余功臣分子克隆

分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)用生物技術(shù)08012008304201308余功臣2011年5月22日實(shí)驗(yàn)是由小組成員集體完成，實(shí)驗(yàn)報(bào)告以及結(jié)果分析由個(gè)人完成。小組成員：余功臣、晏星、何一鳴、伍良偉。試驗(yàn)時(shí)間由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子雜交和基因表達(dá)檢測三大部分的實(shí)驗(yàn)。下列實(shí)驗(yàn)報(bào)告中的實(shí)驗(yàn)試劑具體成分以及配置方式均未列出，詳見《分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊》附錄。一．將M812載體上的水稻DNA片段亞克隆于pUC19載體上摘要運(yùn)用堿裂解法抽提質(zhì)粒載體pUC19和帶有水稻目的DNA片段M812的質(zhì)粒pU1301，用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量，用限制性內(nèi)切酶Bam=1\*ROMANI和Kpn=1\*ROMANI處理pU1301和pUC19，將純化的載體pUC19與回收的水稻DNA片段M812連接后，將重組的DNA分子導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌菌株DH5并在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。關(guān)鍵詞堿裂法瓊脂糖凝膠電泳檢測亞克隆感受態(tài)細(xì)胞重組子的轉(zhuǎn)化1前言亞克隆，即是將已經(jīng)獲得的目的片段進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等過程。其基本過程包括：（1）目的片段和載體的制備；（2）目的片段和載體的連接；（3）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；（4）重組子篩選。本實(shí)驗(yàn)中的目的片段和載體均來自細(xì)菌質(zhì)粒，因此細(xì)菌質(zhì)粒的抽提是目的片段和載體制備的核心步驟。本實(shí)驗(yàn)中以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。堿裂解法，是1979年由Birnboim和Doly設(shè)計(jì)并發(fā)表的經(jīng)典質(zhì)粒DNA提取方法。其核心原理是在堿性條件下線狀DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀。在高鹽條件下作復(fù)性處理，變性的染色體會沉淀，從而將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開。在pH值為－時(shí)，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)由負(fù)極向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，分子大小和構(gòu)像不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。所抽提的質(zhì)粒即用電瓊脂糖凝膠電泳來檢測。一般所抽提的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上能夠呈現(xiàn)三條帶，因?yàn)橘|(zhì)粒有三種構(gòu)型，即線狀、環(huán)狀、開環(huán)狀。將所獲得的載體質(zhì)粒與帶有目標(biāo)片段的質(zhì)粒進(jìn)行重組，其包括載體及外源DNA片段的雙酶切消化、目的片段的回收和載體的純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技術(shù)是分子操作的核心部分。將重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞一般有兩種方法——CaCl2法和電轉(zhuǎn)化法，本實(shí)驗(yàn)中采用CaCl2法。本實(shí)驗(yàn)采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞：利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化效率為106～107轉(zhuǎn)化子/gDNA。2材料和方法攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌液攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸桿菌菌液。攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌和攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸桿菌的培養(yǎng)先采用含相應(yīng)抗生素的LA培養(yǎng)基，后采用LB培養(yǎng)基。大腸桿菌菌株DH5采用LB培養(yǎng)基。大腸桿菌在37℃培養(yǎng)?？股氐氖褂脻舛龋喊逼S青霉素，100μg/ml；卡那霉素，50μg/ml。SolutionI;Solution=2\*ROMANII;Solution=3\*ROMANIII;苯酚/氯仿;異丙醇;ddH2O21.