抗腫瘤藥物的篩選方法

抗腫瘤藥物(yàowù)篩選張冬梅共一百零六頁一、導(dǎo)論二、整體動物水平的篩選三、細(xì)胞(xìbāo)水平的篩選四、酶水平的篩選五、展望共一百零六頁一、導(dǎo)論(dǎolùn)

1.腫瘤(zhǒngliú)發(fā)病率和死亡率全球每年癌癥新發(fā)病例都在1200萬以上，因癌癥死亡人數(shù)達(dá)760多萬，到2010年底全球腫瘤病人總數(shù)已逾5500萬人(WHO)。心臟病腦血管病腫瘤25%消化系統(tǒng)病肺病其他共一百零六頁中國每年新增腫瘤病人200萬人，死亡130-170多萬人左右，目前全國腫瘤患者總數(shù)約450萬人，并以每年3%的速度遞增。腫瘤已經(jīng)成為(chéngwéi)中國公民的頭號殺手，每年因惡性腫瘤而死亡的人口占到總死亡率的22%。2009年中國居民主要(zhǔyào)疾病死亡率及死亡原因構(gòu)成

死亡原因死亡率(1/10萬)占總死亡人數(shù)百分率惡性腫瘤13522%腦血管病11120%心臟病9618%呼吸系統(tǒng)病7215%損傷和中毒315%消化系統(tǒng)病175%糖尿病171%(中國衛(wèi)生年鑒)共一百零六頁２００9年中國(zhōnɡɡuó)常見惡性腫瘤的死亡率

我國居民常見癌癥死亡率:

胃癌列腫瘤(zhǒngliú)死亡率首位;其次肝癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等。共一百零六頁2.腫瘤(zhǒngliú)的治療方法外科手術(shù)治療放射線治療化學(xué)(huàxué)藥物治療共一百零六頁3.常用的化療(huàliáo)藥物烷化劑

環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺抗代謝藥物

甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷抗腫瘤抗生素

柔紅霉素、阿霉素、絲裂霉素、多柔比星鉑類化合物

順鉑、卡鉑、奧沙利鉑抗腫瘤植物藥

長春新堿、依托(yītuō)泊苷、替尼泊苷、紫杉醇激素類

血管新生抑制劑

貝伐珠單抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼

共一百零六頁化療藥物(yàowù)的主要不良反應(yīng)骨髓抑制（血細(xì)胞減少）胃腸道反應(yīng)（惡心、嘔吐、食欲不振等）全身反應(yīng)（脫發(fā)、發(fā)熱(fārè)、皮疹）對各器官影響

（心臟毒性、肝臟毒性、神經(jīng)毒性）泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性腎?。┚植快o脈炎致畸、致突變、致癌共一百零六頁4.天然(tiānrán)產(chǎn)物與抗腫瘤藥物

天然產(chǎn)物在新藥及新藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著不可替代的作用，是結(jié)構(gòu)新穎和作用獨特的抗腫瘤化合物的重要來源。美國國立癌癥研究所（NCI）從1955年開始從天然產(chǎn)物中篩選抗腫瘤藥物。目前世界(shìjiè)上被批準(zhǔn)廣泛使用的抗腫瘤藥物中,５０％以上來源于天然產(chǎn)物。共一百零六頁二、整體動物(dòngwù)水平的篩選

１．非實體(shítǐ)瘤動物模型腫瘤名稱代號宿主腫瘤名稱代號宿主艾氏腹水瘤ECAKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤腹水型S180AKM小鼠BALB/c小鼠肝癌腹水瘤HepAKM小鼠BALB/c小鼠白血病L1210DBA小鼠白血病P388KM小鼠BALB/c小鼠白血病P615615小鼠常用小鼠腹水瘤動物模型表（細(xì)胞株及動物）國內(nèi)外推薦模型共一百零六頁

腫瘤移植(yízhí)方法：1）無菌操作2）接種部位：腹腔3）癌細(xì)胞懸液的制備及接種

接種7~10天小鼠處死，酒精消毒，穿過腹部肌肉吸取腹水2~4mL*，置冰塊上保存。細(xì)胞計數(shù)后，PBS稀釋制備1x107/0.1mL細(xì)胞濃度懸液，每只小鼠注射0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液注射到腹腔。5天左右，小鼠出現(xiàn)腹水即為造模成功。

