遺傳學(xué)第九章 基因工程和基因組學(xué)課件

遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)基因工程和基因組學(xué)2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)2第九章基因工程和基因組學(xué)

§1．基因工程(Geneengineering)一、基因工程概述

1、基因工程的概念20世紀(jì)70年代隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展在遺傳學(xué)上產(chǎn)生了一門新的分支遺傳工程（Geneticsengineering）遺傳工程:又稱遺傳操作（Geneticmanipulation）,是以分子遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，以現(xiàn)代物理、化學(xué)等為手段，按照人們設(shè)計(jì)的生物藍(lán)圖在細(xì)胞、染色體和基因等不同水平上，對生物的遺傳性狀進(jìn)行定向改造，創(chuàng)造新的生物類型。廣義的遺傳工程：包括細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程。狹義的遺傳工程：即基因工程2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)3

2.基因工程的發(fā)展：

基因工程的產(chǎn)生和發(fā)展在遺傳學(xué)的發(fā)展史上是一次大革命，它打破了種、屬的界線，可以在生物大系統(tǒng)內(nèi)交流基因。其發(fā)展情況如下：1971年，史密斯（SmithH.O.）等人從細(xì)菌中分離出的一種限制性酶

酶切病毒DNA分子，標(biāo)志著DNA重組時代的開始。

1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來得到新的DNA分子。

1973年，科恩（CohenS.）等進(jìn)一步將酶切DNA分子與質(zhì)DNA連接起來，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.cloi細(xì)胞中。

1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。

1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。

1996年，克隆羊誕生。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)4美國批準(zhǔn)上市的基因工程產(chǎn)品有：人類胰島素、人類生長因子、白介酸、干擾素、牛型生長激素、疫苗等，并不斷有新的品種進(jìn)入臨床應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)上也有很多應(yīng)用，如1985年開始轉(zhuǎn)基因作物品種培育，在高梁、水稻、煙草、玉米、棉花等作物上都獲得成功。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)5全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為：1996年全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為170萬公頃，1997年為1100萬公頃，1998年2780萬公頃，1999年3990萬公頃，2000年4420萬公頃，2001年5260萬公頃，2002年5000萬公頃。

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2001年種植面積>100萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物：大豆（3330萬hm2，占全世界轉(zhuǎn)基因作物的63%，均為抗除草劑大豆）玉米（980萬hm2

，占19%）棉花（680萬hm2

，占13%）油菜（270萬hm2

，占5%）

其它還有水稻、小麥、花生、日葵、亞麻、甘藍(lán)、馬鈴薯等，番茄、煙草、南瓜和木瓜等50多種轉(zhuǎn)基因作物已培育成功。

主要分布在美國（3570萬hm2

）、阿根廷（1180萬hm2

）、加拿大（320萬hm2

）和中國（150萬hm2

）等國。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)7下圖為2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物占相應(yīng)作物種植總面積的比較

2001年我國的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木已達(dá)22種，其中轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、馬鈴薯、煙草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麥等進(jìn)行了田間試驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因棉花已經(jīng)大規(guī)模商品化生產(chǎn)。

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3．內(nèi)容：

①．從細(xì)胞和組織中分離和純化DNA；②．利用能識別特異性DNA序列的限制性內(nèi)切酶剪切DNA分子，制備含有目的基因的DNA片段，或采用酶學(xué)和化學(xué)合成的方法人工合成基因；

③．將DNA片段或人工合成的基因與能夠自我復(fù)制并具有選擇標(biāo)記的載體在體外連接，形成重組DNA分子；

④．將重組的DNA分子引入受體（宿主）細(xì)胞中，使重組DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生多個拷貝，即克隆（clone）；

⑤．重組DNA能隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞中，使子代群體細(xì)胞均具有重組的DNA分子的拷貝；

