45 豬生長(zhǎng)抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備

PAGEPAGE29序號(hào)：編碼：第十屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽作品申報(bào)書(shū)作品名稱(chēng)：豬生長(zhǎng)抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備學(xué)校全稱(chēng)：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)申報(bào)者姓名（集體名稱(chēng)）：張雨微類(lèi)別：□√自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類(lèi)社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類(lèi)□科技發(fā)明制作B類(lèi)說(shuō)明1．申報(bào)者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說(shuō)明各項(xiàng)內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫(xiě)。2．申報(bào)者在填寫(xiě)申報(bào)作品情況時(shí)只需根據(jù)個(gè)人項(xiàng)目或集體項(xiàng)目填寫(xiě)A1或A2表，根據(jù)作品類(lèi)別（自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會(huì)科學(xué)類(lèi)社會(huì)調(diào)查報(bào)告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫(xiě)B(tài)1、B2或B3表。所有申報(bào)者可根據(jù)情況填寫(xiě)C表。3．表內(nèi)項(xiàng)目填寫(xiě)時(shí)一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報(bào)書(shū)可復(fù)制。4．序號(hào)、編碼由第十屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽組委會(huì)填寫(xiě)。5．學(xué)術(shù)論文、社會(huì)調(diào)查報(bào)告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請(qǐng)附中文本），請(qǐng)以4號(hào)楷體打印在A4紙上（文章版面尺寸14.5×22cm），附于申報(bào)書(shū)后，論文不超8000字，調(diào)查報(bào)告不超15000字。6．作品申報(bào)書(shū)須按要求由各校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。7．其他參賽事宜請(qǐng)向本校競(jìng)賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢(xún)。A1．申報(bào)者情況（個(gè)人項(xiàng)目）說(shuō)明：1．必須由申報(bào)者本人按要求填寫(xiě)，申報(bào)者情況欄內(nèi)必須填寫(xiě)個(gè)人作品的第一作者（承擔(dān)申報(bào)作品60%以上的工作者）；2．本表中的學(xué)籍管理部門(mén)簽章視為對(duì)申報(bào)者情況的確認(rèn)。姓名張雨微性別女出生年月1988年5月申報(bào)者情況學(xué)校全稱(chēng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)專(zhuān)業(yè)動(dòng)物生物技術(shù)現(xiàn)學(xué)歷本科年級(jí)三學(xué)制四年入學(xué)時(shí)間2006年9月作品全稱(chēng)豬生長(zhǎng)抑素(SS)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山學(xué)生宿舍23棟505郵政編碼510640單位電話常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)華山學(xué)生宿舍23棟505郵政編碼510640住宅電作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位葉康男21本科華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資格認(rèn)定學(xué)校學(xué)籍管理部門(mén)意見(jiàn)是否為2009□√是□否若是，其學(xué)號(hào)為：200630380131（部門(mén)蓋章）2009年4月13日院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖?jiàn)本作品是否為課外學(xué)術(shù)科技或社會(huì)實(shí)踐活動(dòng)成果□√是□否負(fù)責(zé)人簽名：2009年4月13日

B1．申報(bào)作品情況（自然科學(xué)類(lèi)學(xué)術(shù)論文）說(shuō)明：1．必須由申報(bào)者本人填寫(xiě)；2．本部分中的科研管理部門(mén)簽章視為對(duì)申報(bào)者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3．作品分類(lèi)請(qǐng)按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫(xiě)；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱(chēng)豬生長(zhǎng)抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備作品分類(lèi)（D）A．機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動(dòng)化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計(jì)算機(jī)、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫(xiě)的目的和基本思路SS于1972年首次發(fā)現(xiàn)能抑制GH的分泌，目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對(duì)GH、IGF－I等的抑制，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動(dòng)物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕?dòng)物的生產(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達(dá)水平可長(zhǎng)久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本實(shí)驗(yàn)在已有研究的基礎(chǔ)上，擬選擇在動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控中起重要作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子-生長(zhǎng)抑素（SS）作為靶基因，制備最優(yōu)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長(zhǎng)的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并為研究動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控提供有益的動(dòng)物模型。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處（1）在方法上創(chuàng)新性為動(dòng)物整體水平上緘默SS基因表達(dá)提供優(yōu)良RNAi效應(yīng)的shRNA序列；（2）在思路上前沿性提出利用慢病毒載體與RNAi技術(shù)相結(jié)合廉價(jià)，為快速生產(chǎn)SS基因部分緘默的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。作品的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義本實(shí)驗(yàn)選擇在動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控中起重要作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子-生長(zhǎng)抑素（SS）作為靶基因，制備最優(yōu)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長(zhǎng)的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，為畜牧業(yè)動(dòng)物育種改良可提供良好的經(jīng)濟(jì)利益和社會(huì)效益，也為這項(xiàng)技術(shù)早日進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用打下基礎(chǔ)，并可為研究動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控提供有益的動(dòng)物模型。學(xué)術(shù)論文文摘生長(zhǎng)抑素SS是動(dòng)物生長(zhǎng)激素GH釋放的負(fù)性因子，其在血液中濃度下降（如免疫中和）能間接促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。下調(diào)SS基因的表達(dá)成了改良動(dòng)物生長(zhǎng)性能的方法。