AbMoleTET 酶缺失導致小鼠胚胎干細胞非整倍體的研究

AbMole|TET酶缺失導致小鼠胚胎干細胞非整倍體的研究來自拉霍亞免疫學研究所信號轉(zhuǎn)導和基因表達部的RomainOGeorges,HugoSepulveda,JCarlosAngel等多名研究人員發(fā)表了題為《AcutedeletionofTETenzymesresultsinaneuploidyinmouseembryonicstemcellsthroughdecreasedexpressionofKhdc3》的研究成果。在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的CHIR-99021·HCl（目錄號M1989）。急性缺失TET酶會導致小鼠胚胎干細胞（mESC）出現(xiàn)染色體錯分離和非整倍體，這與Khdc3基因表達下調(diào)有關。通過轉(zhuǎn)錄組分析，確定了Khdc3等三個基因在TET缺失的mESC中表達下調(diào)，且Khdc3基因附近的DNA甲基化增加?；謴蚄HDC3水平可防止非整倍體的發(fā)生。這些結果表明，TET蛋白通過維持KHDC3的正常表達來防止mESC中的有絲分裂異常和維持染色體穩(wěn)定性。TET酶家族的三個成員（TET1、TET2和TET3）通過改變基因組中DNA胞嘧啶的修飾狀態(tài)來影響許多生物學過程。在人類和小鼠模型中，TET功能喪失與DNA損傷、基因組不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生有關。然而，大多數(shù)關于TET缺陷細胞中基因組不穩(wěn)定性的研究是在體細胞或在培養(yǎng)中維持了不同時間的干細胞模型上進行的，這可能會掩蓋TET酶直接調(diào)節(jié)的途徑。因此，本研究旨在探討急性、嚴重的TET功能喪失對mESC染色體分離和穩(wěn)定性的影響。圖1：三重TET缺陷胚胎和mESC中非整倍體和染色體分離缺陷的出現(xiàn)。條件性刪除TET酶的小鼠胚胎干細胞系的生成：通過建立可誘導刪除所有三個Tet基因的小鼠胚胎干細胞系，發(fā)現(xiàn)4-羥他莫昔芬（4-OHT）處理可誘導Cre-ERT2融合蛋白進入細胞核，驅(qū)動loxP位點重組，從而刪除Tet基因。RNA-Seq和qRT-PCR結果證實了Tet基因的刪除，Westernblot和流式細胞術結果表明TET1和TET2蛋白表達消失，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）水平迅速降低。染色體錯分離現(xiàn)象的觀察：通過實時活細胞成像觀察到，在4-OHT處理后4天，TetiTKOmESC中染色體錯分離（滯后染色體、微核）的發(fā)生率是CtrlmESC的兩倍，這表明TET酶在保護mESC中染色體準確分離方面起著直接或間接的作用。非整倍體的檢測：通過對單個細胞進行全基因組測序和中期染色體鋪展分析，發(fā)現(xiàn)與CtrlmESC相比，TetiTKOmESC中非整倍體核型增加了2-3倍，這表明在TetiTKOmESC中觀察到的染色體錯分離導致了單個TET缺陷細胞中快速出現(xiàn)非整倍體核型。體內(nèi)胚胎實驗：對早期（8-細胞階段）胚胎進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)所有3種TET酶缺失的胚胎細胞核形態(tài)和大小明顯異質(zhì)，卵裂球數(shù)量、微核和卵裂球碎裂情況可變，這表明染色體錯分離可能導致非整倍體。轉(zhuǎn)錄組分析：通過對TetiTKOmESC進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)與CtrlmESC相比，TetiTKOmESC中一些與有絲分裂、染色體分離、紡錘體組裝、復制和/或DNA修復相關的基因表達下調(diào)，其中Khdc3下調(diào)最為顯著?