一種檢測圍產期母羊胰島素敏感的方法-葡萄糖鉗夾技術

2一種檢測圍產期母羊胰島素敏感的方法-葡萄糖鉗夾技術本文件規(guī)定了圍產期母羊胰島素敏感檢測方法的試劑、儀器和設備、測定步驟。本文件適用于圍產期母羊胰島素敏感的檢測。2術語和定義下列術語和定義適用于本文件。2.1胰島素敏感insulinsensitivity指脂肪細胞、肌肉細胞和肝細胞對正常濃度的胰島素產生反應不足的現(xiàn)象，亦即這些細胞需要更高的胰島素濃度才能對胰島素產生反應。2.2高胰島素-正血糖鉗夾技術hyperinsulinemiceuglycemicclamptest一種金標準方法，即給予一定量的胰島素后，將葡萄糖用某種速率滴注入血液，部分葡萄糖能被利用，但血糖水平可維持穩(wěn)態(tài)。3試劑3.1牛源胰島素（購自美國sigma公司）。3.2牛血清白蛋白（BSA，購自美國sigma公司）。3.3生理鹽水。3.4濃度為10%的葡萄糖注射液。3.5濃度為50%的葡萄糖注射液。3.6葡萄糖灌注液：10%糖鹽溶液與50%的葡萄糖注射液按5:3的比例配制成25%（w/v)的葡萄糖灌注液。3.7胰島素灌注液：胰島素的用量為120μg/h。調節(jié)注射泵的速度，使胰島素灌注液以10mL/h的速度恒流灌注，灌注量為120μg/h。首先1mL無菌水中加入1mg胰島素與0.01gBSA，并充分混合，隨后，再加入50μL6N鹽酸制備為凍存液。再次，取2.88mL凍存液加入含0.1%BSA的生理鹽水稀釋至240mL，再用0.22μm的一次性抽濾瓶負壓過濾除菌，配制成灌注液待用。4儀器和設備4.1恒流泵（上海滬西分析儀器廠，型號HL-2）。34.2注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司，型號W0109-1B）。4.3快速測血糖儀（美國強生公司，強生穩(wěn)步型）。4.40.22μm的一次性負壓抽濾瓶。4.5輸液管。4.6一次性靜脈留置針。5測定步驟5.1飼養(yǎng)管理正式試驗前一周對母羊進行適應性訓練，在代謝籠中飼養(yǎng)，自由飲水，每隔兩小時飼喂一次，為避免采食量變化對機體血糖水平的影響，需要對動物定量限飼。5.2安裝靜脈留置針灌注前一天，動物的一側頸靜脈安裝靜脈留置針建立靜脈輸注通道，該通道連接三通管，一端連接注射胰島素，一端連接葡萄糖輸注泵，混合后輸注靜脈。同時，在動物的另一側頸靜脈安裝留置針用于采集血樣。5.3胰島素與葡萄糖的灌注胰島素的灌注使用注射泵調節(jié)，保證胰島素灌注液以10mL/h的速度恒流灌注入頸靜脈中。葡萄糖的灌注液使用恒流泵調節(jié)，灌注速率隨機體血糖水平的變化調節(jié)，使機體血糖水平保持穩(wěn)定。5.4血樣的采集灌注前一天，分別于07:30、08:30、13:30、14:30、19:30和20:30六個時間點采集血樣，用快速測血糖儀測定血糖濃度，確定基礎血糖水平。在灌注期，葡萄糖，胰島素灌注后每隔10min測定一次血糖，并根據血糖濃度調節(jié)目標血糖水平，使其穩(wěn)定在基礎血糖水平。待血糖穩(wěn)定后，每隔1h采一次血樣測定血糖并留樣。鉗夾結束時，首先停止泵入胰島素，預防低血糖發(fā)生，然后逐漸減少葡萄糖輸入速度。5.5血樣的處理采集的血樣中加入肝素鈉抗凝，低速臺式離心機3000rpm，離心15min，取血漿以分析胰島素和血糖濃度。5.6血樣的測定指標與方法動脈血漿胰島素濃度采用放射性免疫法測定，按照附錄A中的簡要操作方法進行測定。血漿葡萄糖濃度使用全自動生化分析儀測定，按照附錄B中的簡要操作方法進行測定。4附錄A胰島素濃度簡要測定步驟1試劑配制1.1Ins.標準品：向各標準瓶中分別準確地加入1mL緩沖液溶解。溶解15min后搖勻方可使用。溶解后各標準濃度分別為5、10、20、40、80、160μIU/mL。1.2125I-Ins.：用10mL緩沖液溶解。1.3豚抗-Ins.抗體：每瓶抗體加10mL緩沖液溶解。1.4驢抗豚免疫分離劑：加樣前必須充分搖勻。1.5Ins.質控血清：使用前每瓶準確加入0.5mL蒸餾水溶解。2測定步驟取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號筆編號NSB、S0-S6和待測樣品管等，然后用微量加樣器按表A.1所示加樣。加樣前所有試劑（尤其是分離劑）包括待測樣品均要搖勻，并且最好平衡到室溫。表A.1加樣程序表單位：μlI-Ins.————3數據處理聯(lián)機處理：由電腦自動處理得出結果。葡萄糖濃度簡要測定步驟1參數設置波長：505nm。2