⑥．從繁殖的大量細(xì)胞群體中篩選和鑒定含有目標(biāo)基因的重組DNA分的，受體細(xì)胞的克?。虎?能從選出的宿主細(xì)胞中回收、純化、和分析克隆的重組的DNA分子；⑧.克隆的基因能夠正常表達(dá)。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)9基因工程的主要步驟可概括為：1.分離或合成目的基因；2.將帶有目標(biāo)基因的DNA片段與載體DNA體外重組；3.將重組的DNA分子引入到；4.重組體克隆的篩選和鑒定。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)10二、限制性內(nèi)切核酸酶：限制性內(nèi)切核酸酶，是一種核酸水解酶，主要從細(xì)菌中分離得到，這些酶能識別特定的核苷酸序列，在細(xì)胞中主要是用來水解外來DNA分子而保護(hù)自身的，所以稱之為限制性內(nèi)切酶。是基因工程的常用工具以交錯方式切斷DNA雙鏈，產(chǎn)生二個相同單鏈粘性末端。在適宜的條件下，兩個DNA分子的黏性末端連接成雙鏈的重組DNA分子。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)11⑴．限制性內(nèi)切酶的命名：

根據(jù)其來自的生物名稱，用英文字母和數(shù)字表示；

①.EcoRI來自大腸桿菌（Escherichiacoli）；

②.HindⅢ來自嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)12⑵．限制性內(nèi)切酶的類別：

根據(jù)限制性內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)，可分為兩類：第Ⅰ類酶、第Ⅱ類酶第Ⅰ類酶

：如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300，000)，作用時需ATP、Mg++等輔助因子。由于這類酶的切割部位無特異性，是隨機(jī)的，每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，切割點(diǎn)不固定，所以在基因工程中很少應(yīng)用。

第Ⅱ類酶（）：

如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20，000-100，000)作用時需要有Mg++存在。這類酶的切割部位有特異性，可準(zhǔn)確切割DNA雙鏈的特異序列，因此在基因工程中廣泛應(yīng)用。

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這類酶的切割點(diǎn)是對稱序列。如回文對稱序列（palindrome，又稱反向重復(fù)序列，即從兩個方向閱讀，其序列相同的序列）。識別特定的堿基序列，交錯切割產(chǎn)生二個粘性末端（stickyends），如BamHI、

PstI：

兩個DNA分子的黏性末端連接成雙鏈的重組DNA分子。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)14SmaI是另一種類型，這種酶切割DNA雙鏈后產(chǎn)生二個平齊末端（bluntends），如兩個平齊末端也可以在DNA連接酶的作用下連接成重組DNA分子。P217表9-1列出了部分常用的限制性內(nèi)切酶2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)15三、載體（vector）：

載體是將“目的”基因即重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。DNA片段+適合的載體DNA重組DNA在載體DNA的運(yùn)載下，高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增、克隆出許多拷貝。

DNA載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體等，現(xiàn)在使用的載體都是采用基因工程的方法構(gòu)建的。載體的條件：

①.具有復(fù)制原點(diǎn)，能自我復(fù)制，并能帶動攜帶的外源DNA一起復(fù)制。

②.具多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite，MCS或polylinkerregion)，即有多種限制酶的切點(diǎn)；且切點(diǎn)不存在于復(fù)制原點(diǎn)或抗性選擇標(biāo)記內(nèi)，即切點(diǎn)不影響復(fù)制和標(biāo)記性狀的表現(xiàn)。

