分子發(fā)光分析法(精)

第五章

分子發(fā)光分析法

一、基本原理二、化學發(fā)光分析的特點三裝置與技術(shù)第三節(jié)

化學發(fā)光分析法2024/9/5一、基本原理1.化學發(fā)光反應(yīng)

在化學反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h

（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物；（2）化學發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當

E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應(yīng)持續(xù)進行；化學發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2024/9/52.化學發(fā)光效率化學效率：發(fā)光效率：時刻t的化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt

分析物參加反應(yīng)的速率；2024/9/53.化學發(fā)光強度與化學發(fā)光分析的依據(jù)在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學反應(yīng)：

dc/dt=Kc；K為反應(yīng)速率常數(shù)。定性依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：2024/9/54.化學發(fā)光反應(yīng)的類型（1）氣相化學發(fā)光反應(yīng)a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3

→NO2*NO2*→NO2+h

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

SO2

+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h

最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；2024/9/5

O3

→O2+O（1000C石英管中進行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h

發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：2024/9/5c.乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng/cm-3

～1g/cm-3；2024/9/5（2）火焰中的化學發(fā)光反應(yīng)

在富氫火焰中，也存在著很強的化學發(fā)光反應(yīng)；a.一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h

發(fā)射光譜范圍：660～770nm；

最大發(fā)射波長：690nm；

在富氫火焰中：

NO2+2H→NO+H2O該反應(yīng)十分迅速；2024/9/5b.硫化物

揮發(fā)性硫化物SO2、H2S

、CH3SH、CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強的化學發(fā)光（藍色）：

SO2

+2H2→S+2H2OS+S→2S2

*

S2*→S2+h

發(fā)射光譜范圍：350～460nm；

最大發(fā)射波長：394nm；

靈敏度：0.2ng/cm-3；

發(fā)射光強度與硫化物濃度的平方成正比。2024/9/5（3）液相中的化學發(fā)光反應(yīng)機理研究較多，在分析中應(yīng)用最多；可測痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；化學發(fā)光反應(yīng)效率：0.15～0.05；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：2024/9/55.化學與生物發(fā)光分析的應(yīng)用（1）該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子?？蓽y痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可檢測低至10-9mol/L的H2O2；（3）間接測定某些生物試樣

氨基酸+O2

酮酸+NH3

+H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖+O2

+H2O

葡萄糖酸+H2O2通過測定生成的H2O2，確定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶2024/9/5

草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應(yīng)體系，可發(fā)出很強的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。2024/9/5生物發(fā)光分析應(yīng)用1在pH7～8；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與磷酸三腺甙(ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺甙(AMP)熒光素和熒光素酸的復合物和鎂的焦磷酸鹽(ppi)：ATP+LH2

+E+Mg2+

AMP·LH2·E+Mgppi

+2H+pH7-8復合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學發(fā)光：

AMP·LH2·E+O2[氧化熒光素]*+AMP+CO2+

H2O[氧化熒光素]*氧化熒光素+h

最大發(fā)射波長562nm；2024/9/5生物發(fā)光分析應(yīng)用2煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在細菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸(FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應(yīng)：NADH

+FMA

+H+

NAD+

+FMNH2NADH脫氫酶FMNH2+RCHO

+O2

FMN+RCOOH+H2O+h

黃素酶最大發(fā)射波長495nm；2024/9/5二、特點1.靈敏度極高

例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學發(fā)光分析，可測定210-17。Mol/L的ATP，即可檢測出一個細菌中的ATP含量2.儀器設(shè)備簡單不需要光源、單色器和背景校正；3.發(fā)射光強度測量無干擾無背景光、散射光等干擾；4.線性范圍寬5.分析速度快缺點：可供發(fā)光用的試劑少；發(fā)光反應(yīng)效率低（大大低于生物體中的發(fā)光）；機理研究少。2024/9/52024/9/52024/9/5三、裝置與技術(shù)

裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測器信號放大器顯示與記錄

發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動注射的方式進行：

靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合，測最大光強度或總發(fā)光量；試樣量小，重復性差；

流動注射方式：用蠕動泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定光強度；