取含有所需載體的大腸桿菌菌液于含有相應(yīng)抗生素的LA培養(yǎng)基上涂布或劃線分離單菌落，37℃過夜培養(yǎng)；2.用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床~250r/min過夜培養(yǎng)；吸取菌液，12000r/min離心1分鐘，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次12000r/min離心1分鐘收集菌體，盡量將菌液倒干凈；加入300l溶液I，振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）；加入300l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘（最好不超過2分鐘）；加入300l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；12000g離心10分鐘；吸取800l上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；12000g常溫離心15分鐘；倒盡上清，加500l75％乙醇浸洗除鹽，（放置片刻后倒去上清；或離心5分鐘）加40l滅菌超純水溶解；質(zhì)粒的質(zhì)量檢測，-20℃保存。2.1.3DNA的瓊脂糖凝膠電泳步驟1.將洗凈、干燥的制膠板放入制膠槽中，水平放置在工作臺上，調(diào)整好梳子的高度；0.24g瓊脂糖于×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r(shí)倒膠；3.凝膠凝固后，小心拔去梳子；DNA樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次加入點(diǎn)樣孔中（上樣緩沖液含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔中；含有電泳指示劑，以指示電泳的進(jìn)程）；5.將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動(dòng)（注意點(diǎn)樣孔在電泳槽的負(fù)極一端）；6.電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果并照相記錄；（上樣緩沖液含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點(diǎn)樣孔中；含有電泳指示劑，以指示電泳的進(jìn)程。）DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆所抽提的載體質(zhì)粒pUC19和攜帶外源片段M812的載體pU1301；限制性內(nèi)切酶：BamH=1\*ROMANI和Kpn=1\*ROMANI;2.2.2載體pUC19和外源DNA的限制性酶切及酶切效應(yīng)檢測（50l反應(yīng)體系，用1.5mltube，冰上操作）DNA 30lBamHI(10u/μl) 1lKpnI(10u/μl) 1l10×buffer 5lddH2O 13l分別取5l酶切產(chǎn)物用％－1.2%凝膠檢測酶切效果;2.2.3酶切產(chǎn)物pUC19的純化步驟1.加入ddH2O150l（擴(kuò)大體積），加入200μl氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心10min；吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；3.12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；4.倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后BACDNA溶于10lddH2O，pUC18DNA溶于20lddH2O（1.5mltube中）；2.2.4外源DNA片段M812挖膠回收步驟（上海生工公司生產(chǎn)的柱式DNA膠回收試劑盒）1.通過瓊脂糖凝膠將目的DNA帶與載體帶分開；2.紫外燈下用干凈的刀片切下含目的DNA帶的膠塊放入離心管中；（注意：不含DNA的膠盡可能切除，在長波長的紫外燈下切膠，并盡量縮短DNA暴露在紫外光下的時(shí)間）3.按400μl/100mg膠的比例加入BindingBufferII,50-60oC水浴中10分鐘，使膠融化，每2-3分鐘混勻一次；（注意若膠的濃度較大需增加BindingBufferII的比例、增加融膠的時(shí)間，若膠塊體積較大也需增加融膠的時(shí)間）4.將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，放置2分鐘，8000rpm離心1分鐘；5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管內(nèi)，加入500μlWashSolution,8000rpm室溫離心1分鐘；6.重復(fù)5步一次；7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管內(nèi)，12000rpm室溫離心15秒；8.將UNIQ-10柱放入一個(gè)新的1.5ml離心管內(nèi)，在柱子膜中央加40μlElutionBuffer或水（），室溫或37oC放置2分鐘；（提高洗脫溫度到55oC-80oC有利于提高DNA的洗脫效率）；9.12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的溶液即為回收的DNA片段。