基因工程的基本操作程序課件

基因工程的基本操作程序1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作過程目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。（2）沒有翻譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因。基因的種類目的基因的獲取基因工程的基本操作程序非編碼區(qū)編碼區(qū)下游終止子編碼區(qū)上游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)非編碼區(qū)編碼區(qū)啟動子啟動子：基因首端,與RNA聚合酶結(jié)合,起始轉(zhuǎn)錄。終止子：基因尾端,阻止RNA聚合酶移動，使轉(zhuǎn)錄終止。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)基因工程的基本操作程序能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)基因工程的基本操作程序(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的基因（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成目的基因的獲取基因工程的基本操作程序1.基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因種類部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫從基因文庫中直接獲取基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序（一）基因文庫的構(gòu)建（1）基因組文庫的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成與載體連接導(dǎo)入受體菌群mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫基因工程的基本操作程序1、概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)通過這項技術(shù)可在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2、原理：DNA復(fù)制利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因基因工程的基本操作程序4、條件：模板DNA(需含有目的基因)

四種脫氧核苷酸(dNTP)

熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）溫度控制引物：與目的基因的起始段互補(bǔ)3、前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物PCR基因工程的基本操作程序IMN變性復(fù)性延伸PCR基因工程的基本操作程序5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1、變性(90---95度)：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2、復(fù)性（55---60）：引物與兩條單鏈通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合；3、延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，從5′端→3′端進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5、擴(kuò)增過程PCR基因工程的基本操作程序PCR技術(shù)擴(kuò)增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，從引物的______________________延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈5′端→3′端基因工程的基本操作程序DNA合成儀蛋白質(zhì)的氨基酸順序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推測推測合成

當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。DNA合成儀化學(xué)方法人工合成基因工程的基本操作程序1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________?！?/p>

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的基本操作程序質(zhì)粒目的基因限制酶DNA連接酶重組DNA基因工程的基本操作程序基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。基因工程的基本操作程序

科學(xué)家在培育抗蟲棉時，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料:基因工程的基本操作程序基因表達(dá)載體的組成：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因基因工程的基本操作程序基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素

（1）基因的特點(diǎn)：如果一個來自動物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閯游镏袃?nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如果是一個糖蛋白，那么該基因在原核生物細(xì)菌中表達(dá)出來的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細(xì)菌無這些細(xì)胞器。（2）要選擇強(qiáng)啟動子或組織特異性啟動子。啟動子有強(qiáng)有弱，選擇強(qiáng)啟動子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個組織表達(dá)，如只在植物種子中表達(dá)，就要選擇種子中特異表達(dá)的啟動子。（3）要有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蛑参锛?xì)胞：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；基因槍法；花粉管通道法動物細(xì)胞：顯微注射法；微生物：Ca2+處理法。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法——采用最多農(nóng)桿菌特點(diǎn)：感染雙子葉植物和裸子植物；其Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體的DNA上。過程：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的DNA表達(dá)受體細(xì)胞（植物細(xì)胞）基因工程的基本操作程序基因槍法——單子葉常用利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將金屬顆粒打入受體細(xì)胞，其表面包裹有表達(dá)載體DNA，進(jìn)而目的基因與受體細(xì)胞基因整合并表達(dá)。基因工程的基本操作程序

花粉管通道法——中國獨(dú)創(chuàng)，抗蟲棉花粉形成的花粉管還未融合前，剪去柱頭，滴加DNA，使目的基因借助花粉管進(jìn)入受體細(xì)胞?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蝻@微注射法過程：將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射胚胎發(fā)育獲得具有新性狀的個體受體細(xì)胞（動物細(xì)胞）基因工程的基本操作程序Ca2+處理過程：Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA受體細(xì)胞（微生物細(xì)胞）基因工程的基本操作程序目的基因的檢測與鑒定檢測與鑒定的目的目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性檢測:分子水平是否插入目的基因——DNA水平是否轉(zhuǎn)錄——RNA水平是否翻譯——蛋白質(zhì)水平鑒定:個體水平

抗性、天然活性基因工程的基本操作程序檢測目的基因是否插入了轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)分子水平的檢測——分子雜交技術(shù)探針DNA——DNA探針DNA——RNA抗原——抗體目的基因(DNA，Pr)