③.至少有一個選擇標(biāo)記基因，便于鑒定進(jìn)入宿主細(xì)胞與否，如抗生素基因或某種酶的基因，而宿主細(xì)胞沒有這些基因。

④.易從宿主細(xì)胞中回收克隆。

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根據(jù)載體的作用，可把載體分為三類：克隆載體、表達(dá)載體和穿梭載體?？寺≥d體：是指主要用于在受體細(xì)胞中擴(kuò)增目的基因的一類載體，一般具有較低的分子量，其復(fù)制不是處于寄主的嚴(yán)密控制之下，較高的拷貝數(shù)和松弛型復(fù)制子，主要有細(xì)菌質(zhì)?；蚺c其他質(zhì)粒、噬菌體及其真核生物病毒的DNA重組構(gòu)建。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)17表達(dá)載體：使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)的載體。作為表達(dá)載體可將重組DNA導(dǎo)入適合的受體細(xì)胞，使其所載荷的基因能夠復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。這類載體具有強(qiáng)啟動子等調(diào)控序列；有使RNA聚合酶只轉(zhuǎn)錄克隆基因而不能轉(zhuǎn)錄無關(guān)序列的強(qiáng)終止子；其次，啟動子還應(yīng)是受控制的即只在誘導(dǎo)時才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，以保證轉(zhuǎn)錄效率和防止給細(xì)胞造成不利影響；此外所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG

和SD序列，在啟動子與目的基因或SD序列與目的基因的起始密碼子AUG之間還要有正常間隔，以不造成移碼，所轉(zhuǎn)錄的mRNA可翻譯成目的蛋白，而且這種蛋白在寄主細(xì)胞中可保持穩(wěn)定且便于提取。

迄今，已設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一系列以原核啟動子代替真核啟動子的質(zhì)粒表達(dá)載體，如大腸桿菌乳糖操縱子、色氨酸啟動子德Trp啟動子以及λ噬菌體PI啟動子等分別構(gòu)建的啟動子。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)18穿梭載體：又稱雙功能載體，具有克隆載體和表達(dá)載體兩種作用，能在兩種不同的生物體內(nèi)復(fù)制和往來穿梭。即能在在原核生物細(xì)胞中擴(kuò)增，又能在真核生物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)。主要用于在原核細(xì)胞和在真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段現(xiàn)在細(xì)菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中表達(dá)，并可提高外源基因的表達(dá)效率。這類載體必須即具有細(xì)菌的復(fù)制原點(diǎn)或質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)，又含有真核生物體的復(fù)制原點(diǎn)，如SV40復(fù)制原點(diǎn)或酵母的自主復(fù)制系列（autonomouslyreolicotingsequence,ARS),此外這類載體還應(yīng)具有可資利用的酶切位點(diǎn)和合適的篩選指標(biāo)，這樣的載體即可往來穿梭于原核細(xì)胞和在真核細(xì)胞之間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。穿梭載體不僅可把目的基因引入真核細(xì)胞，而且還可以從真核細(xì)胞染色體上回收基因或DNA片段。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)19下面是一些常用的載體：

㈠、細(xì)菌質(zhì)粒

：質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)菌染色體而自然存在的、能自我復(fù)制、易分離和導(dǎo)入的環(huán)狀雙鏈DNA分子，是。

質(zhì)粒具有重組表型檢測標(biāo)記，可檢測是否攜帶外源DNA片段?？捎糜诳寺》肿恿啃∮?0kb(1kb=1000bp)的外源DNA片段

下面左圖為pUC18質(zhì)粒，右圖為pUC19質(zhì)粒。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)20如pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：

①.分子量小，可接受較大外源片段；

②.拷貝數(shù)多，500個／細(xì)胞；

③.克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)多，克隆方便；

④.具有用于檢測重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記（如α–互補(bǔ)的顯色表型）。

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㈡、λ噬菌體（溫和型）：

基因組全長為49kb。

噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因簇，兩端為DNA左、

右臂。

中間基因簇可被外源DNA替代而不影響侵染細(xì)菌能力。

能接受15-23kb外源DNA片段，作為cDNA或核DNA克隆載體。

優(yōu)點(diǎn)：

*不易引起生物危害，有助于“目的”基因進(jìn)入細(xì)胞并增殖；

*攜帶大片段外源DNA分子，占總量25%時仍不失活。

1.λ噬菌體

2.λ噬菌體DNA

3.λ噬菌體DNA中間基因簇

4.λ噬菌體DNA兩個臂

5.外源DNA片段將連接物體外包裝感染細(xì)菌，制備基因庫6.攜帶有重組DNA分子的噬菌體2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)22㈢、柯斯質(zhì)粒(cosmid)：（克隆載體）