我們用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)SS-HBsAg融合蛋白產(chǎn)生中和抗體得到促生長(zhǎng)效果。RNAi緘默靶基因的表達(dá)在多種生物體內(nèi)獲得成功應(yīng)用。shRNA是模仿體內(nèi)miRNA的結(jié)構(gòu)而構(gòu)建的能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的短發(fā)夾RNA，引起特異的RNAi效應(yīng)。慢病毒載體能感染分裂細(xì)胞也能感染靜止細(xì)胞，有很強(qiáng)的感染和整合能力，是目前應(yīng)用前景廣泛的一種基因轉(zhuǎn)移載體。本研究在以往工作基礎(chǔ)上，結(jié)合RNAi和慢病毒載體技術(shù)，設(shè)計(jì)和篩選產(chǎn)生SS靶基因RNAi效應(yīng)的shRNA表達(dá)序列，以便通過(guò)慢病毒載體的介導(dǎo)下整合到動(dòng)物胚胎細(xì)胞染色體上，生產(chǎn)出攜帶SS-shRNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。通過(guò)RNAi效應(yīng)在動(dòng)物整體水平上緘默SS的表達(dá)，從遺傳改造的角度達(dá)到提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能的目的。為提高畜牧業(yè)動(dòng)物生產(chǎn)性能打下理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)，同時(shí)為動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的研究建立良好動(dòng)物模型。作品在何時(shí)、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會(huì)議上或報(bào)刊上發(fā)表及所獲獎(jiǎng)勵(lì)2008年中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物生理生化學(xué)分會(huì)（西安.楊凌）《畜牧與獸醫(yī)》增刊：《慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾生長(zhǎng)抑素表達(dá)下調(diào)及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立》；2009年“挑戰(zhàn)杯”華南農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽二等獎(jiǎng)。鑒定結(jié)果無(wú)請(qǐng)?zhí)峁?duì)于理解、審查、評(píng)價(jià)所申報(bào)作品具有參考價(jià)值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄SS基因RNAi干涉效果的篩選慢病毒載體的制備DieckhoffB,PetersenB,KuesWA.,KurthR,NiemannH,DennerJ.Knockdownofporcineendogenousretrovirus(PERV)expressionbyPERV-specificshRNAintransgenicpigs.Xenotransplantation.2008;15:36-45.白莉，楊忠亮，李榮田．2008．用于RNA干涉的siRNA的設(shè)計(jì)與合成．黑龍江科技信息．06：2申報(bào)材料清單（申報(bào)論文一篇，相關(guān)資料名稱(chēng)及數(shù)量）《豬生長(zhǎng)抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備》動(dòng)物的生產(chǎn)性能是畜牧業(yè)發(fā)展過(guò)程中的重要經(jīng)濟(jì)性狀，生長(zhǎng)抑素(SSI)是抑制動(dòng)物生長(zhǎng)的主要因素。SST主動(dòng)免疫和添加SST抑制劑雖然取得了一定的效果但是仍不理想，而傳統(tǒng)的育種方法在改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能方面進(jìn)程非常緩慢，因而探索探索新的方法和技術(shù)十分必要。RNAi是下調(diào)靶基因的有效方法，慢病毒載體也是目前應(yīng)用前景最廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體，本試驗(yàn)根據(jù)靶基因SST設(shè)計(jì)和篩選出了最優(yōu)RNAi效應(yīng)的靶基因-shRNA序列，并已成功構(gòu)建到慢病毒載體上，通過(guò)慢病毒載體和精原干細(xì)胞介導(dǎo)聯(lián)合制備出穩(wěn)定表達(dá)靶基因-shRNA的可遺傳的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，利用RNAi效應(yīng)在動(dòng)物整體水平上下調(diào)SST的表達(dá)，從而到達(dá)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能的目的?？蒲泄芾聿块T(mén)簽章年月日C.當(dāng)前國(guó)內(nèi)外同類(lèi)課題研究水平概述說(shuō)明：1.申報(bào)者可根據(jù)作品類(lèi)別和情況填寫(xiě)；2.填寫(xiě)此欄有助于評(píng)審。（1）生長(zhǎng)抑素對(duì)生長(zhǎng)激素分泌的負(fù)調(diào)控：生長(zhǎng)激素（growthhormone,GH）是調(diào)節(jié)動(dòng)物和人生長(zhǎng)的主要激素，由垂體分泌，主要受下丘腦分泌的正性調(diào)控因子即生長(zhǎng)激素釋放因子（growthhormonereleasingfactor,GRF）或稱(chēng)生長(zhǎng)激素釋放激素（growthhormonereleasinghormone,GHRH）和負(fù)性調(diào)控因子即生長(zhǎng)激素釋放抑制激素（somatostatin,SS）或簡(jiǎn)稱(chēng)生長(zhǎng)抑素的雙向調(diào)節(jié)。研究表明SS能抑制腦垂體細(xì)胞的cAMP生成，提高cGMP濃度，抑制GH的合成與釋放，降低血液GH濃度。同時(shí)SS還能調(diào)節(jié)GRF的釋放，影響GRF基因的表達(dá)，通過(guò)拮抗GRF的作用以協(xié)同控制GH的水平。（2）生長(zhǎng)抑素在動(dòng)物促生長(zhǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用：GH的水平影響骨、軟骨的生長(zhǎng)以及肌蛋白的合成與沉積等，從而影響動(dòng)物和人的生長(zhǎng)狀況。在生產(chǎn)應(yīng)用上GH具有促生長(zhǎng)，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面的作用，有著廣泛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。生長(zhǎng)抑素（SS）通過(guò)抑制垂體分泌GH，從而降低GH水平。目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對(duì)GH、IGF－I等的抑制，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的，如主動(dòng)免疫技術(shù)。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動(dòng)物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕?dòng)物的生產(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達(dá)水平可長(zhǎng)久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。（3）RNAi技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：RNAi（RNAinterference）稱(chēng)為RNA干涉，通過(guò)雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解，導(dǎo)致目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄后緘默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）的現(xiàn)象或機(jī)制。在動(dòng)物機(jī)體中，有兩種小分子RNA能介導(dǎo)這種現(xiàn)象的發(fā)生，microRNA(miRNA)和siRNA。前者形成分子內(nèi)雙鏈RNA，后者形成分子間雙鏈RNA，兩者雙鏈RNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)Dicer酶切割成長(zhǎng)度約為21~25個(gè)nt片段，即小分子雙鏈RNA。在解旋酶(helicase)的作用下解開(kāi)雙鏈RNA，其中僅保留一條RNA鏈與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)結(jié)合，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別靶mRNA，引起靶mRNA被剪切降解或翻譯的抑制。2002年，Hasuwa等人成功地建立了第一例應(yīng)用RNAi的轉(zhuǎn)基因小鼠。幾乎同時(shí)多數(shù)研究者們利用RNA聚合酶III的啟動(dòng)子構(gòu)建shRNA的載體應(yīng)用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系，結(jié)果對(duì)靶基因均產(chǎn)生了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄后緘默效果，表達(dá)下降90%以上。