*腹水應(yīng)為白色濃稠液體(yètǐ)，若為黃色或紅色應(yīng)棄去共一百零六頁給藥及藥效(yàoxiào)評價：動物分組：隨機(jī)分五組（溶劑對照組、陽性藥組、高、中、低給藥組）；每組8-10只。藥品制備：藥品溶解生理鹽水或PBS等緩沖(huǎnchōng)鹽溶液給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）14天以上評價指標(biāo)：觀察記錄荷瘤小鼠的存活天數(shù)（30天）

（7天死亡率≥20%或20%動物存活超過4周，實驗失敗

對照組存活時間14-20天）數(shù)據(jù)處理：生命延長率(%)＝治療組存活天數(shù)－對照組存活天數(shù)對照組存活天數(shù)

非腹腔給藥生命延長率>50%腹腔給藥>75%x100%共一百零六頁２.實體(shítǐ)瘤動物模型1）動物(dòngwù)移植性腫瘤

腫瘤名稱代號宿主腫瘤名稱代號宿主艾氏癌實體型ECSKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤S180KM小鼠BALB/c小鼠肝癌實體型HepSKM小鼠BALB/c小鼠黑色素瘤B16C57BL/6小鼠BALB/c小鼠肺癌LewisC57BL/6小鼠BALB/c小鼠結(jié)腸癌C26BALB/c小鼠瓦克癌肉瘤W256Wistar大鼠結(jié)腸癌C38BALB/c小鼠常用小鼠、大鼠實體瘤動物模型表（細(xì)胞株及動物）國內(nèi)外推薦模型共一百零六頁

腫瘤移植(yízhí)方法：

1）無菌操作2）接種部位(bùwèi)：右前肢腋下

3）癌塊的制備及接種

接種7~10天小鼠處死，酒精消毒，切開皮膚取出腫瘤塊，置于生理鹽水中，冰塊上保存。剪碎瘤塊成2-3mm3的小塊或組織塊勻漿成細(xì)胞懸液，接種到右前肢腋下。5天左右，小鼠出現(xiàn)瘤塊即為造模成功。

7天后對照組20%小鼠腫瘤小于400mg或大于2g，實驗失敗共一百零六頁給藥及藥效(yàoxiào)評價：給藥方式：連續(xù)給藥；1-2次/天;（ig,ip,iv）10-12天評價指標(biāo)：記錄小鼠的體重變化。12天后(tiānhòu)，處死小

鼠，撥瘤稱重（對照組瘤重1g左右）。

取脾臟和胸腺稱重，并測定脾細(xì)胞數(shù)目數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)＝對照組瘤重－治療組瘤重對照組瘤重

抑瘤率>30%認(rèn)為有效x100%共一百零六頁２）人癌異種移植(yízhí)模型

細(xì)胞：人源肝癌，胃癌，肺癌，結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞

動物：

裸鼠（nudemice）

特點：

1）裸體，行似無毛；

2）不能執(zhí)行正常T細(xì)胞功能(gōngnéng)，免疫力低下

3）B細(xì)胞功能正常，NK細(xì)胞活性高T淋巴功能缺陷先天性無胸腺小鼠11號染色體上隱性

突變裸基因（nu）

共一百零六頁

腫瘤(zhǒngliú)移植和給藥方法：

1）無菌操作2）接種部位：背部

3）細(xì)胞懸液的制備及接種

細(xì)胞懸液濃度1x108/mL，接種0.1mL到背部。7天左右，瘤塊達(dá)到50mm3體積(tǐjī)即為造模成功，開始給藥。

4）給藥時間：根據(jù)藥效確定，一般12-60天。

共一百零六頁陽性(yángxìng)藥

5-Fu（5-氟尿嘧啶）

ADM（阿霉素）

Taxol（紫杉醇）

CTX（環(huán)磷酰胺）選擇性對照藥推薦劑量：1-20mg/kg給藥方式：與測試(cèshì)藥物相同;常隔天給藥共一百零六頁藥效(yàoxiào)評價：評價指標(biāo)：記錄小鼠的體重變化。結(jié)束治療后，處死小鼠，撥瘤稱重（對照組瘤重1g左