噬菌體DNA＋部分細(xì)菌質(zhì)粒DNA序列柯斯質(zhì)粒。

有噬菌體cos序列、細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)、抗生素抗性標(biāo)記。

這種質(zhì)粒分子量較小，但可接受長達(dá)50kb的外源DNA片段克隆真核生物基因。

∵一個長片段DNA可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)23㈣、穿梭載體（shuttlevectors）：

指能在兩種不同生物中復(fù)制的載體。

如能在原核生物(如E.coli)、真核細(xì)胞(如酵母)中復(fù)制的載體。

穿梭載體需具有細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)、真核生物自主復(fù)制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及兩者的選擇標(biāo)記。

穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增基因，在酵母中用于基因表達(dá)分析。

酵母菌的YEp(yeastepisomaplasmid)等系列載體均是穿梭載體。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)24㈤、細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC)：

BAC載體一般可攜帶大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC載體，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。

特點(diǎn)：

帶有外源DNA的BAC載體在細(xì)胞中是單拷貝的；

載體分子量很小(7.4kb)；

選擇標(biāo)記：氯霉素抗性基因；

多克隆位點(diǎn)。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)25㈥、酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)：

YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)和可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因；還具有酵母菌染色體一些特點(diǎn)；可接受100－1000kb的外源DNA片段。

YAC已成為人類基因組計(jì)劃和圖位克隆基因的重要工具；并促進(jìn)了人類人工染色體(humanartificialchromosome，HAC)的研究。

1996年完成了酵母菌全基因組序列的測定。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)26pYAC4特點(diǎn)：

1.兩個可在酵母菌中利用的選擇基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)；

2.酵母菌著絲粒序列(CEN4)；

3.一個自主復(fù)制序列(ARS1)；

4.兩個嗜熱四膜蟲末端重復(fù)序列(TEL)保持重組YAC為線狀結(jié)構(gòu)；

5.在兩個末端序列中間，有一段填充序列(His3),使pYAC4在細(xì)菌細(xì)胞中能穩(wěn)定擴(kuò)增；

6.Amp抗性及細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)；

7.一個EcoRI克隆位點(diǎn)，位于酵母菌Sup4tRNA基因內(nèi)。

下圖為酵母菌人工染色體pYAC4：

在克隆外源DNA時，用BamHI和

EcoRI雙酶切，得到二個人工染色體臂，與EcoRI酶切的外源

DNA片段連接，構(gòu)成重組的酵母人工染色體，用于轉(zhuǎn)化酵母菌

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)27㈦、Ti質(zhì)粒及其衍生載體：

適合于植物的載體系統(tǒng)將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞中目的基因表達(dá)。

Ti質(zhì)粒(細(xì)菌質(zhì)粒)：

自然存在于土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens，革蘭氏陰菌)細(xì)胞可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞(tumor-inducing,Ti)冠癭瘤(growngalltumors)。Ti質(zhì)粒有一部分轉(zhuǎn)移DNA(transferDNA，T-DNA)當(dāng)農(nóng)桿菌植物時，T-DNA植物染色體上，誘導(dǎo)冠癭瘤，并能合成冠癭(opine)，作為農(nóng)桿菌碳源和氮源。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)28Ti質(zhì)粒特點(diǎn)：

1.具有五個主要功能區(qū)域：

①.T-DNA：LB與RB間T-DNA序列整合到植物基因組；

②.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)；

③.冠癭堿(opine)代謝區(qū)；

④.復(fù)制原點(diǎn)；

⑤.毒性區(qū)。2.T-DNA中直接參與轉(zhuǎn)移并整合的序列：T-DNA兩端與其它序列交界處的25bp不完全直接重復(fù)，右端的這段序列稱為右界(RB)，左端的序列稱為左界(LB)。

