分子診斷技術在病原微生物檢測中的應用

分子診斷技術在病原微生物檢測中的應用微生物包括細菌、病毒、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體、放線菌和真菌以及一些小型的原生生物等在內的一大類生物群體，它們個體微小、種類繁多、與人類關系密切，廣泛用于食品、醫(yī)藥、工農業(yè)生產、環(huán)保等諸多領域。從醫(yī)療領域的角度來看，通過積極做好對于病原微生物的科學檢測，醫(yī)療人員可以依據(jù)檢測結果有效實現(xiàn)對于疾病的診療工作，這對人民群眾身體健康的保障具有良好的促進作用。一、高通量測序高通量測序技術又稱“下一代”測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。高通量測序主要分為第二代邊合成邊測序、第三代單分子測序以及第四代納米孔測序等三類。在臨床領域中該技術具有較為明顯的技術應用優(yōu)勢。對于結核病患者而言，由于結核桿菌痰涂片菌陽率低而痰培養(yǎng)耗時又長并且臨床用藥后影響檢出，嚴重影響了結核的診斷和治療，而高通量測序技術的應用可以實現(xiàn)結核的早期診斷，對于患者后續(xù)診療工作具有良好的促進作用。與此同時研究表明，該技術的合理應用有利于幫助醫(yī)療衛(wèi)生部門合理實現(xiàn)對于流行性疾病暴發(fā)的科學防控。高通量測序技術的應用對于操作儀器設備和操作人員的專業(yè)能力與實踐經驗都具有較高的要求，相信在未來應用會越來越廣泛。二、核酸適配體技術核酸適配體是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA）。通常是利用體外篩選技術——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術，從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。作為病原微生物檢測過程中的重要技術。核酸適配體技術在臨床工作中的應用較為廣泛。核酸適配體技術主要通過技術手段對于樣本中的蛋白、酶、以及小分子物質等寡核酸片段進行獲取。該技術的應用包括擴增、調節(jié)以及分離、結合以及洗脫等五個環(huán)節(jié)。在此過程中，作為重要的組成環(huán)節(jié)之一，分離環(huán)節(jié)可以有效實現(xiàn)對于適配體靶分子的合理篩選。鑒于適配體的親和力較強且修飾難度偏低，因此，其可以在特定蛋白的適配體中進行大面積應用。該技術在臨床過程中展現(xiàn)出廣闊的應用前景，在未來該技術有望取代抗體檢測技術。從現(xiàn)有研究的角度分析，近年來基因治療與特異性傳遞系統(tǒng)的發(fā)展均為該技術的蓬勃發(fā)展提供了強有力的保障。三、數(shù)字PCR技術數(shù)字PCR即（dPCR)，它是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量。該技術主要借助了微球乳糜液化作用進行檢測。通過將乳糜液在芯片微孔中進行分散，有利于確保每個芯片微孔中都存在一個核酸模板，結合相應的染料與試劑后微孔所釋放的光信號進行捕獲和檢測。研究人員表示，通過相關檢測工作的全面落實，實現(xiàn)對靶核酸模板的檢出。在檢測期間通過對兩種信號的比例與數(shù)目進行統(tǒng)計，檢測人員可以得到明確的絕對定量。實踐表明該技術的優(yōu)勢在于其擺脫了定量PCR在檢測期間必須依靠標準曲線的問題，且降低了對于模板Ct值的依賴性。就目前而言，該技術憑借自身優(yōu)勢在臨床檢測過程中得到了廣泛的應用，例如:在對巨細胞病毒、口腔病毒以及牛丘性疹性口炎病毒的檢測等。四、基因芯片技術基因芯片技術是同時將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性對DNA樣品的序列信息進行高效的解讀和分析，基因芯片技術主要從核酸分子雜交這一技術理論發(fā)展而來。