右）。取脾臟稱重，并測定脾細(xì)

胞數(shù)目。數(shù)據(jù)處理：抑瘤率(%)＝對照組腫瘤體積(tǐjī)－治療組腫瘤體積(tǐjī)對照組腫瘤體積

抑瘤率>30%認(rèn)為有效x100%共一百零六頁抗腫瘤譜

Taxol

（卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞(xìbāo)肺癌、頭頸癌、食管癌、淋巴瘤）5-Fu

（乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肝癌、宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌和頭頸部腫瘤）

ADM

（乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮膚癌）共一百零六頁沙蟾毒精的體內(nèi)(tǐnèi)抗腫瘤作用(Carcinogenesis,2013,34:1331)共一百零六頁三、細(xì)胞(xìbāo)水平的篩選1.抑制腫瘤細(xì)胞增殖實驗(shíyàn)2.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化實驗3.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實驗4.抗腫瘤血管生成實驗5.腫瘤多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)實驗6.抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移實驗7.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬實驗共一百零六頁細(xì)胞株的選擇(xuǎnzé)共一百零六頁１.抑制腫瘤細(xì)胞(xìbāo)增殖實驗A)噻唑蘭實驗（MTT）

原理：

活細(xì)胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的MTT，生成藍(lán)紫色不溶于水的甲臜（Formazan）。甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570

nm

處進(jìn)行(jìnxíng)測定。甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目。

共一百零六頁MTT原理(yuánlǐ)示意圖甲臜生成量正比于活細(xì)胞(xìbāo)數(shù)采用比色法（570nm）測定甲臜生成量共一百零六頁實驗(shíyàn)方法1）細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)液：RPMI1640、DMEM、MEM、M199、McCoy’s5A等

血清(xuèqīng)：

FBS、NBS、

抗生素：青霉素、鏈霉素、慶大霉素、新生霉素等

胰酶：

Trypsin-EDTA、Collagenase

緩沖液：

PBS、HBSS等

生長因子：EGF、B-27、N-2等共一百零六頁2）細(xì)胞傳代

貼壁細(xì)胞生長(shēngzhǎng)3-5天，80%融合度。用胰酶消化1-3min后，離心，調(diào)節(jié)適當(dāng)密度重新懸浮在培養(yǎng)液中。3）細(xì)胞計數(shù)

細(xì)胞計數(shù)板共一百零六頁5）細(xì)胞接種

3000-10000細(xì)胞接種在96孔板，貼壁24小時，或?qū)?shù)生長期6）加藥處理72h（指定(zhǐdìng)時間點）7）MTT溶液（5mg/ml），孵育2-4小時8）棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶解生成的

甲臜9）酶標(biāo)儀測定OD值

共一百零六頁結(jié)果(jiēguǒ)處理：腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞生長抑制率（%）=（OD對照-OD實驗）OD對照X100%根據(jù)生長抑制的量效曲線求出IC50

值腫瘤細(xì)胞存活率（%）=OD實驗OD對照X100%共一百零六頁AB問題：根據(jù)上圖中細(xì)胞生長(shēngzhǎng)抑制曲線，

判斷化合物A和B哪一個具有較好的

腫瘤生長抑制作用？

共一百零六頁Ｂ）磺酰羅丹明B（SRB）實驗(shíyàn)

原理(yuánlǐ)：

SRB是粉紅色的氨基甲氧雜蒽類化合物，是蛋白結(jié)合染料，與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合后呈粉紅色，用酶標(biāo)儀測定其吸光度。細(xì)胞中的蛋白含量與吸光度成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目和活性。共一百零六頁方法：類似于ＭＴＴ法，10-20%三氯乙酸固定(gùdìng)1h