3.V區(qū)的毒性基因：T-DNA轉(zhuǎn)移所必需，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)29Ti質(zhì)粒是200~500kb環(huán)狀DNA分子，主要有兩套載體系統(tǒng)：

⑴.雙元載體(binaryvectors)：該系統(tǒng)具有兩個質(zhì)粒：

①.用于克隆外源基因片段的克隆質(zhì)粒：在E.coli和農(nóng)桿菌中復(fù)制，容易操作，并可在二者間轉(zhuǎn)移，是一種穿梭質(zhì)粒；

②.非致病質(zhì)粒：具有毒性基因，沒有T-DNA序列。

將兩個質(zhì)粒分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，克隆質(zhì)粒中的外源DNA轉(zhuǎn)移到植物染色體中。

⑵.共整合載體(intergratedvectors)：

這個系統(tǒng)包括兩個質(zhì)粒，一個用作克隆外源基因，另一個具有毒性基因，但這兩個質(zhì)粒具有一段同源序列，在農(nóng)桿菌中重組整合成一個載體。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)30四、基因的分離與鑒定：一般而言，一個基因是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段包括啟動子、終止子及內(nèi)含子等。在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細(xì)胞中最難分析的大分子。DNA重組技術(shù)發(fā)展成功之后，DNA已成為細(xì)胞中最易操作分析的大分子。DNA的體外重組：1.體外通過限制性內(nèi)切酶的修剪和DNA連接酶的連接；2.目標(biāo)DNA分子+載體DNA，共價連接；3.獲得重組DNA分子。見下圖：

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2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)32㈠、從基因庫中分離基因：

1.基因庫（genelibrary）：

是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫。

根據(jù)克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)33①.核基因庫：

核基因庫(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成。

構(gòu)建文庫可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞收集菌落。

噬菌體或柯斯質(zhì)粒(cosmid)載體：將重組DNA包裝進(jìn)噬菌體感染細(xì)菌收集噬菌斑。

BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體導(dǎo)入宿主細(xì)胞收集細(xì)胞。

②.染色體基因庫：

將染色體用來構(gòu)建基因庫,可選擇特異基因和分析染色體結(jié)構(gòu)和組織。如果蠅的多線染色體：對染色體進(jìn)行微切割，可以構(gòu)建染色體區(qū)段的基因文庫。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)34人類基因組項(xiàng)目研究中，利用流動細(xì)胞分離(flowcytometry)技術(shù)將人類染色體分開

構(gòu)建單個染色體基因庫

加速人類基因組作圖和分析。酵母菌：

利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)，將酵母菌16根染色體依據(jù)其分子量大小分開后，用于構(gòu)建染色體庫，在基因組的分析中發(fā)揮作用。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)35③.cDNA庫：

以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因庫。

真核生物mRNA3’端有一段多聚A尾端雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補(bǔ)齊以帶限制性酶切點(diǎn)的人工接頭連接酶切后與載體(通常是噬菌體)連接制備cDNA庫。

cDNA庫與核DNA庫不同：

cDNA庫僅具有細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)基因的mRNA序列僅包括基因組的部分基因序列。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)362.篩選基因庫：

根據(jù)待選基因相關(guān)信息確定篩選方法和條件從基因庫中篩選、分離基因。多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針篩選基因庫。

篩庫過程：

將噬菌體感染形成的噬菌斑印影在硝酸纖維膜上變性帶有目的基因的放射性DNA或cDNA作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影雜交信號（黑點(diǎn)）對應(yīng)的噬菌斑即為陽性克隆。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)373.陽性克隆的分析與鑒定：

從基因庫中篩選出陽性克隆分析、鑒定得到目的基因。

⑴.限制性酶圖譜：

構(gòu)建陽性克隆的限制性酶圖譜根據(jù)同源性分析，了解陽性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對位置用于進(jìn)一步亞克隆或同已知的其它序列比較。右圖為一個15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建方法。不同DNA用限制性酶酶切，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長度的多型性