在臨床過程中，基因芯片可以通過特殊的形式將核酸探針分子排列至經過處理的硝酸纖維素膜表面。在此過程中，以光導原位合成法的應用較為廣泛。排列完成后，可以使用計算機軟件對于樣品的信號進行判斷并依據(jù)其所發(fā)出的信號強弱對樣品中是否存在病原微生物進行判斷。（五）隨機擴增多態(tài)性DNA技術RAPD技術建立于PCR技術基礎上，在對病原微生物進行檢驗的過程中，RAPD可以在基因組DNA區(qū)域中有效實現(xiàn)對于PCR的擴增。但是，在應用該物質的過程中需要特別注意，其對于溫度有著嚴格的要求，需要處于低復性溫度下。為了有效實現(xiàn)對于檢測期間菌株基因組DNA特點的熟悉，相關檢測人員需要合理做好對于脈沖場凝膠電泳的妥善應用。實踐表明通過相關技術的合理應用，有利于檢測人員有效實現(xiàn)多態(tài)性檢測工作的開展，對于菌株分子分型鑒定具有良好的促進作用。不過，在檢測期間，其對于相關對象的聚合酶類型指標的要求相對較高。（六）DNA傳感器技術DNA傳感器器以DNA為敏感元件，通過換能器將DNA與DNA、DNA與RNA與DNA與其它有機無機離子之間的作用的生物學信號轉變?yōu)榭蓹z測的光、電、聲波等物理信號。近年來，DNA傳感器在基因診斷、環(huán)境監(jiān)控、藥物研究等領域的應用研究受到廣泛重視。應用該技術對病原微生物進行檢測的過程中，檢測人員往往需要在傳感器中置入一條單鏈DNA，隨后檢測人員可以使用相關傳感器上的單鏈DNA與互補單鏈DNA進行雜交的方式對于樣本的病原微生物進行檢測。在這一檢測過程中，相關人員需要對于檢測信號進行關注。（七）核酸等溫擴增技術目前在臨床和現(xiàn)場病原微生物快速檢測中具有良好發(fā)展前景的核酸等溫擴增技術是環(huán)介導等溫擴增(LAMP)。LAMP是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶在等溫條件保溫30~60min，完成核酸擴增反應，產物利用熒光或濁度檢測進行定量分析。該技術不依賴專門儀器，不需要熱循環(huán)，擴增產物可通過肉眼或濁度計判斷，靈敏度和特異性均優(yōu)于常規(guī)PCR，成本遠低于定量PCR，但靶序列最好控制在300bp以內，同時由于該技術靈敏度高，極易被污染而造成高假陽性等問題。目前，LAMP技術在丙型肝炎病毒、乙腦病毒、甲型流感病毒和腮腺炎病毒，以及細菌、支原體等檢測領域已得到廣泛應用。（八）多重PCR技術在常規(guī)PCR基礎上通過增加引物對數(shù)，衍生出多重PCR技術。常規(guī)PCR僅采用一對引物，而多重PCR則可在同一個反應體系中擴增多個目的基因。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定，也廣泛應用于某些遺傳病及癌基因的分型鑒定，如肝炎病毒、腸道致病性細菌、性病、戰(zhàn)傷細菌及生物戰(zhàn)劑細菌和需特殊培養(yǎng)的無芽孢厭氧菌檢測等。（九）定量PCR技術該技術利用熒光染料或熒光探針，對擴增過程中熒光信號進行實時監(jiān)測，通過標準曲線準確定量樣品初始DNA拷貝數(shù)。該技術的核酸擴增和檢測在同一體系中進行，避免了開蓋檢測造成的污染；產物無需電泳，特異性好、靈敏度和自動化程度高；具有可與生物芯片或免疫磁珠等技術聯(lián)用等優(yōu)勢。定量PCR技術已成為臨床病原微生物檢測的常規(guī)手段之一，廣泛用于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒和流感病毒等檢測，但如何進一步加強該技術的質量監(jiān)管體系建設、減少或抑制操作過程中的干擾因素等，是擺在其面前的主要挑戰(zhàn)。該技術主要分為雙鏈摻入法、Taqman探針、分子信標和雙雜交探針等。隨著分子診斷技術的合理應用與普及，我國醫(yī)學領域對病原微生物的檢測綜合水平得到了顯著