后，加入0.5-1%ＳＲＢ染色30min，洗去

染料，空氣干燥后，加入10mMTris溶解

后，5４0nm測定光密度結(jié)果處理：同ＭＴＴ法共一百零六頁Ｃ）細(xì)胞(xìbāo)排染法（酞酚藍(lán)）

原理：

細(xì)胞損傷或死亡(sǐwáng)后細(xì)胞膜完整性被破壞，正常細(xì)胞排染，而死亡(sǐwáng)細(xì)胞染成藍(lán)色。

伊紅、苯胺黑等染料共一百零六頁細(xì)胞(xìbāo)死亡率（%）對照組活細(xì)胞(xìbāo)數(shù)－給藥組活細(xì)胞(xìbāo)數(shù)對照組活細(xì)胞數(shù)X100%=結(jié)果：方法：

細(xì)胞懸液加入酞酚藍(lán)染色液混勻，用細(xì)胞計數(shù)板，分別計數(shù)活細(xì)胞（未染色）和死細(xì)胞數(shù)目（藍(lán)色）共一百零六頁２.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞(xìbāo)分化實驗

NBT還原法原理：硝基藍(lán)四氮唑蘭(NBT)還原法測定細(xì)胞株分化誘導(dǎo)。正常(zhèngcháng)的中性粒細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖支路活躍,細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶含量增加,將可溶性NBT還原為不溶性藍(lán)紫色顆粒,而沉積于細(xì)胞漿內(nèi)。方法：HL-60細(xì)胞株是篩選分化誘導(dǎo)劑的,藥物作用后,細(xì)胞形態(tài)向粒細(xì)胞方向分化。結(jié)果：顯微鏡計數(shù)NBT還原陽性細(xì)胞，計算誘導(dǎo)分化率共一百零六頁對照組藥物(yàowù)處理組共一百零六頁３.誘導(dǎo)(yòudǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實驗Ａ）形態(tài)學(xué)觀察（透射電鏡）原理：細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察方法：藥物處理后，收集(shōují)細(xì)胞，4%戊二醛固定2h以上，PBS清洗，1%俄酸固定1h,酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片做成銅網(wǎng)，經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察拍照。共一百零六頁對照組凋亡(diāowánɡ)細(xì)胞正常細(xì)胞胞質(zhì)散在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜(hémó)清楚、染色質(zhì)均勻、核仁明顯。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、致密，沿核分布形成新月體狀，有凋亡小體出現(xiàn)。對照組共一百零六頁壞死(huàisǐ)線粒體腫脹(zhǒngzhàng)

凋亡細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的線粒體腫脹。壞死細(xì)胞細(xì)胞膜不完整，核膜破裂，染色質(zhì)呈蟲蝕狀溶解。共一百零六頁B）DNA形態(tài)觀察（Hoeschst333258）原理：Hoeschst333258與DNA特異性結(jié)合發(fā)出藍(lán)色熒光方法：腫瘤細(xì)胞(xìbāo)用Hoeschst333258染色后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果：活細(xì)胞成均勻的淡熒光，調(diào)亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見強(qiáng)熒光的顆粒狀物質(zhì)。共一百零六頁對照組藥物(yàowù)處理組共一百零六頁C）染色體ＤＮＡ斷裂(duànliè)測定原理：凋亡細(xì)胞內(nèi)源性核酸酶激活，ＤＮＡ鏈被切割成200bp不同倍數(shù)的片段，將這些片斷進(jìn)行電泳，可觀察到ＤＮＡ梯帶方法：裂解(lièjiě)腫瘤細(xì)胞，消化蛋白，提?。模危?，上凝膠電泳，ＥＢ染色后，ＵＶ燈下觀察。結(jié)果：凋亡細(xì)胞顯示ＤＮＡ梯帶。共一百零六頁

CTLDRUG1DRUG2

MARKER共一百零六頁３）PI/Annexin-Ｖ-FITC雙染色(rǎnsè)分析

原理：調(diào)亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細(xì)胞表面，PS結(jié)合標(biāo)記(biāojì)熒光素FITC的Annexin-V但細(xì)胞膜仍然完整，熒光染料ＰＩ不能進(jìn)入，而調(diào)亡晚期的細(xì)胞可同時受Annexin-V