分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標(biāo)記進(jìn)行基因組圖譜分析。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)38⑵.核酸分子雜交：

①.Southern雜交分析：

由英國Southern(1975)發(fā)明，將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜進(jìn)行DNA分子雜交分析的方法。

篩選基因庫得到陽性克隆將限制性酶酶切Southern雜交結(jié)合繪制限制性酶圖譜。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)39②.Northern雜交分析：與Sorthern雜交的原理和程序相同。

用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，檢測mRNA的存在。③.

Western雜交分析：用于蛋白質(zhì)的分析。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)40

⑶.核酸序列測定：

測定克隆后的DNA片段核酸序列。

一般采用Sanger(1977)發(fā)明的雙脫氧核糖核酸終止法測定核酸序列。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)41在Sanger雙脫氧法中，可用熒光標(biāo)記來代替放射性標(biāo)記：

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)42⑷.核酸序列分析：

測定的核酸序列是否為基因、有什么功能，需用計(jì)算機(jī)軟件或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。

①.同源序列的分析：

*同源性比較：

將待測序列在核酸和蛋白質(zhì)兩個水平上比較基因間的同源性，將序列發(fā)送到Blast等DNAData數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。

*閱讀框架的分析：

一個ORF是一條能編碼一條多肽鏈的DNA序列，具有翻譯起始信號和終止信號等。

cDNA序列可分析內(nèi)含子等。

②.無任何同源性的新序列：

進(jìn)行基因功能性研究的方法：

將基因?qū)肷矬w進(jìn)行基因失活或過量表達(dá)，根據(jù)表型推測基因作用；

用噬菌體顯現(xiàn)(phagedisplay)技術(shù)；

酵母雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能分析。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)43

㈡、PCR擴(kuò)增基因：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)可以體外快速擴(kuò)增DNA。

美國Mullis(1986)發(fā)明(現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的里程碑)。

PCR反應(yīng)三個步聚(一個循環(huán))：

1.變性：94－95℃使模板DNA雙鏈變成單鏈；

2.復(fù)性：50－70℃下，引物分別與互補(bǔ)DNA單鏈互補(bǔ)配對；

3.延伸：在引物的引導(dǎo)和Taq酶作用下，72℃下合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。

PCR反應(yīng)通常有25－35個循環(huán)，一般可擴(kuò)增5kb左右的片段。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)44由該技術(shù)衍生出一些新的技術(shù)，如RAPD和AFLP等技術(shù)。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)45㈢、人工合成基因：根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來可很快地人工合成基因。

如SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)技術(shù)可擴(kuò)增出完整的基因序列。

1.化學(xué)合成的寡聚核苷酸(80－100個核苷酸)通過SOE將單鏈部分補(bǔ)齊；

2.PCR擴(kuò)增DNA片段；

3.DNA變性；

4.兩個單鏈部分經(jīng)SOE補(bǔ)齊雙鏈；

5.PCR擴(kuò)增DNA，利用多級SOE-PCR擴(kuò)增出完整的基因。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)46五、基因工程的應(yīng)用：目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破?；蚬こ碳夹g(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域，為人類創(chuàng)造了巨大的財富。

左下圖為轉(zhuǎn)基因的方法和技術(shù)。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)47㈠、基因工程工業(yè)：

最早應(yīng)用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細(xì)菌中表達(dá)人的胰島素(1982)。

基因工程生產(chǎn)人的胰島素的方法如左下圖所示。

現(xiàn)已在細(xì)菌中生產(chǎn)10多種藥品，例如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝炎工程疫苗等。

目前，酵母菌、植物懸浮細(xì)胞、植株和動物培養(yǎng)細(xì)胞均成功地應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白。

右下圖為基因工程應(yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長激素。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)48㈡、植物基因工程：