2006年Dann等人通過(guò)慢病毒介導(dǎo)RNAi敲除了大鼠上的Dazal基因，構(gòu)建了兩條shRNA序列（pLLU2G-Dazl1和pLLU2G-Dazl2），結(jié)果這兩條轉(zhuǎn)基因序列對(duì)靶基因Dazal的表達(dá)均產(chǎn)生了幾乎完全的抑制，并在后代中獲得了穩(wěn)定的可遺傳的Dazl-shRNA轉(zhuǎn)基因大鼠。shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠的出現(xiàn)使得RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物整體水平上進(jìn)行靶基因的敲低或緘默成為可能。研究表明與建立在胚胎干細(xì)胞和同源重組技術(shù)上的基因敲除相比，用RNAi技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物無(wú)論是時(shí)間上還是在效率上都有著很大的優(yōu)勢(shì)。（4）慢病毒載體的特點(diǎn)與構(gòu)建：慢病毒（lentivirus）是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，引起慢性感染得名。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比不僅感染分裂細(xì)胞、也感染非分裂細(xì)胞，即靜止細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、造血干細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等，大大提高了感染效率，感染之后能高效整合和表達(dá)目的基因。用慢病毒載體感染動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎細(xì)胞能有效構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。Hofmann等用含GFP目的基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬胚胎，產(chǎn)下46只小豬中，有32只攜帶GFP基因，其中30只能表達(dá)GFP。同時(shí)用該載體轉(zhuǎn)染牛的卵母細(xì)胞時(shí)也獲得了GFP高表達(dá)率。慢病毒載體（lentiviralvector,LV）的構(gòu)建原理是將HIV-1基因組中的順式作用元件（如包裝信號(hào)和長(zhǎng)末端重復(fù)序列）和編碼反式作用蛋白的序列分離。載體系統(tǒng)分成包裝部分和載體部分，其中包裝部分由去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列構(gòu)成，僅提供病毒包裝所需蛋白；載體部分與包裝部分互補(bǔ)，含包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需順式作用序列。（5）慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用：慢病毒載體（LV）于1996年發(fā)展以來(lái)只是用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因治療的研究，但直到2002年Lois等將其用于轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠的制備，之后LV在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上獲得極大的發(fā)展與應(yīng)用。與顯微注射法相比，免去了操作困難、效率低下和成本過(guò)高的缺點(diǎn)。LV法相對(duì)操作簡(jiǎn)單、整合能力強(qiáng)，通過(guò)感染早期胚胎或受精卵細(xì)胞即可獲得轉(zhuǎn)基因胚胎。由于LV的高效率感染和在宿主細(xì)胞DNA上的高度整合特性，可以大大提高外源基因的轉(zhuǎn)移效率。D.推薦者情況及對(duì)作品的說(shuō)明說(shuō)明：1．由推薦者本人填寫(xiě)；2．推薦者必須具有高級(jí)專(zhuān)業(yè)技術(shù)職稱(chēng)，并是與申報(bào)作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專(zhuān)家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫(xiě)此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對(duì)推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名張永亮性別男年齡46職稱(chēng)教授/博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州市天河區(qū)五山郵政編碼510642單位電宅電話推薦者所在單位簽章張永亮老師是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院院長(zhǎng)，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)系教授、博士生導(dǎo)師。全國(guó)動(dòng)物生理生化分會(huì)副理事長(zhǎng)、農(nóng)業(yè)生化與分子生物學(xué)分會(huì)理事、吉林省生化與分子生物學(xué)理事、全軍專(zhuān)業(yè)生化委員會(huì)委員，《中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)》編委。（簽章）2009年4月13日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述申報(bào)內(nèi)容真實(shí)可信，已有一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)該作品具備較好的前期基礎(chǔ)，具有一定得科學(xué)研究?jī)r(jià)值。研究手段較先進(jìn)，技術(shù)路線明確，實(shí)驗(yàn)條件具備。所獲慢病毒是一種廣泛應(yīng)用的基因轉(zhuǎn)移載體，所獲轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有較好的示范和推廣前景。值得進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。其它說(shuō)明推薦者情況姓名張守全性別男年齡45職稱(chēng)教授/博導(dǎo)工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院通訊地址廣州市五山路483號(hào)郵政編碼510642單位電宅電話推薦者所在單位簽章張守全老師是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院副院長(zhǎng)，動(dòng)物遺傳育種與繁殖系教授、博士生導(dǎo)師，廣東省高等學(xué)?！扒О偈こ獭毙＜?jí)培養(yǎng)對(duì)象。目前兼職廣東省人體組織工程學(xué)會(huì)常務(wù)理事；廣東省養(yǎng)豬行業(yè)協(xié)會(huì)顧問(wèn)等。（簽章）2009年4月13日請(qǐng)對(duì)申報(bào)者申報(bào)情況的真實(shí)性作出闡述該研究結(jié)果由張雨微、葉康兩位同學(xué)在導(dǎo)師的指導(dǎo)下完成的。請(qǐng)對(duì)作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評(píng)價(jià)該作品以生長(zhǎng)抑素（SS）作為靶基因，制備優(yōu)化了RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以期獲得促生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，為畜牧業(yè)動(dòng)物育種改良可提供良好的經(jīng)濟(jì)利益和社會(huì)效益，并可為研究動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控提供有益的動(dòng)物模型。該研究成果通過(guò)中試后，可在畜牧生產(chǎn)應(yīng)用，應(yīng)用前景較廣。其它說(shuō)明學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章（團(tuán)委代章）2009年4月13日校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門(mén)確認(rèn)蓋章2009年4月13日E．大賽組織委員會(huì)秘書(shū)處資格和形式審查意見(jiàn)組委會(huì)秘書(shū)處資格審查意見(jiàn)審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書(shū)處形式審查意見(jiàn)審查人（簽名）年月日組委會(huì)秘書(shū)處審查結(jié)果□合格□不合格負(fù)責(zé)人（簽名）年月日豬生長(zhǎng)抑素（SS）RNAi效應(yīng)的假型慢病毒制備作者：張雨微葉康指導(dǎo)老師：張永亮教授習(xí)欠云講師作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州，510640【摘要】生長(zhǎng)抑素(SST)是抑制動(dòng)物生長(zhǎng)的主要因子。SST主動(dòng)免疫和添加SST抑制劑對(duì)提高動(dòng)物生長(zhǎng)取得了一定的效果但仍不理想，而傳統(tǒng)的育種方法在改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能方面進(jìn)程非常緩慢，因而探索探索新的方法和技術(shù)十分必要。