和PI的雙標(biāo)記。

方法：腫瘤細(xì)胞同時加入Annexin-Ｖ和ＰＩ染色，用流式細(xì)胞儀分析。共一百零六頁正常(zhèngcháng)細(xì)胞Annexin-V(-)PI(-)晚期凋亡(diāowánɡ)細(xì)胞Annexin-V(+)PI(+)早期凋亡細(xì)胞Annexin-V(+)PI(-)Annexin-VPI共一百零六頁P(yáng)I/AnnexinV-FITC雙染激光共聚焦(jùjiāo)分析結(jié)果PI紅色(hóngsè)熒光細(xì)胞核AnnexinV-FITC綠色熒光細(xì)胞膜共一百零六頁Annexin-V-FITCPI對照組藥物(yàowù)處理組共一百零六頁４.抗腫瘤血管(xuèguǎn)生成實驗

腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移與新生血管形成密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤直徑超過2mm時,直接由微環(huán)境(huánjìng)提供的營養(yǎng)就不能滿足其生長需要,此時腫瘤的生長依賴于新生血管運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤血管生成抑制劑能抑制血管生成,阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，在治療腫瘤中具有高效、廣普、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。共一百零六頁１）血管內(nèi)皮細(xì)胞體外篩選(shāixuǎn)模型原理：體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞在含生長因子條件下能形成細(xì)胞條索，然后形成管狀。腫瘤血管生成抑制劑能抑制細(xì)胞管腔的形成。方法：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞在含有藥物和不含有TAI

藥物的膠原凝膠中分別培養(yǎng)后,在顯微鏡下比較

它們(tāmen)形成的管腔數(shù)目。

對照組藥物處理組共一百零六頁２）雞胚絨毛尿囊膜血管(xuèguǎn)新生模型

原理：雞卵在胚胎發(fā)育過程中，尿囊膜上的血管生長很旺盛，將不同藥物作用于尿囊膜，觀察該膜上的血管生長。方法(fāngfǎ)：雞胚胎放在直培養(yǎng)皿內(nèi),在無菌恒溫箱中孵育到第9天的生長高峰時,將浸泡過藥物的明膠海綿置于雞胚絨毛尿囊膜表面，培養(yǎng)２天，在顯微鏡下隨機(jī)取幾個視野點,記數(shù)“熱點”區(qū)的新生血管數(shù),計算平均值。共一百零六頁血管(xuèguǎn)生成抑制率（%）對照組血管(xuèguǎn)面積－給藥組血管(xuèguǎn)面積對照組血管面積X100%＝結(jié)果：CTL低劑量藥物高劑量藥物組共一百零六頁３）斑馬魚血管(xuèguǎn)新生模型

斑馬魚被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選方面的研究。主要用于篩選抗血管生成藥物。

其胚胎早期發(fā)育的過程(guòchéng)中,血管生成的模式比較簡單,主要出現(xiàn)在頭部和軀干部體節(jié)間,體節(jié)間的血管最初由背部的動脈出芽形成于相鄰體節(jié)之間。斑馬魚胚胎共一百零六頁方法：在96孔板上用藥物處理胚胎(pēitāi),通過血管內(nèi)源性堿性磷酸酶染色來顯示血管,進(jìn)而評價藥物對血管生成的作用。結(jié)果：

共一百零六頁共一百零六頁５耐藥性逆轉(zhuǎn)(nìzhuǎn)實驗

腫瘤細(xì)胞耐藥性，分先天性耐藥性和獲得性耐藥性，也可分為原藥耐藥性和多藥耐藥性。多藥耐藥性基因mdr1編碼表達(dá)P-糖蛋白（P-gp）是產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制。P-gp將化療藥物泵出體外，降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度。