；虮磉_的時間進程分析：Khdc3和Khdc2mRNA在TetiTKOmESC中于4-OHT添加后6.5天下調(diào)，時間進程分析表明，Khdc3mRNA在第3.5天開始明顯下降，而Khdc2mRNA在第5.5天開始下降不太明顯。與之前發(fā)表的研究結果比較，發(fā)現(xiàn)只有Khdc3在分析的TetTKOmESC中始終下調(diào)。此外，在長期缺失Tet的克隆群體中，Khdc3表達仍然下調(diào)，而Khdc2表達恢復正常。這些數(shù)據(jù)表明，Tet缺失對染色體分離的不利影響可能是由于DNA甲基化增加與Khdc3表達持續(xù)下調(diào)相關。圖2：急性Tet1/2/3耗竭誘導許多基因表達改變，包括編碼SCMC亞基KHDC2和KHDC3的mRNA下調(diào)。DNA甲基化分析：通過分析已發(fā)表的ChIP-seq、WGBS和RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DNMTs（特別是DNMT3a）富集在Khdc3轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）的遠端區(qū)域，而TET1和TET2占據(jù)更接近Khdc2和Khdc3TSS以及基因體的區(qū)域，TetTKOmESC中Khdc3和Khdc2基因及周邊區(qū)域的DNA甲基化增加，Khdc3表達降低，而DnmtTKO中Khdc3表達增加。特定DNMT的作用：進一步研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3a是控制Khdc3位點DNA甲基化的最重要的DNMT，并且TET和DNMT蛋白之間存在有趣的相互作用，即雙缺失Dnmt3a和Dnmt3b可防止TetTKOmESC中Khdc3啟動子的DNA高甲基化，并且Khdc3表達恢復到超過WT水平。Khdc3在TetiTKOmESC中的重新表達逆轉(zhuǎn)了非整倍體表型基因編輯和表達實驗：通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯Khdc2和Khdc3基因，發(fā)現(xiàn)Khdc2或Khdc3缺失會導致mESC中非整倍體增加。在TetiTKO和CtrlmESC中誘導表達Khdc2或Khdc3，發(fā)現(xiàn)Khdc3表達可使TetiTKOmESC中非整倍體的頻率從約60％降至約20％，類似于CtrlmESC中的基礎頻率，而Khdc2表達則不能逆轉(zhuǎn)TetiTKOmESC中的非整倍體高頻率。這些數(shù)據(jù)表明，TET酶至少部分通過確保mESC中正常的Khdc3表達來控制有絲分裂期間正常的染色體分離。本研究表明，TET蛋白對確保mESC中染色體分離的保真度很重要，這一作用是通過下調(diào)Khdc3來介導的。急性Cre介導的Tet1、Tet2和Tet3基因缺失導致mESC中出現(xiàn)明顯的有絲分裂異常、染色體錯分離和非整倍體，這一表型至少部分是由于Khdc3（Filia，Ecat1）的下調(diào)所致，Khdc3編碼一種含KH結構域的蛋白質(zhì)，最初被鑒定為母源效應基因產(chǎn)物NLRP5（MATER）的相互作用伙伴，是皮層下母體復合物（SCMC）的核心成分。Khdc3在TetTflmESC中的表達可防止TetiTKOmESC在4-OHT暴露后快速出現(xiàn)非整倍體，而Khdc2的表達則沒有這種作用。此外，研究還討論了Khdc2和Khdc3在維持mESC基因組穩(wěn)定性中的作用。雖然Khdc2和Khdc3mRNA在TetiTKOmESC中均迅速下調(diào)，但Khdc3表達在長期培養(yǎng)后仍下調(diào)，而Khdc2表達恢復。這表明Khdc3可能獨立于Khdc2來防止TetiTKOmESC中的染色體不穩(wěn)定；或者，因為Khdc2mRNA在對照mESC中表達水平高于Khdc3mRNA，并且在急性缺失或長期培養(yǎng)的TetiTKOmESC中下調(diào)不明顯，所以這兩種蛋白質(zhì)可能作為一個復合物發(fā)揮作用，其中KHDC3蛋白是限制性的，而KHDC2蛋白不是。最后，研究指出DNA甲