術刀”——1）來源：

2）作用：

3）作用結果：2.“分子縫合線”——1）作用：

2）分類：3.“分子運輸車”——1）作用：

2）種類：

3）應具備條件：

限制酶

產生黏性末端、平末端

DNA連接酶將不同的DNA片段連接起來磷酸二酯鍵將外源基因送入受體細胞質粒（最常用）、噬菌體、動植物病毒E.ColiDNA連接酶、T4DNA連接酶（來源、區(qū)別？）主要從原核生物中分離純化出來。載體識別雙鏈DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯鍵斷開。作用部位：②能在細胞中進行自我復制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。①有一個至多個限制酶切割位點③具有標記基因——便于重組DNA分子的篩選——供外源DNA片段（目的基因）插入其中小結：基因工程的基本工具【探究?實踐】DNA的粗提取與鑒定一、實驗原理1.粗提取DNA的原理DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法去除其他成分，對DNA進行提取。①在酒精溶液中的溶解性：②在NaCl溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。2.鑒定DNA的原理在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色。DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。）二、材料用具1.選材：2.試劑：①研磨液②體積分數(shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——溶解并提取DNA——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用稱取

，切碎，放入研缽，倒入

，充分研磨。在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4℃冰箱中靜置后取

；或將研磨液倒入塑料離心管中離心，取

。在上清液中加入體積相等的、

溶液,靜置2~3min，溶液中出現(xiàn)的

就是粗提取的DNA。將絲狀物或沉淀物溶于

溶液中，加入

試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min2.去除雜質——3.DNA的析出——4.DNA的鑒定——1.破碎細胞——對照組：如何設置？洋蔥研磨液上清液上清液預冷的酒精白色絲狀物二苯胺在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min三、方法步驟用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或將溶液倒入塑料離心管中離心，取沉淀物晾干。2mol/L的NaCl

DNA的粗提取與鑒定實踐·探究

（1）選什么樣的材料實驗更易成功？用洋蔥做材料，為什么要充分研磨？（2）豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？操作時如何防止血液凝固？（3）如果用雞血動物細胞做材料，也需要研磨裂解釋放細胞中的DNA嗎？豬血（哺乳動物的成熟紅細胞）無細胞核，不適合；雞血中紅細胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合.含DNA的生物材料都可以，選取DNA含量相對較高的生物組織，成功率更大。充分研磨，可以破壞細胞壁，裂解細胞，釋放DNA。加入清水，讓細胞吸水脹破，釋放DNA。思考與討論：雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。1.DNA連接酶是重組DNA技術常用的一種工具酶，以下說法正確的是

(

)A.能連接DNA分子雙鏈堿基對之間的氫鍵B.能將單個脫氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵C.能連接用同種限制酶切開的兩條DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵D.只能連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，不能連接雙鏈DNA片段的平末端C2.在重組DNA技術中，將外源基因送入受體細胞的載體可以是（

）A.大腸桿菌的質粒B.切割DNA分子的酶C.DNA片段的黏性末端D.用來識別特基因的DNA探針A【課堂檢測】3.圖1為某種質粒結構簡圖，圖2表示某外源DNA上的目的基因，小箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位點。下列有關敘述錯誤的是(

)A.在基因工程中若只用一種限制酶完成對質粒和外源DNA的切割，則可選EcoRⅠB.如果將一個外源DNA分子和一個質粒分別用EcoRⅠ酶切后，再用DNA連接酶連接，形成一個含有目的基因的重組DNA，此重組DNA中EcoRⅠ酶切點有1個C.為了防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理D.質粒是一種結構很小的、能自主復制的環(huán)狀DNA，是基因工程中最常用的載體B4.某細菌質粒上有標記基因如圖所示，通過標記基因可以推知外源基因（目的基因）是否轉入成功。外源基因插入的位置不同，細菌在培養(yǎng)基上的生長情況也不同，如圖所示是外源基因插入位置（插入點有a、b、c）示意圖，請根據(jù)表中提供的細菌生長情況，推測①②③三種重組后細菌的外源基因插入點，正確的一組是（

）

插入點細菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上的生長狀況細