１）腫瘤耐藥性體外模型的建立

逐步增加腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中抗癌藥物的濃度（Dox）誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤耐藥株。用MTT法檢測藥物對敏感(mǐngǎn)株和耐藥株的細(xì)胞毒性，同時測定mdr1基因和P-gp表達(dá)水平。共一百零六頁耐藥株敏感(mǐngǎn)株P(guān)-gp敏感(mǐngǎn)株耐藥株共一百零六頁2)逆轉(zhuǎn)(nìzhuǎn)腫瘤多藥耐藥性作用的藥物篩選方法(fāngfǎ)：采用MTT法測定加逆轉(zhuǎn)劑前后DOX對耐藥株的細(xì)胞毒性。計算逆轉(zhuǎn)效果.FR(逆轉(zhuǎn)倍數(shù))=IC50(不加逆轉(zhuǎn)劑)/IC50(加逆轉(zhuǎn)劑）IC50(耐藥性肝癌細(xì)胞株R-HepG2)FRDox160uMDox+Vep31uM5共一百零六頁EffectofNSC23925toreversedrugresisitanceinMDRcelllines共一百零六頁共一百零六頁

用熒光酶標(biāo)儀、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(jiǎncè)加藥前后耐藥細(xì)胞株內(nèi)抗癌藥多柔比星Dox的含量。Control0.5uMDox+1uMVep0.5uMDox0.5uMDox+5uMVep0.5uMDox+10uMVep共一百零六頁HepG/ADMControlVerapamil5mMDrug1.25mMDrug2.5mMDrug5mM多柔比星累積(lěijī)實驗共一百零六頁Rhm123累積(lěijī)實驗ControlVerapamil5mMDrug1.25mMDrug2.5mMDrug5mM共一百零六頁6.抗腫瘤侵襲(qīnxí)和遷移實驗

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征腫瘤的遷移是一個多階段的復(fù)雜過程，Liotta等提出腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的三步學(xué)說，即粘附、降解和移動。粘附是腫瘤細(xì)胞侵襲的起始，腫瘤細(xì)胞通過表面(biǎomiàn)特定受體與基底膜的層粘連蛋白、纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原等相粘連，然后在蛋白水解酶和相關(guān)因子的作用下，侵襲基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)腫瘤細(xì)胞一旦突破基底膜，逃避免疫監(jiān)視，即在基質(zhì)內(nèi)較快侵襲性生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移。阻斷其中任何一個過程，都可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲共一百零六頁１）粘附實驗原理：將Matrigel鋪在96孔板上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)，可以有效地在體外模擬腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞的粘附過程。方法：將Matrigel包被96孔板，過夜，將藥物處理后的細(xì)胞接種在96孔板，1h后，棄去未粘附的細(xì)胞，加入MTT培養(yǎng)，測定吸光度。

結(jié)果：細(xì)胞(xìbāo)粘附

抑制率（%）=（OD對照-OD實驗）OD對照X100%共一百零六頁2）細(xì)胞劃痕實驗(shíyàn)（運(yùn)動能力檢測）方法：細(xì)胞按30000個/孔密度(mìdù)接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁生長到90%融合度，用20uL移液器槍頭在每孔劃出十字形劃痕，PBS清洗后，加入藥物處理后（無血清培養(yǎng)基），顯微鏡下觀察拍照。共一百零六頁ABCDEA:Control;B:Drug20nmol·L-1;C:Drug30nmol·L-1;D:Drug40nmol·L-1;E:Drug50nmol·L-1細(xì)胞運(yùn)動能力(nénglì)實驗共一百零六頁Transwell技術(shù)(jìshù)3）細(xì)胞遷移(qiānyí)和侵襲實驗共一百零六頁原理：腫瘤(zhǒngliú)細(xì)胞在趨化因子的作用下可穿透聚碳酸酯膜，從上室轉(zhuǎn)移到下室，有些藥物可抑制這種遷移。方法：

（1）Transwell小室的制備(zhìbèi)Matrix包被并水化基底膜（2）制備細(xì)胞懸液1~10x105的細(xì)胞/200uL（3）細(xì)胞接種