RNAi是下調(diào)靶基因的有效方法，慢病毒載體也是目前應(yīng)用前景最廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體。本研究根據(jù)靶基因SST設(shè)計(jì)和篩選出了最優(yōu)RNAi效應(yīng)的靶基因-shRNA序列，通過(guò)RIA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中SS濃度，結(jié)果表明SS-shRNA產(chǎn)生的siRNA對(duì)SST基因表達(dá)抑制率為86.3-87.9%。并已成功將SS-shRNA序列構(gòu)建到慢病毒載體上，利用慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)成功包裝出假病毒顆粒，經(jīng)測(cè)定病毒原液的滴度達(dá)到5×104ifu/ml，超速離心后病毒滴度為5×109ifu/ml，該病毒滴度完全滿(mǎn)足慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備的需要。本研究為下一步慢病毒載體與動(dòng)物生殖細(xì)胞聯(lián)合介導(dǎo)制備靶基因-shRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)RNAi效應(yīng)在動(dòng)物整體水平上下調(diào)SST的表達(dá)，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】生長(zhǎng)抑素RNAi效應(yīng)假型慢病毒【正文】1引言1.1生長(zhǎng)抑素在動(dòng)物促生長(zhǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用動(dòng)物生長(zhǎng)的過(guò)程受很多激素調(diào)節(jié)，其中生長(zhǎng)激素（GH，GrowthHormone）是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)的核心之一。GH的水平影響骨、軟骨的生長(zhǎng)以及肌蛋白的合成與沉積等，從而影響動(dòng)物和人的生長(zhǎng)狀況。在生產(chǎn)應(yīng)用上GH具有促生長(zhǎng)，提高瘦肉率、抑制脂肪合成以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面的作用，有著廣泛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。生長(zhǎng)抑素（SS）通過(guò)抑制垂體分泌GH，從而降低GH水平。目前在生產(chǎn)上采取降低SS水平，解除SS對(duì)GH、IGF－I等的抑制，達(dá)到促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的目的，如主動(dòng)免疫技術(shù)。隨著胚胎技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，在動(dòng)物整體水平上敲除或沉默目的基因或?qū)胪庠椿蚋牧紕?dòng)物的生產(chǎn)性能已得到了廣泛的研究與應(yīng)用。一種比較好的研究思路和策略就是在整體水平上敲除或沉默SS基因或降低表達(dá)水平可長(zhǎng)久性、可遺傳性獲得低SS水平的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。1.2慢病毒載體與RNAi技術(shù)聯(lián)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物目前制約轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)業(yè)化的瓶頸問(wèn)題主要表現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因成本高、效率低、外源基因表達(dá)量不高以及遺傳性狀不穩(wěn)定等方面。在已建立的轉(zhuǎn)基因方法中，比較成熟的有顯微注射法和體細(xì)胞克隆法，目前多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是通過(guò)這兩種方法獲得的。DNA顯微注射法是最早出現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)基因方法，該方法需要嚴(yán)格的顯微操作技術(shù)，制作成本高（6-30萬(wàn)美元）、效率低（<1%）等特點(diǎn)，比較難以大眾化推廣應(yīng)用。體細(xì)胞核移植法是目前認(rèn)為效率較高、應(yīng)用廣泛的一種轉(zhuǎn)基因方法。該法在連續(xù)的胚胎克隆會(huì)積累后成遺傳的錯(cuò)誤，降低了克隆的效率。因此通過(guò)克隆方法增加個(gè)體后代比較困難。雖然該法轉(zhuǎn)基因率100%，但由于克隆胚胎的制備成功率為0.05-1.2%，因而整個(gè)轉(zhuǎn)基因效率跟顯微注射法差不多。此外，胚胎干細(xì)胞法目前在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動(dòng)物上應(yīng)用較晚，還不成熟。其他幾種方法相對(duì)操作簡(jiǎn)單、成本低，但還沒(méi)有成熟。如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)法、精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法以及睪丸介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法等均存在外源基因整合效率差的問(wèn)題。尋找和探索高效、經(jīng)濟(jì)、便捷的轉(zhuǎn)基因的新技術(shù)和新方法有著重要的意義和緊迫性。慢病毒（lentivirus，LV）載體法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種有效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于其高整合和高表達(dá)效應(yīng)、低成本和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)有望成為一種應(yīng)用廣泛的新型基因轉(zhuǎn)移載體。目前利用慢病毒載體在許多動(dòng)物上獲得了成功，如小鼠、大鼠、牛、豬、羊等。與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法相比，慢病毒不僅可以感染靜止細(xì)胞，還能感染分裂細(xì)胞，極大地提高了感染力；同時(shí)研究表明將慢病毒載體LTRs內(nèi)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子用通用或組織特異性啟動(dòng)子取代，轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)效率可達(dá)到31%，表達(dá)效率達(dá)90%以上，表明除了高的感染力、很高的整合效率和表達(dá)效率，同時(shí)成本大約是顯微注射法的十分之一。很有希望發(fā)展成為簡(jiǎn)捷、高效、低成本的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。但是目前慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法在安全性、甲基化沉默和定點(diǎn)整合方面還有待于進(jìn)一步改進(jìn)。若將慢病毒載體與上述轉(zhuǎn)基因技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)尋找和探索高效、經(jīng)濟(jì)、便捷的轉(zhuǎn)基因的新技術(shù)和新方法有著重要的意義。過(guò)去轉(zhuǎn)基因的目的主要通過(guò)兩種途徑，一是直接轉(zhuǎn)入外源基因過(guò)量表達(dá)，如生物反應(yīng)器；二是同源重組敲除（knock-out）靶基因，如疾病動(dòng)物模型和器官移植，但完全敲除某個(gè)功能基因，在有些情況下可能會(huì)引發(fā)了一系列新的機(jī)能紊亂。將目標(biāo)基因的功能只是部分調(diào)控（knockdown），在改變動(dòng)物的某些重要性狀方面將會(huì)有重要的作用。近年來(lái)一系列研究表明，動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育是由一系列復(fù)雜、多層次的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控。與基因敲除相比，將靶基因的功能只是部分下調(diào)，既可以維持動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)整體性，又可以改變動(dòng)物的某些重要性狀，所以該項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種方面將會(huì)有重要的作用。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型轉(zhuǎn)基因打靶技術(shù),是目前部分調(diào)控目的基因表達(dá)的有效方法。RNAi技術(shù)是建立在非編碼小分子RNA如miRNA(microRNA)和siRNA（smallinterferingRNA）對(duì)基因表達(dá)特異性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上。這種調(diào)節(jié)活動(dòng)通過(guò)下調(diào)目的基因的表達(dá)，影響動(dòng)物的各種發(fā)育和生理過(guò)程，如細(xì)胞分化、組織和器官發(fā)育、內(nèi)分泌、新陳代謝、免疫應(yīng)答以及疾病的發(fā)生等。