2.2.5連接反應(yīng)（10μl體系）：外源DNA 4l目的載體DNA 4l10buffer 1lT4ligase(1U/l) 1l16oC水浴保溫過夜2.2.6.1CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備步驟前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時(shí)）；取1ml過夜培養(yǎng)物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約小時(shí)（300rpm）；將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取培養(yǎng)好的菌液至離心管中，在冰上冷卻10分鐘；4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；再吸取菌液，重復(fù)操作4、5；棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸??；細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（15%～20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。3結(jié)果和討論DNA質(zhì)量檢測圖1.質(zhì)粒DNA質(zhì)量檢測圖圖1是質(zhì)粒DNA提取后的凝膠電泳檢測的圖片，圖中的各條帶均可見表示所需質(zhì)粒抽提成功，質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量一般。圖片中1號為Puc19載體，圖中可看到4條帶，最靠近膠孔的為雜帶，下邊的3條帶由膠孔至膠底依次為開環(huán)狀質(zhì)粒、線狀質(zhì)粒和超螺旋狀質(zhì)粒。圖中2號為攜帶目標(biāo)片段M812的載體pU1301，靠近膠孔有拖帶現(xiàn)象，出現(xiàn)這種情況可能的原因是部分DNA被降解。抽提質(zhì)粒過程中，吸取上清時(shí)可能混入雜質(zhì)，導(dǎo)致了1號泳道的情況，而2號泳道的降解可能是因?yàn)槿芩蠓胖昧颂L時(shí)間導(dǎo)致，以后需要注意。1234圖2.質(zhì)粒酶切后凝膠電泳圖（1為puc19,3為pu1301）圖2是質(zhì)粒經(jīng)BamH=1\*ROMANI和Kpn=1\*ROMANI酶切后凝膠電泳的照片，可以看出質(zhì)粒的酶切都比較理想。本組在雙酶切實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒切割較完全，可能原因是注入酶時(shí)較謹(jǐn)慎，未帶入多余的酶，因此酶用量事宜，未引起星星活性。此外，當(dāng)?shù)孜锖兔傅瘸煞志尤胪耆?，本組在實(shí)驗(yàn)中將其彈均，并進(jìn)行短暫離心使其充分混勻，因此酶切結(jié)果較為理想。圖3大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果轉(zhuǎn)化結(jié)果，全被雜菌污染，出現(xiàn)藍(lán)色自連菌落，成功轉(zhuǎn)化菌落無法識別。本此實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)皿的培養(yǎng)時(shí)間接近30小時(shí)，導(dǎo)致衛(wèi)星菌落的產(chǎn)生。據(jù)資料顯示，大腸桿菌在氨芐青霉素上的經(jīng)驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間為12-16小時(shí)，若到達(dá)預(yù)期培養(yǎng)時(shí)間時(shí)依然未形成可見菌落，則可適當(dāng)延長培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，直至長出飽滿菌落。實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)時(shí)間過長，導(dǎo)致細(xì)胞分泌的β-內(nèi)酰胺酶破壞了氨芐青霉素的活性，以致長出雜菌。并且由于最后涂皿時(shí)，無菌操作出現(xiàn)問題，導(dǎo)致材料污染雜菌。因此，我們在日后實(shí)驗(yàn)中，一定此次分子克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想，主要原因在于實(shí)驗(yàn)操作較為謹(jǐn)慎，各環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行得比較仔細(xì)。在質(zhì)粒抽提階段，本組特別加入了氯仿異丙醇抽提環(huán)節(jié)，提高了所提取質(zhì)粒的純度；在回收階段，本組將所切的膠帶再度進(jìn)行切割，使其成為小塊凝膠，便于其溶解，縮短的溶解時(shí)間；在感受態(tài)制備階段，本組注重冰上操作和無菌操作，進(jìn)入超凈工作臺前將手洗凈，并用酒精棉球仔細(xì)擦拭，防止污染。因此，在今后進(jìn)行相關(guān)操作時(shí)，應(yīng)更加注重實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，從而能增加實(shí)驗(yàn)成功率。