下室20%FBS的培養(yǎng)液，上室無血清培養(yǎng)液（4）細(xì)胞培養(yǎng)24-48h（5）細(xì)胞染色，拍照并計數(shù)共一百零六頁A:Control;B:Drug20nmol·L-1;C:Drug30nmol·L-1;D:Drug40nmol·L-1;E:Drug50nmol·L-1細(xì)胞遷移能力(nénglì)實驗共一百零六頁細(xì)胞侵襲能力(nénglì)實驗A:Control;B:Drug20nmol·L-1;C:Drug30nmol·L-1;D:Drug40nmol·L-1;E:Drug50nmol·L-1共一百零六頁6.自噬實驗(shíyàn)自噬：是以細(xì)胞器的自我消化和更新為特征生化過程過程：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞(xìbāo)內(nèi)需降解的細(xì)胞(xìbāo)器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實現(xiàn)細(xì)胞(xìbāo)本身的代謝需要和某些細(xì)胞(xìbāo)器的更新。生物功能：一般認(rèn)為自噬是保護(hù)細(xì)胞，但是也可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。共一百零六頁自噬過程(guòchéng)共一百零六頁自噬的特征(tèzhēng)共一百零六頁自噬的檢測(jiǎncè)MDC法

原理：自噬小泡呈偏酸性，綠色的ＭＤＣ熒光染料(rǎnliào)能選擇性聚集方法：加入ＭＤＣ（３ｍＭ）處理15min后，激光共聚焦顯微鏡觀察共一百零六頁LC3-GFP原理：LC3-GFP綠色熒光蛋白克隆細(xì)胞株，出現(xiàn)自噬時伴隨LC3高表達(dá)，呈現(xiàn)綠色熒光染料方法：

藥物處理預(yù)定時間后，激光(jīguāng)共聚焦顯微鏡觀察共一百零六頁相關(guān)(xiāngguān)蛋白表達(dá)LC3Atg5Beclin1p62共一百零六頁四、酶水平(shuǐpíng)的篩選ＤＮＡ拓?fù)?tuòpū)異構(gòu)酶抑制劑篩選

端粒酶酶抑制劑篩選VEGFR酪氨酸蛋白激酶酶抑制劑篩選

組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑篩選法基尼轉(zhuǎn)移酶抑制劑篩選絲裂原活化蛋白激酶抑制劑篩選共一百零六頁ＤＮＡ拓?fù)?tuòpū)異構(gòu)酶抑制劑篩選

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種重要的核酶，通過DNA鏈斷裂和重接而改變(gǎibiàn)DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)其空間構(gòu)型變化，在細(xì)胞生長過程中起重要作用共一百零六頁方法：裂解細(xì)胞,提取拓?fù)?tuòpū)異構(gòu)酶,測定酶總量或酶活

性的變化,在酶反應(yīng)體系中，加入負(fù)超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA,TOPO酶提液及不同濃度的藥

物，溫育30min后，加入反應(yīng)終止液，在瓊脂糖

凝膠中電泳,溴化乙錠染色紫外燈下觀察。結(jié)果：共一百零六頁端粒酶抑制劑篩選(shāixuǎn)

端粒是染色體特殊結(jié)構(gòu),起著保護(hù)染色體的完整和穩(wěn)定性的作用(zuòyòng),端粒酶是一種核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶,可以自身RNA為模板合成端粒末端。正常細(xì)胞端粒酶活性是陰性,而在腫瘤細(xì)胞株表達(dá)高活性。共一百零六頁方法：裂解(lièjiě)細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白含量，ＰＣＲ擴(kuò)增，凝膠電泳，銀染色結(jié)果：端粒是由短DNA重復(fù)序列組成,而端粒酶的作

用是維持端粒末端的長度,因此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

間接反映端粒酶活性。共一百零六頁藥物(yàowù)對腫瘤細(xì)胞端粒長度和端粒酶活性的影響共一百零六頁VEGFR酪氨酸蛋白激酶抑制劑篩選(shāixuǎn)

VEGFR受體酪氨酸蛋白激酶能特異性地將磷酸根轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上使其磷酸化，酪氨酸激酶的異常表達(dá)還與腫瘤(zhǒngliú)的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的化療抗性密切相關(guān)。

以酪氨酸激酶為靶點進(jìn)行藥物研發(fā)成為國際上抗腫瘤藥物研究的熱點。共一百零六頁受體酪氨酸激酶(jīméi)結(jié)構(gòu)示意圖共一百零六頁腫瘤相關(guān)(xiāngguān)的受體酪氨酸激酶共一百零六頁ELISA方法：