短發(fā)夾RNA(ShorthairpinRNA，shRNA)是一種人工設(shè)計(jì)的RNA分子，可以在細(xì)胞內(nèi)加工成siRNA來(lái)發(fā)揮作用?？梢酝ㄟ^(guò)構(gòu)建載體來(lái)表達(dá)目的基因的RNA干涉分子，并通過(guò)siRNA和miRNA途徑下調(diào)目的基因的表達(dá)。目前通過(guò)慢病毒載體和RNA干涉技術(shù)聯(lián)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)已經(jīng)在大鼠、小鼠、羊，尤其在豬上有成功的報(bào)道。1.3本研究的思路本研究選擇在動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控中起重要作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子-生長(zhǎng)抑素（SS）作為靶基因，制備最優(yōu)RNAi效應(yīng)的假型慢病毒，以便從遺傳角度有效獲得促生長(zhǎng)的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，為畜牧業(yè)動(dòng)物育種改良可提供良好的經(jīng)濟(jì)利益和社會(huì)效益，也為這項(xiàng)技術(shù)早日進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用打下基礎(chǔ)，并可為研究動(dòng)物生長(zhǎng)調(diào)控提供有益的動(dòng)物模型。在方法上創(chuàng)新性為動(dòng)物整體水平上緘默SS基因表達(dá)提供優(yōu)良RNAi效應(yīng)的shRNA序列；在思路上前沿性提出利用慢病毒載體與RNAi技術(shù)相結(jié)合廉價(jià)，為快速生產(chǎn)SS基因部分緘默的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2實(shí)驗(yàn)材料主要質(zhì)粒與試劑：限制性?xún)?nèi)切酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶DNAMarker、dNTPs以及RibonucleaseInhibitor等均購(gòu)自大連TaKaRa公司。大腸桿菌DH5α、pcDNA3.1(-)質(zhì)粒均由本室保存；NIH3T3細(xì)胞株為本室保存。pshRNA-copGFPLentivector穿梭質(zhì)粒、慢病毒包裝系統(tǒng)pPACKLentivectorPackagingSystem，該系統(tǒng)為四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法即一個(gè)穿梭質(zhì)粒，三個(gè)包裝質(zhì)粒pPackA(pREV)、pPackB(pVsv-g)及pPackC(pGag-pol)從上海倍尼菲生物科技有限公司購(gòu)得。3實(shí)驗(yàn)方法3.1生長(zhǎng)抑素（SS）基因siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank上的豬的SS基因mRNA的序列（序列號(hào)：NM_001009583）設(shè)計(jì)SS的siRNA。設(shè)計(jì)原則為：從起始密碼AUG下游50～100nt開(kāi)始，避開(kāi)5’端或3’端的UTRs，搜索AA（N19）序列；有義鏈1位為G或C，19位為A或U，雙鏈5’端能量應(yīng)該比3’端高，即有義鏈15～19至少有3個(gè)A或U，或者13～19至少有5個(gè)A或U；siRNA5’端必須磷酸化，3’端懸垂兩個(gè)dTdT，或是UU；選擇GC含量在30%～50%的siRNA，亦有報(bào)道GC含量不宜超過(guò)36.8%；16位最好為C，13位最好為非G；避免超過(guò)三個(gè)G或三個(gè)C重疊，多聚G或多聚C序列能產(chǎn)生堆積形成類(lèi)聚物而干擾沉默機(jī)制；使用BLAST(/BLAST/)將潛在的靶序列和相應(yīng)的豬的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列；由于RNApolⅢ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)是連續(xù)的6個(gè)“T”的多聚核苷酸，因此，應(yīng)避免在靶序列中存在≥4個(gè)“T”靶序列1（siRNA1）：5’-AAGACTTTCACATCCTGTTAG靶序列2（siRNA2）：5’-AAGAATTTCTTCTGGAAGACT-33.2發(fā)夾SS-siRNA轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成按照pshRNA-copGFPLentivector的說(shuō)明進(jìn)行設(shè)計(jì)與合成，圖1是如何將siRNA靶序列轉(zhuǎn)換成為轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸序列的程序示意圖。兩個(gè)反向互補(bǔ)排列的19nt特異性靶序列由一個(gè)12nt（5’-CTTCCTGTCAGA-3’）的loop相連接，形成莖環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄模板兩端分別為BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，并以5個(gè)T作為RNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄終止子。分別合成發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)錄模板的兩條相應(yīng)的圖1發(fā)夾siRNA轉(zhuǎn)錄模板的設(shè)計(jì)shRNA-DNA合成片段信息：siRNA1-f：5’-GATCCGACTTTCACATCCTGTTAGTTCAAGAGACTAACAGGATGTGAAAGTCTTTTTTG-3siRNA1-r：5’-AATTCAAAAAAGACTTTCACATCCTGTTAGTCTCTTGAACTAACAGGATGTGAAAGTCG-3siRNA2-f：5’-GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTTG-3siRNA2-r：5’-AATTCAAAAAATCTCTTGAAAGTCTTCCAGAAGAAATTCG-3’同時(shí)模板鏈兩端分別設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和EcoRⅠ，由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成。3.3SS-siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定圖2為pshRNA-copGFPLentivector載體圖，此載體帶有H1RNApolⅢ啟動(dòng)子（3761bp～3977bp）及哺乳動(dòng)物熒光篩選標(biāo)記copGFP（2279bp～3037bp）。圖2pshRNA-copGFPLentivector載體圖1.退火，溶解轉(zhuǎn)錄模板DNA，稀釋至濃度為1μg/μL，準(zhǔn)備退火溶液。單鏈各1μg混合于10×退火溶液中，90℃1~3min,37℃1h，得到轉(zhuǎn)錄模板雙鏈DNA插入片段，濃度為10ng/μL，2.載體pshRNA-copGFP質(zhì)粒通過(guò)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，37℃酶切過(guò)夜。1%瓊脂糖凝膠電泳，博大泰克凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。3.將shRNA-DNA退火產(chǎn)物與雙切pshRNA-copGFPLentivector 載體連接，16℃水浴連接，反應(yīng)過(guò)夜。4.轉(zhuǎn)化。取連接反應(yīng)產(chǎn)物（設(shè)陰性對(duì)照質(zhì)粒）加入到適量E.coli(DH5α)感受態(tài)細(xì)胞中，CaCl2法轉(zhuǎn)化。Amp(50μg/mL)篩選。5.陽(yáng)性菌落的PCR擴(kuò)增。挑取樣品陽(yáng)性單菌落，使用多克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性菌落。其中Fprimer：5’-AATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTAT-3’、Rprimer：5’-TGGTCTAACCAGAGAGACCCAGTA-3’。PCR反應(yīng)條件如下：94℃10分鐘，94℃30秒,55℃30秒，72℃30秒。反應(yīng)進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物在6.使用PCR產(chǎn)物5μL上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；7.若電泳片段大小正確，則挑取陽(yáng)性菌落于3mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃8.提取質(zhì)粒，使用載體上的引物（F/Rprimer）將質(zhì)粒DNA送測(cè)序，比對(duì)測(cè)試結(jié)果與設(shè)計(jì)DNA的序列是否一致。圖3pcDNA3.1(+/-)載體圖Fig.3pcDNA3.1(+/-)VectorMap3.4真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SST圖3pcDNA3.1(+/-)載體圖Fig.3pcDNA3.1(+/-)VectorMap1、SST-cDNA的擴(kuò)增根據(jù)SST基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增SST包含編碼區(qū)和3’上游引物：5’-GGAATTCATGCTGTCCTGCCGCCTEcoRI下游引物：5’-CCCAAGCTTCTAACAGGATGTGAAAGHindIII以豬的下丘腦提取RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，引物為SST的上下游引物，擴(kuò)增的目的片段為351bp。