二，轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測摘要通過CTAB法提取水稻總DNA，經(jīng)Hind=3\*ROMANIII酶切處理后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并將其結(jié)果轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素尼龍膜上。用已制變性探針在膜上進(jìn)行雜交后顯色，則根據(jù)顯色后的條帶情況則測定轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)。關(guān)鍵詞CTAB法，總DNA，Southern印跡，地高辛；1前言分子雜交技術(shù)，可以用于檢測轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中主要采用Southern雜交技術(shù)進(jìn)行檢測。Southern雜交是由Southern等人于1977年發(fā)明的一種檢測DNA分子的一種方法，通過Southern印跡轉(zhuǎn)移將瓊脂糖膠上的DNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后用經(jīng)過地高辛標(biāo)記的探針進(jìn)行分子雜交，在濾膜上找到與核酸探針也有同源序列的DNA分子。用于雜交的水稻總DNA由CTAB法抽提而來，CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）是一種非離子去污劑，CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用70－75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。由此可以得到純度較高的轉(zhuǎn)基因水稻總DNA。Hind=3\*ROMANIII的酶切位點(diǎn)是AAGCTT，用Hind=3\*ROMANIII處理后的總DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后呈現(xiàn)連續(xù)的條帶，便于進(jìn)行雜交。雜交所用探針為地高辛所標(biāo)記。地高辛（DIG）是靈敏度高、非放射性核酸標(biāo)記檢測體系。DIG檢測靈敏度接近同位素而無放射性危險(xiǎn)、相比熒光則不需要特殊檢測設(shè)備，相比生物素則沒有樣本內(nèi)源干擾之苦，很適合用于核酸非放標(biāo)記檢測。2材料和方法新鮮幼嫩轉(zhuǎn)基因水稻葉片；×CTAB，氯仿/異戊醇（24:1），95%乙醇，70%乙醇，3MNaAc，ddH2O;步驟1.采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細(xì)粉；2.取約左右細(xì)粉于離心管，加入1ml預(yù)熱至95oC以上的×CTAB，混勻；3.65oC水浴中放置30分鐘，每隔5分鐘上下顛倒混合數(shù)次(DNase變性，促進(jìn)內(nèi)溶物釋放)；4.12000rpm離心2分鐘；

600l上清于新的離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻至下層有機(jī)相呈深綠色（約15-20分鐘）；6.12000rpm離心5分鐘；450l上清于新的離心管，加入兩倍體積95％乙醇和1/10體積3MNaAc，輕輕的顛倒混勻至絮狀沉淀形成；8.12000rpm離心10分鐘；9.棄去上清。用500l70％乙醇浸洗沉淀5分鐘，除去離子及CTAB殘余，棄上清,自然干燥；2O溶解。11.待總DNA充分溶解后取5ul,并加入2ul6×LoadingBuffer在0.8%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。根據(jù)染色后的條帶檢測總DNA抽提效果。2.1.4植物總DNA的酶切檢測（20l體系）DNA 10mlHind3(10U/μl) 1ml10×buffer 2mlddH2O7ml 37°C酶切過夜;電泳檢測酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測(2ml總DNA酶切產(chǎn)物+1ml10×loadingbuffer+7mlH2O)。加入終濃度為12.5mmol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應(yīng)(加上樣緩沖液終止酶切)2．2探針的地高辛標(biāo)記模板DNA，去離子水，DiG-highPrimer；2.1.2地高辛標(biāo)記步驟（10μl）1．將300ng模板DNA用無菌去離子水補(bǔ)足至8μl。2．沸水浴或干浴98oC10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。3．充分混勻DiG-highPrimer（1#管），并取2μl至變性DNA管，混勻并離心。4．37oC溫育1小時(shí)或過夜（最大到不超過20小時(shí)）。5．停止反應(yīng)，65oC加熱10分鐘。μl;2.將試劑盒提供的controlDNA稀釋到1ng/μl(原始濃度是5ng/μl);3.將上述稀釋的2-9號管的controlDNA及探針DNA各取1μl點(diǎn)膜;oC固定30分鐘或紫外交鏈3-5分鐘;5.將膜放入裝有20mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中，室溫2分鐘;6.將膜放入10mlBlockingsolution中室溫溫育30分鐘;7.將膜放入10mlAntibodysolution中室溫溫育30分鐘;8.用10mlWashingbuffer洗2次，每次15分鐘;9.