以96孔酶標(biāo)板作為實驗容器,加入包被液谷氨酸酪氨酸多聚多肽，孵育過夜。加入受試物和酪氨酸激酶(jīméi)反應(yīng)1h后，加入辣根過氧化物

酶標(biāo)記的小鼠抗磷酸化酪

氨酸單克隆抗體,室溫反應(yīng)30min后,用酶標(biāo)儀讀

取吸光度(OD)值。

共一百零六頁QandAODODODInhibitionrate(%)Blank0.0140.0150.013CTL(1UTrk)0.5740.5820.5980.5uMVA(1UTrk)0.4350.4120.4061uMVA(1UTrk)0.2560.2130.2455uMVA(1UTrk)0.1020.0980.123

試求出不同(bùtónɡ)濃度ＮＡ對酪氨酸蛋白激酶的抑制率共一百零六頁組蛋白去乙酰酶抑制劑篩選(shāixuǎn)

組蛋白是核小體的重要組成部分，組蛋白的乙?；?，DNA構(gòu)象易于展開(zhǎnkāi)，核小體的結(jié)構(gòu)松弛，利于轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄活化因子與DNA的接觸，激活基因轉(zhuǎn)錄過程。

共一百零六頁

組蛋白乙?；福℉AC）和去乙?；福℉DAC）的協(xié)同調(diào)節(jié)作用決定了組蛋白和部分非組蛋白的乙酰化水平，是特定基因表達(dá)的切換開關(guān)。

組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^組蛋白和非組蛋白的乙酰化，阻斷細(xì)胞信號傳導(dǎo)(chuándǎo)途徑某些蛋白的活化，而發(fā)揮抗腫瘤活性。共一百零六頁原理：含乙?；嚢彼岬亩屉谋籋DAC區(qū)去乙酰

化后，發(fā)出熒光（353nm和448nm）.Boc-(Ac)Lys-AMC+HDAC→Boc-Lys-AMC

無熒光熒光

方法：在96孔板中依次加入反應(yīng)(fǎnyìng)緩沖液、短肽

底物、HDAC酶以及不同濃度的抑制

劑，37℃孵育30-60min，加入顯色液

終止反應(yīng)，用熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度共一百零六頁TrichostatinA抑制(yìzhì)HDAC酶活性共一百零六頁基質(zhì)金屬(jīnshǔ)蛋白酶抑制劑篩選基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）為膠原酶，是一種金屬離子依賴的蛋白酶，可有效降解基底膜的主要成分膠原及明膠(mínɡjiāo)，它的異常表達(dá)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。MMPs其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì),參與血管形成、炎癥、腫瘤的侵潤及轉(zhuǎn)移等。

共一百零六頁

原理(yuánlǐ)：熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）FRET肽段底物經(jīng)MMPs酶催化斷裂，EDAN片段發(fā)出熒光（340/490nm）共一百零六頁方法：在96孔或84孔板中依次加入反應(yīng)緩沖(huǎnchōng)

液、FRET肽底物、MMP酶及抑制劑混

勻，5-60min內(nèi)連續(xù)測量熒光強(qiáng)度。試驗組設(shè)置:

陽性對照組（含MMP酶）

抑制劑組（含MMP酶和抑制劑）

溶劑對照組（含MMP酶和測試溶劑）

底物對照組（僅有底物）

測試藥物組（含MMP酶和測試藥物）共一百零六頁法尼基轉(zhuǎn)移酶（Ras）抑制劑篩選(shāixuǎn)

Ras蛋白是調(diào)節(jié)(tiáojié)細(xì)胞生長和增殖的信號通路的重要元件,是控制外來分子信號的分子開關(guān)。Ras蛋白以GDP結(jié)合和GTP結(jié)合兩種形式存在。共一百零六頁原理：

(pulldownassay)

活化形式的GTP-Ras與下游的效應(yīng)蛋白Raf（Raf有Ras-bindingdomain，Raf-RBD）結(jié)合(jiéhé)。

Raf-RBD-GST融合蛋白固化谷胱甘肽親

和樹脂

（G