PCR反應(yīng)采用50μL反應(yīng)體系。體系的組成為：10×PCR緩沖液5μL，2.6mmol/LdNTP4μL，上游引物（10pmol/μL）1μL，下游引物（10pmol/μL）1μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.3μL，補(bǔ)加ddH2O至50μL。按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃，2min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，3min，共35個(gè)循環(huán)，然后2、目的基因SSTPCR產(chǎn)物的純化將剩余的PCR產(chǎn)物，用試劑盒純化PCR產(chǎn)物，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。3、SST克隆到pMD18-T載體將上述純化的片段作為插入片段，連接到pMD18-T載體上。連接反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物6μL，2×LigationBuffer7.5μL，T4DNALigase1μL，pMD18-TVector0.5μL，總體積15.0μL。室溫作用1h。連接產(chǎn)物命名為T(mén)-SST。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，然后進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取與鑒定。利用生物分析軟件DNAMAN進(jìn)行同源性分析。4、pcDNA3.1-SST載體構(gòu)建EcoRI與HindⅢ雙酶切pcDNA3.1(-)，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收載體大片段5kb左右片段。酶切T-SST，回收SST片段，然后進(jìn)行SST目的片段與pcDNA3.1(-)大片段的連接與轉(zhuǎn)化。用試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定并測(cè)序，條件同前。3.5RNA干擾有效靶點(diǎn)的篩選1、三種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞將pcDNA3.1-SS分別和LV-siRNA1、LV-siRNA2共轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。設(shè)pcDNA3.1-SS單獨(dú)轉(zhuǎn)染和空細(xì)胞對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。其中pcDNA3.1-SS與慢病毒干擾質(zhì)粒的比例為1：6。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，按照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后48h，部分細(xì)胞用Trizol收集（一般用6孔培養(yǎng)板），-7048h收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，離心1000r/min，5min，沉淀加入200μL細(xì)胞裂解液劇烈震蕩，裂解細(xì)胞，離心1000r/min，5min，上清-702、RIA檢測(cè)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用RIA方法測(cè)定，檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中SST的濃度。操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。3、數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示。對(duì)同一品種的數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析(one-wayANOVA)，并進(jìn)行鄧肯氏多重比較(Duncan’smultiplerangetest)；P<0.05為差異顯著。3.6病毒包裝293T細(xì)胞的培養(yǎng)1、細(xì)胞的凍存取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞并鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶的90%，用0.05%胰酶消化至細(xì)胞變圓、即將漂浮時(shí)，加至少10倍體積的含有10%的FBS的培養(yǎng)液中止反應(yīng)，800r/min離心5min，無(wú)菌吸管吸棄液體，加入完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度應(yīng)=1×106細(xì)胞/mL)，加入終濃度為10%的DMSO，用凍存管分裝，4℃1h，-20℃2h，-702、細(xì)胞的復(fù)蘇從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，應(yīng)帶防護(hù)手套。迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不時(shí)搖動(dòng)，盡快解凍。用70%酒精擦拭消毒后，移至凈化臺(tái)上，吸出細(xì)胞懸液至離心管中，加入10mLD-MEM洗滌，800r/min離心5min，棄上清。將沉淀用含10％胎牛血清的D-MEM懸浮后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO3、細(xì)胞的傳代(1)待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，吸棄培養(yǎng)基，加入滅菌PBS溶液，輕輕晃動(dòng)，洗滌細(xì)胞生長(zhǎng)面，然后棄去PBS溶液。(2)加入0.25%胰酶進(jìn)行消化，待倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞已收縮變圓時(shí)，加入含10%胎牛血清的D-MEM終止反應(yīng)，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，并將其分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，即完成1次傳代。4、高純度無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒制備使用EndoFree?PlasmidMaxiKit制備無(wú)內(nèi)毒素LV-siRNA1及三個(gè)包裝質(zhì)粒pPackA、pPackB及pPackC，質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之間。5、高純度無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒制備使用EndoFree?PlasmidMaxiKit制備無(wú)內(nèi)毒素LV-siRNA1及三個(gè)包裝質(zhì)粒pPackA、pPackB及pPackC，質(zhì)粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之間。6、質(zhì)粒的定量將各次大量制備的質(zhì)粒DNA在GeneQuant上進(jìn)行定量。具體方法是：將質(zhì)粒進(jìn)行100、200、400倍比稀釋?zhuān)胐dH2O作空白對(duì)照，分別測(cè)定三次取平均值，讀取樣品的dsDNA濃度，然后計(jì)算出dsDNA的量。7、慢病毒的包裝（1）細(xì)胞的轉(zhuǎn)染：A.轉(zhuǎn)染前2-3天，用含有滅活的血清和抗生素的D-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染前一天，在新的10cm的培養(yǎng)皿中接種5×106293T細(xì)胞，完全吹散細(xì)胞以保證細(xì)胞均勻的分布。當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞最好鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿的50-70％。B.將2μg（體積最好在2-25μL之間）帶有目的基因的慢病毒表達(dá)載體同20μL（10μg）pPACK包裝質(zhì)?；旌衔锘旌希?00μL不含血清和抗生素的D-MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，混勻，室溫孵育15分鐘。C.用400μL不含血清和抗生素的D-MEM培養(yǎng)基稀釋30μLLipofectamine2000TM試劑，輕微混勻。D.將稀釋的Lipofectamine2000TM試劑逐滴加入到DNA/D-MEM混合液中，輕輕地上下顛倒混勻，室溫孵育15分鐘。E.在第4步孵育形成轉(zhuǎn)染混合物的同時(shí)，用10mL不含血清和抗生素的D-MEM洗293T細(xì)胞一次，然后加入9mL含2％血清不含抗生素的D-MEM培養(yǎng)基。F.將第4步中產(chǎn)生的DNA/Lipofectamine2000TM試劑混合物加入第5步中處理的培養(yǎng)皿中，輕輕地將混合物和培養(yǎng)基混勻，CO2培養(yǎng)箱中37℃G.用新鮮的含2％血清和抗生素的D-MEM培養(yǎng)基替換掉含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。注意：觀察培養(yǎng)基的顏色。