在10mlDetectionbuffer平衡2-5分鐘;10.將膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動(dòng)。;11.當(dāng)斑點(diǎn)或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相;2.3Southern印跡2.3.1．1材料以及用具固相支持物:硝酸纖維素膜；脫嘌呤試劑（0.125MHCl）;試劑：變性緩沖液(1.5MNaCl,0.5MNaOH);中和緩沖液（1.5MNaCl,0.5MTris）;轉(zhuǎn)膜緩沖液：20×SSC;用具：2個(gè)合適大小的水盤；1根玻璃棒，1塊鏟膠板，1個(gè)切膠刀；2張搭鹽橋的濾紙；1張合適大小的尼龍膜；2張比尼龍膜稍大的濾紙；一疊5cm左右厚的吸水紙；1大1小2塊玻璃板；（1）電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（最后一個(gè)樣品的最前端）作為電泳方向記號；（2）把凝膠翻面，放入加有足量的0.125M的HCl玻璃盤中，輕輕搖動(dòng)約10min，使電泳指示劑溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色為止（脫嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠；（3）倒去蒸餾水，加入足量變性緩沖液（NaOH/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動(dòng)變性30min。倒去變性緩沖液，加蒸餾水漂洗；（4）倒去蒸餾水，加入足量的中和緩沖液（Tris/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動(dòng)30min中和。倒去中和液，蒸餾水漂洗；（5）20×SSC中平衡10min以上；(20×SSC)，放上洗凈的玻璃板，用2-3張濾紙放在玻璃板上，兩端浸入轉(zhuǎn)膜液中搭制鹽橋（注意濾紙之間不能有氣泡）3．在鹽橋?yàn)V紙上灑些轉(zhuǎn)膜液，立即將膠放在鹽橋上（注意凝膠與鹽橋之間不要有氣泡），膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（即放置吸水紙與鹽橋相接）4.小心將膜覆蓋在凝膠上（膜可以先用H2O浸濕，再放到20×SSC中平衡，膜與凝膠之間不要有氣泡，要求一次成功，膜一旦貼到凝膠不能移動(dòng)）5.膜上放2張濾紙，濾紙上放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約350g的重物，轉(zhuǎn)膜過夜；1.轉(zhuǎn)膜完畢，將膜小心取下，2×SSC短暫漂洗，用兩張濾紙包住膜，置于真空干燥箱中，80℃固定2h或120℃30min；2.用EB染膠以檢測轉(zhuǎn)移效果；雜交液：5×SSC(NaCl，檸檬酸鈉)；50mMPB(NaH2PO4，Na2HPO4)；5×Denhardt(多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)；2.5mmEDTA（有/無）；100ug/mlSSDNA(鮭精DNA)；0.1%SDS；10%硫酸葡聚糖（dextransulfate）；將尼龍膜在2×SSC中浸濕，放入雜交管中，加入適量雜交液（雜交液浸沒膜），趕氣泡，封口，放入65°C的雜交箱中，預(yù)雜交過夜。DiGEasyHyb（將64ml無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶（DiGEasyHybGranules)，37oC搖動(dòng)溶解5分鐘）1.預(yù)熱一定體積的DiGEasyHyb（10ml/100cm2膜）至雜交溫度37-42oC。2.預(yù)雜交30分鐘。在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42oC下充分潤濕。（此過程可以延長至數(shù)小時(shí)）3.變性：Dig標(biāo)記的探針（約25ng/ml）加50μlH2O置沸水浴或98oC干浴鍋中5分鐘后迅速放在冰上冷卻。（不能用堿變性?。?.將變性的探針加入預(yù)熱的DIGEasyHyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫。5.倒出預(yù)雜交液，加入探針和DIGEasyHyb混合液。繼續(xù)在42oC下雜交6h至過夜（單拷貝探針）。2××SSC；×SSC，0.1%SDS室溫下洗滌5分鐘，洗2次。×SSC，0.1%SDS65-68℃溫和振蕩15分鐘，洗2次。Washingbuffer；Maleicacidbuffer；Detectionbuffer；Detectionbuffer；TEbuffer；Blockingsolution；Antibodysolution(Ab)solution；Color-substratesolution；2.3.6.2操作步驟（室溫下進(jìn)行）1．雜交和洗膜后，用馬來酸緩沖液（WashingBuffer，Buffer1）浸泡1-5分鐘2．在100ml1×Blocksolution（Buffer2）中溫育30分鐘3．用1×Blocksolution（Buffer2）稀釋抗體–DIG-抗原偶聯(lián)物至150mU/ml（1:5000）4．用20mlantibodysolution處理膜30分鐘5．用100mlWashingBuffer(Buffer1)洗膜15分鐘，洗2次6．在20mldetectionbuffer（Buffer3）中平衡2-5分鐘7．