培養(yǎng)24小時(shí)后和48小時(shí)后，如果由于293T細(xì)胞很高的代謝活性引起培養(yǎng)基顏色變黃（呈酸性）的話，則分別收集這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的上清。通常產(chǎn)生病毒的高峰出現(xiàn)在48小時(shí)。用含2％血清不含抗生素的D-MEM培養(yǎng)基替換掉上清液。（2）病毒的收獲：收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的293T細(xì)胞上清液。于4℃，4000rpm/min離心10分鐘，除去細(xì)胞碎片。然后將上清液用0.45μm的PVDF濾膜過(guò)濾（低蛋白結(jié)合能力的濾膜）。病毒液可以直接-804實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1靶向SSmRNA的siRNA序列設(shè)計(jì)借助互聯(lián)網(wǎng)上IrisGenetics的軟件程序siRNADNADesigner1.3設(shè)計(jì)靶向SSmRNA（序列號(hào)：NM_001009583）的siRNA序列，依據(jù)Tuschl等關(guān)于siRNA的設(shè)計(jì)原則，將設(shè)計(jì)出的序列利用BLAST和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，排除那些和其它基因明顯同源的靶序列。最終選擇以下序列作為siRNA靶序列，記作S（GC含量為33.3%）。316bp:AAGAATTTCTTCTGGAAGACT4.2SS-siRNA轉(zhuǎn)錄模板寡核苷酸的設(shè)計(jì)及合成將siRNA設(shè)計(jì)成相應(yīng)的表達(dá)發(fā)夾shRNA的DNA單鏈模板，兩端分別為BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，合成1對(duì)發(fā)夾shRNA轉(zhuǎn)錄模板的DNA單鏈，由上海倍尼菲生物科技有限公司合成，序列如下：5'-GATCCGAATTTCTTCTGGAAGACTCTTCCTGTCAGAAGTCTTCCAGAAGAAATTCTTTTTG-3'3'-GCTTAAAGAAGACCTTCTGAGAAGGACAGTCTTCAGAAGGTCTTCTTTAAGAAAAACTTAA-3'4.3SS-siRNA轉(zhuǎn)錄模板表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定退火產(chǎn)物與線性LV-shRNA-GFP載體連接，轉(zhuǎn)化，每個(gè)片段挑5個(gè)菌落，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。將電泳的結(jié)果與陰性對(duì)照（空載體）比較，目的條帶與設(shè)計(jì)相符，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。LV-siRNA1干擾質(zhì)粒PCR目的產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4，LV-siRNA2干擾質(zhì)粒PCR目的產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5。123456123456M123456圖4LV圖4LV-siRNA1PCR鑒定1-2:陰性對(duì)照;3:H2O;4:空質(zhì)粒對(duì)照;5-6:陽(yáng)性克隆;M:DL2000Marker圖5LV-siRNA2PCR鑒定1:H2O;2:空質(zhì)粒對(duì)照;3、5-6:陰性對(duì)照;4:陽(yáng)性克隆;M:DL2000Marker重組質(zhì)粒菌液鑒定擴(kuò)增出的基因片段大小與理論（156bp）相符。LV-siRNA1和LV-siRNA2測(cè)序結(jié)果與原設(shè)計(jì)的完全相同，沒(méi)有基因突變。證明已成功構(gòu)建了兩個(gè)慢病毒干擾質(zhì)粒。4.4真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SST4.4.1SST基因達(dá)到獲得M123提取豬下丘腦組織總RNA（圖6），RT-PCR擴(kuò)增得到SST前體cDNA，1%瓊脂糖凝膠電泳在250bp-500bp處可見(jiàn)條帶，與理論值相符（351bp）（圖7）。M12328s28s18s圖6豬下丘腦組織總RNA圖7RT-PCR擴(kuò)增SST圖7RT-PCR擴(kuò)增SSTM:DL2000Marker;1-3:SST目的基因4.4.2重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SST的構(gòu)建與鑒定以下丘腦組織總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SST基因片段并在兩端添加了EcoRI和HindIII。膠回收下丘腦組織RT-PCR產(chǎn)物，方法詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。SST基因片段回收產(chǎn)物連接pMD18-TVector，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-SST，其酶切和PCR鑒定結(jié)果分別如圖8。M134M2M134M2bM112a圖8T-SSTPCR和酶切鑒定圖8T-SSTPCR和酶切鑒定a:SSTPCR;b:SST酶切M1:DL2000Marker;M2:λ-EcoT14ⅠMarker;1-2:PCR產(chǎn)物;3-4:質(zhì)粒雙酶切由上圖可以看出在250bp-500bp處有目的帶出現(xiàn)，大小與理論（351bp）相符。DNAMAN軟件分析測(cè)序結(jié)果表明，T-SST中插入DNA的序列與設(shè)計(jì)序列同源性為100％，說(shuō)明獲得了序列正確的SST基因片段。重組質(zhì)粒pcDNA-SSPCR鑒定結(jié)果分別見(jiàn)圖2-7，擴(kuò)增出的基因片段大小與理論（351bp）相符，其雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2-8。通過(guò)PCR和酶切鑒定以及序列鑒定，證明已成功構(gòu)建了pcDNA-SS真核表達(dá)載體。4.4.3RIA檢測(cè)結(jié)果RIA檢測(cè)細(xì)胞裂解液中SST含量結(jié)果見(jiàn)圖9圖9轉(zhuǎn)染圖9轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞裂解液中SST的濃度1:pcDNA3.1-SS與LV-siRNA1共轉(zhuǎn)染;2:pcDNA3.1-SS與LV-siRNA1共轉(zhuǎn)染;3:pcDNA3.1-SS單獨(dú)轉(zhuǎn)染;4:空白組由圖1-9可知，陰性對(duì)照組即沒(méi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞不表達(dá)SST。與第3組相比，第1和2組的SST濃度極顯著降低即pcDNA3.1-SS與干擾質(zhì)粒的比例為1：6(P<0.01)，第1組和第2組之間差異不顯著(P>0.05)，但第1組SST濃度比第2組有所降低。綜合以上確定LV-siRNA1慢病毒干擾質(zhì)粒的干擾效果較好，用于后續(xù)的試驗(yàn)。4.5病毒的包裝慢病毒的包裝采用四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)293T的方法，共轉(zhuǎn)的質(zhì)粒分別在293T中表達(dá)各種病毒蛋白，與含識(shí)別信號(hào)的轉(zhuǎn)移載體結(jié)合裝配后形成假病毒顆粒，胞吐到培養(yǎng)基。圖10顯示共轉(zhuǎn)染293T轉(zhuǎn)染效率。baba圖圖10慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T(10×)a:熒光觀察;b:白光觀察慢病毒載體四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白裝配成含轉(zhuǎn)移載體的病毒，由圖3.1可知熒光顯微鏡下觀察到熒光的高表達(dá)，說(shuō)明四質(zhì)粒系統(tǒng)高效的轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞，保證了病毒包裝的效率。4.6慢病毒滴度的測(cè)定慢病毒不同稀釋倍數(shù)感染293T后熒光的表達(dá)情況如圖11，結(jié)合圖并由公式計(jì)算出本試驗(yàn)包裝的病毒滴度為5×104ifu/ml。超速離心后病毒滴度達(dá)到5×109ifu/mlcbacbafedfed圖圖11慢病毒滴度測(cè)定不同稀釋倍數(shù)下細(xì)胞感染的狀況(10×)a:病毒稀釋倍數(shù)10e0;b:病毒稀釋倍數(shù)10el;c:病毒稀釋倍數(shù)10e2;d:病毒稀釋倍數(shù)10e3;e:病毒稀釋倍數(shù)10e4;f:空白細(xì)胞5討論5.1靶基因siRNA的設(shè)計(jì)siRNA是一種基于核酸的靶向抑制基因表達(dá)的分子，具有特異性和靶向性的特點(diǎn)。對(duì)于大多數(shù)基因來(lái)說(shuō)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生的靶向mRNA的抑制作用足以下調(diào)目的基因的表達(dá)。siRNA能夠在低濃度的情況下實(shí)現(xiàn)基因沉默，效果比以有報(bào)道的反義寡核苷酸、核酶和脫氧核酶都好，因此，siRNA是最有效的反義分子。RNAi成功的關(guān)鍵是siRNA作用靶序列的設(shè)計(jì)選擇，即如何從SS的mRNA序列中找到siRNA的最佳靶位點(diǎn)是必須首先考慮的問(wèn)題。我們利用網(wǎng)站檢索并排除了和其他基因明顯同源的靶序列。