在10ml新鮮配制的colorsubstratesolution中處理膜5分鐘，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在顯色過程中搖動(dòng)(顏色沉淀在幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)，在16小時(shí)內(nèi)完成顯色反應(yīng)，在顯色過程中膜可在光亮處短暫暴露幾次)9．當(dāng)預(yù)期的斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，可在50ml水中洗膜5分鐘中止反應(yīng)。10．結(jié)果照像。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論1234圖4.總DNA抽提凝膠電泳結(jié)果圖4是本組所抽提的總DNA電泳檢測結(jié)果。圖中最左邊為DNAMarker，1-4為抽提總DNA的條帶。2號總DNA為本人抽提?？梢钥闯?，總DNA抽提過程中出現(xiàn)重大失誤，總DNA條帶并沒有顯現(xiàn)出來。并且由膠孔端有一團(tuán)較亮的團(tuán)帶，可能是樣品中的RNA未完全去除導(dǎo)致。2號總DNA在提取過程中受到了劇烈搖動(dòng)，更可能是抽提過程中萃取后洗取上清時(shí)出現(xiàn)了問題，導(dǎo)致總DNA條帶缺失。另外實(shí)驗(yàn)環(huán)境是一個(gè)開放環(huán)境，若實(shí)驗(yàn)操作不謹(jǐn)慎可能導(dǎo)致外源或內(nèi)源DNA酶將所提取的DNA降解，若不慎引入雜菌或內(nèi)源RNA未完全去除，則易在所提取的總DNA中混入RNA。1234總DNA經(jīng)Hind=3\*ROMANIII酶切檢測結(jié)果如圖5所示，其中2號為本人酶切，條帶呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，因此本組總DNA的酶切比較完全。本次酶切時(shí)間約為17個(gè)小時(shí)，本組1至4中條帶都很均勻連續(xù)，酶切較完全，為之后的實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。如圖所示，轉(zhuǎn)膜后的瓊脂糖凝膠表面無條帶顯示，說明原本呈現(xiàn)其上的電泳帶已完全轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜上，圖中所示膠塊形狀不規(guī)則是由于進(jìn)行處理時(shí)膠塊邊緣部分與膠盤邊緣碰撞所致。本組在進(jìn)行凝膠處理時(shí)與上一組一起進(jìn)行相關(guān)操作，導(dǎo)致兩塊膠之間碰撞頻繁，而使邊緣呈現(xiàn)較多缺口。因此在進(jìn)行凝膠處理時(shí)最好單獨(dú)操作，以減少不必要的損失。此外，鹽橋搭建完畢后，將凝膠和膜依次放置其上時(shí)，應(yīng)盡量減少其中的氣泡，減小轉(zhuǎn)膜時(shí)的阻礙。同時(shí)，塑料隔離板應(yīng)適當(dāng)插入膠底，并且塑料隔離板原理膠邊緣段應(yīng)防止吸水紙與下端濾紙接觸，以防短路。圖7所示為所制地高辛標(biāo)記的DNA探針檢測圖，左端（近紙邊緣端）為ControlDNA,右端（遠(yuǎn)離紙邊緣端）為所制的DNS探針。由左右對比可知，所致探針與ControlDNA濃度接近，探針標(biāo)記理想，可近似為200ng/ul。3.5Southern印跡結(jié)果1234markerern印跡結(jié)果圖圖8.所示即顯色后的硝酸纖維素膜，其中1-4為總DNA與探針雜交后的結(jié)果，與4右端的DNAMarker相比，其上條帶并不明顯。而膜背景較“干凈”說明用WashingSolution清晰較為透徹，但在取膜時(shí)玻璃棒損傷膜表面造成背景有深色劃痕，影響觀測結(jié)果。而條帶不明顯可能原因在于對硝酸纖維素膜進(jìn)行相關(guān)操作時(shí)不夠仔細(xì)，而其原始DNA濃度較低，從而導(dǎo)致條帶不明顯，只有隱約的兩條。本次Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，總結(jié)原因所列如下，在進(jìn)行凝膠的預(yù)處理時(shí)，進(jìn)行變性或復(fù)性等處理時(shí)，操作過于隨意，導(dǎo)致凝膠形狀不規(guī)則，背景雜亂，不利于后期轉(zhuǎn)膜以及觀察，因此，在今后進(jìn)行相關(guān)操作時(shí)應(yīng)注意保持凝膠的完整性。此外，雖然探針檢測時(shí)近似標(biāo)準(zhǔn)濃度，但是由結(jié)果推測，雜交時(shí)探針可能也出現(xiàn)了問題，諸多問題，在以后的Southern雜交實(shí)驗(yàn)中需要注意與解決。三、基因表達(dá)檢測摘要本實(shí)驗(yàn)中選擇在轉(zhuǎn)錄水平上對基因表達(dá)量進(jìn)行檢測，采用RT-PCR的常見方法；即將用Trizol試劑抽提出的轉(zhuǎn)基因水稻幼嫩葉片的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后將得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增后的DNA的濃度差異來對RNA的量進(jìn)行估計(jì)。關(guān)鍵詞Trizol試劑；反轉(zhuǎn)錄；RT-PCR;表達(dá)量檢測；1前言基因表達(dá)分析的轉(zhuǎn)錄水平常用方法有RealtimePCR、NorthernBlotting和RT-PCR等。RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，稱為RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時(shí)空表達(dá)的常用方法。本實(shí)驗(yàn)中采用Trizol試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻mRNA的抽提，Trizol試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時(shí)保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA。用這種方法得到的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少，可以用來做Northern,RT-PCR,分離RNA，體外翻譯和分子克隆等。由于所提取的mRNA不能直接進(jìn)行PCR，所以其必須反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行下一步的PCR操作。反轉(zhuǎn)錄是指進(jìn)行基因工程過程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLVRT）能以單鏈RNA或DNA為模板，在引物的引發(fā)下合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。本實(shí)驗(yàn)中使用invitrogen公司提供的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶，將所抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)以水稻葉片RNA為材料，檢測轉(zhuǎn)基因水稻gus基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置一個(gè)看家基因作為陽性對照，判斷RNA的定量及反轉(zhuǎn)錄、PCR等過程是否有問題；設(shè)置一個(gè)不加模板RNA的陰性對照，主要是消除DNA及PCR試劑方面引起的假陽性；同時(shí)設(shè)置一個(gè)以葉片DNA為陽性對照，檢驗(yàn)擴(kuò)增帶型是否來源于反轉(zhuǎn)錄的cDNA,2材料和方法2.1植物總RNA的抽提（Trizol試劑法）和電泳檢測轉(zhuǎn)gus基因水稻的幼嫩葉片；Trizol試劑；氯仿；異丙醇；75%乙醇；DEPC水；RNA的抽提及檢測步驟1.液氮研磨植物葉片，每1.5mltube分裝克樣品；1毫升Trizol試劑（樣品體積不超過Trizol試劑體積的10％），迅速混勻（若樣品較多可先將混好的樣品置于冰上）；室溫下凈置5－10分鐘以利于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體的解離；200μl的氯仿，用手劇烈搖蕩15秒，室溫下靜置5分鐘左右；℃，12000rpm冷凍離心10-15分鐘；5.將水相（上清）轉(zhuǎn)入一新離心管，加0.5ml異丙醇室溫下沉淀10分鐘；℃，12000rpm離心15分鐘；7.棄上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振蕩片刻后（務(wù)必使沉淀懸浮起來，以確保洗滌干凈），7500rpm離心5分鐘，小心棄上清；5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20μlDEPC水溶解保存于-70℃。2μl進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量。RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄PCR)用Trizol試劑抽提的植物總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑：RNase-freeDNase=1\*ROMANI;10×DNase=1\*ROMANIbuffer;DEPC-treatedddH2O;PCR試劑：TaKaRaExTaq(5u/l)；dNTPmixture(2mM);10×ExTaqbuffer;g/l;2.用處理過的RNA專用0.5ml管按下列反應(yīng)體系配置反應(yīng)（冰上操作）；TotalRNA 3l(2-5g)RNase-freeDNase１l(１u/l)10×DNasebuffer 1lDEPC-treatedddH2O5l3.37℃保溫15min,然后放于70℃水浴鍋中10min進(jìn)行失活.4.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（冰上操作）（1）加入1loligo(dT)（500g/ml）15primer,輕柔攪拌并短暫離心以混勻。（2）在70℃下將混合物干浴10min，然后立刻在冰上放置5min;（3）配置下列反應(yīng)5×firststrandbuffer 4l0.1MDTT 2l10MdNTP 1lM-MLV(200U/l)1ll在37℃水浴保溫1小時(shí)；℃處理15min終止反應(yīng)，然后加入20lddH2O稀釋；3.2.4PCR反應(yīng)以及檢測步驟體系1FirststrandcDNA 1lTaKaRaExTaq(5u/1l) 0.5l10×ExTaqbuffer 2ldNTPmixture(2mM) 2lGUSF(10mM) 0.5lGUSR(10mM) 0.5lddH2O 13.5l體系2F