siRNA的干涉效率直接關(guān)系到基因治療的效果，目前關(guān)于siRNA干涉效率的研究主要集中在兩個(gè)方面：一方面研究siRNA的特點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)siRNA雙鏈的熱力學(xué)結(jié)構(gòu)是高效沉默的先決條件；另一方面研究siRNA所識(shí)別的靶序列的特征，認(rèn)為siRNA的抑制效果與其所識(shí)別靶序列的結(jié)構(gòu)有關(guān)。RNAi雖然具有很強(qiáng)的基因沉默能力，但識(shí)別同一靶mRNA的不同序列的siRNA的干擾效果卻不盡相同。得到高效的siRNA是利用RNAi基因功能和表達(dá)調(diào)控研究的基礎(chǔ)。有研究指出，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，siRNA的干涉效果除了受自身的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)影響外最終要的決定因素是其識(shí)別的靶mRNA的局部結(jié)構(gòu)特征。也就是說(shuō)，盡管siRNA序列是實(shí)現(xiàn)RNA干涉的基礎(chǔ)，但其識(shí)別的靶序列局部復(fù)雜的結(jié)構(gòu)直接影響siRNA的干涉效率。因此我們將全長(zhǎng)315bp的SSmRNA序列進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)的模擬，結(jié)合局部二級(jí)結(jié)構(gòu)分析選擇位于mRNA莖環(huán)處的siRNA最佳靶位點(diǎn)。5.2慢病毒載體的安全性慢病毒作為外源基因轉(zhuǎn)移的載體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，慢病毒的制備可能會(huì)伴隨著可復(fù)制病毒(RCV)的產(chǎn)生。人們通過(guò)刪除或失活一些非必需元件如輔助基因來(lái)提高慢病毒載體的安全性。在此基礎(chǔ)上HIV-1載體系統(tǒng)發(fā)展經(jīng)歷了3個(gè)階段。本研究所使用的是四質(zhì)粒系統(tǒng)，是一種自我失活的慢病毒載體，即整合入宿主的基因后停止復(fù)制自我序列，是改進(jìn)后的第三代產(chǎn)品，其生物安全性得了很大的提高。(1)表達(dá)質(zhì)粒的3′LTR(△U3)缺失，這種處理不會(huì)影響宿主細(xì)胞內(nèi)病毒基因組的生成，但是可以在病毒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞后發(fā)生“自我滅活”。一旦整合入宿主細(xì)胞，病毒基因組就不再具備產(chǎn)生可包裝的病毒基因組的能力。(2)用VSV-G代替HIV-1的包膜蛋白。(3)編碼結(jié)構(gòu)蛋白和包裝病毒基因組所需成分的基因被分成4個(gè)部分，每一部分之間都沒(méi)有同源序列，避免產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒。(4)盡管3個(gè)包裝質(zhì)粒在293FT細(xì)胞中均可表達(dá)并形成產(chǎn)物蛋白，但它們都不含有LTRs或Ψ包裝序列。這意味著并沒(méi)有真正的HIV-1結(jié)構(gòu)基因在包裝好的病毒基因組中出現(xiàn)，也就不會(huì)在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)，不會(huì)產(chǎn)生新的具有復(fù)制能力的病毒。(5)包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒沒(méi)有復(fù)制能力，只含有目的基因。(6)由于HIV-1的RRE存在于gag/pol的mRNA副本中，致使pLP1中g(shù)ag和pol的基因表達(dá)是Rev依賴(lài)性的。在缺乏Rev的情況下加入RRE可防止gag和pol的表達(dá)。5.3慢病毒的滴度病毒的滴度是進(jìn)行后續(xù)研究特別是動(dòng)物試驗(yàn)的重要條件。病毒產(chǎn)物一般凍存于-80℃6結(jié)論1、在長(zhǎng)度為351bp的豬生長(zhǎng)抑素mRNA序列中選擇并設(shè)計(jì)了兩條siRNA，并構(gòu)建了表達(dá)發(fā)卡siRNA的慢病毒干擾質(zhì)粒（簡(jiǎn)稱(chēng)LV-siRNA1和LV-siRNA2）。2、構(gòu)建了豬生長(zhǎng)抑素基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SS。3、將慢病毒干擾質(zhì)粒與pcDNA3.1-SS分別共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，通過(guò)RIA檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中SS濃度，證明2條siRNA對(duì)SST基因表達(dá)均有不同程度的抑制作用，其抑制率分別為87.9%和86.3%，而且LV-siRNA1干擾效率較好。4、本試驗(yàn)利用慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)成功包裝出假病毒顆粒，經(jīng)測(cè)定病毒原液的滴度達(dá)到5×104ifu/ml，超速離心后病毒滴度為5×109ifu/ml?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]DannC.T.,AlvaradoA.L.,HammerR.E.,GarbersD.L.Heritableandstablegeneknockdowninrats.ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(30):11246–11251.[2]DieckhoffB.,KarlasA.,HofmannA.,KuesW.A.,etal.Inhibitionofporcineendogenousretroviruses(PERVs)inprimaryporcinecellsbyRNAinterferenceusinglentiviralvectors.ArchVirol2006,inpress.[3]DieckhoffB,PetersenB,KuesWA.,KurthR,NiemannH,DennerJ.Knockdownofporcineendogenousretrovirus(PERV)expressionbyPERV-specificshRNAintransgenicpigs.Xenotransplantation.2008;15:36-45.[4]GoldingM.C.,LongC.R.,CarmellM.A.,HannonG.J.WesthusinME.SuppressionofprionproteininlivestockbyRNAinterference.ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(14):5285-90.[5]HamraF.K.,GatlinJ.,ChapmanK.M.,GrellheslD.M.,GarciaJ.V.,HammerR.E.,GarbersD.L.Productionoftransgenicratsbylentiviraltransductionofmalegerm-linestemcells.ProcNatlAcadSciUSA.2002;99:14931-6.[6]HofmannA.,KesslerB.,EwerlingS.,etal.,EpigeneticRegulationofLentiviralTransgeneVectorsinaLargeAnimalModel.MOLECULARTHERAPY.2006.13(1)：59-66.[7]LavitranoM,CamaioniA,FazioVM,DolciS,FaraceMG,SpadaforaC.SpermcellsasvectorsforintroducingforeignDNAintoeggs:genetictransformationofmice.Cell1989;57:717–23.[8]LenzG.TheRNAinterferencerevolution.JMedBiolRes2005,38(12):1749-1757.[9]LoisC.,HongE.J.,PeaseS.,etal.GermlineTansmissionandTissue-SpecificExpressionofTransgenesDeliveredbyLentiviralVectors.Science,2002,295:868-872.[10]MichalkiewiczM.,MichalkiewiczT.,GeurtsA.M.,RomanR.J.,SlocumG.R.,SingerO.,WeihrauchD.,GreeneA.S.andCowleyJrA.W.Efficienttransgenicratproductionbyalentiviralvector.JPhysiolHeartCircPhysiol.2007,doi:10.1152/ajpheart.00060.2007.[11]NaganoM,WatsonDJ,RyuBY,WolfeJH,BrinsterRL.Lentiviralvectortransductionofmalegermlinestemcellsinmice.FEBSLett.2002,524:111-115.[12]NaldiniL.LentivirusesasGeneTransferAgentsforDeliverytoNon-dividingCells.Curr.Opin.Biotechnol.1998,9,457-463.[13]NishitsujiH.,IkedaT.,MiyoshiH.,OhashiT.,KannagiM.,MasudaT.ExpressionofsmallhairpinRNAbylentivirus-basedvectorconfersefficientandstablegene-suppressionofHIV-1onhumancellsincludingprimarynon-dividingcells.MicrobesandInfection.2004,6,76–85.[14]RamakrishnanVG，AljamaliMN，SauerJR，etal．2005．ApplicationofRNAinterf