植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的過程。

許多植物基因已經(jīng)被分離、克隆。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法應(yīng)用最多。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)49

1.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用最早（雙子葉植物單子葉植物）。

過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞利用重組農(nóng)桿菌去感染植物細(xì)胞使質(zhì)粒部分DNA包括目的基因，整合到植物染色體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。

利用抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)50

2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)：

以高壓氣體為動力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒將目的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到染色體上。

轉(zhuǎn)化的載體多以pUC系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建通常具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)及抗性選擇標(biāo)記、可在植物中表達(dá)的啟動子終止子及調(diào)控序列、植物抗性選擇標(biāo)記(如除草劑、潮霉素等抗性)。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)51

㈢、轉(zhuǎn)基因動物:

轉(zhuǎn)基因動物：目的基因＋載體重組DNA微量注射法將重組DNA導(dǎo)入受體合子細(xì)胞核遺傳轉(zhuǎn)化。

如：

利用轉(zhuǎn)基因羊大量表達(dá)人類的抗胰蛋白酶。

可分泌人類生長因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因羊“Polly”。

下圖為《Wilmut等，Nature385,1997》。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)52左下圖為受精卵細(xì)胞注射法，右下圖為轉(zhuǎn)基因牛（受精卵注射法）2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)53下圖中左邊小白鼠為轉(zhuǎn)移有人類生長

激素轉(zhuǎn)基因鼠，右邊為同胞鼠對照。下圖中左邊小白鼠為轉(zhuǎn)移有人類生長

激素轉(zhuǎn)基因鼠，右邊為同胞鼠對照。下圖中的豬為人類生長激素轉(zhuǎn)基因豬2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)54㈣、遺傳疾病診斷：

利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進(jìn)行診斷準(zhǔn)確度高，速度快。

如進(jìn)行產(chǎn)前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)55

1.RFLP法（右上圖）：

①.原理：限制性內(nèi)切酶能識別并切割特異核苷酸序列。

某位點(diǎn)核苷酸序列發(fā)生突變有可能導(dǎo)致缺失或產(chǎn)生新的限制性酶切位點(diǎn)。

若突變只發(fā)生在同源染色體的一條上，另一條正常，限制性內(nèi)切酶酶切DNA片段帶型可用于鑒別同源染色體的差異。

酶切后產(chǎn)生的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP)。

RFLP差異具有共顯性特點(diǎn)。

②.鐮刀性貧血病的診斷：

該病由－球蛋白基因一個核苷酸突變（由GAG變成GTG)導(dǎo)致的，這個核苷酸改變也正好導(dǎo)致一個限制性酶切位點(diǎn)改變。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)56雜合體經(jīng)酶切產(chǎn)生帶型差異，識別該位點(diǎn)。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)572.等位基因特異寡核苷酸法(allele-specific

oligonucleotide，ASO)

當(dāng)已知突變基因的核苷酸序列時，可用人工合成的寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物用作點(diǎn)雜交分析，鑒定基因型。

這種用于檢測單個核苷酸變異的方法，稱為ASO法。

許多遺傳疾病可用該法診斷。

參看右圖：從血液細(xì)胞中提取DNA分別用正常及突變的ASO進(jìn)行PCR，雜交后的兩種結(jié)果。

A：用正?；颍é翧）的ASO進(jìn)行PCR時，三種基因的信號強(qiáng)度。

B：用突變基因（βS）的ASO進(jìn)行PCR時，三種基因的信號強(qiáng)度。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)58㈤、基因治療：

特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者基因組中治療遺傳疾病，通常叫做基因治療(genetherapy)。

方法：減毒的病毒DNA作載體(retrovirusDNA)構(gòu)建重組DNA分子用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細(xì)胞將正?；蛘系饺旧w上。

例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的減毒病毒載體，已用于治療嚴(yán)重綜合免疫缺陷(SCID)。

SCID是由于腺苷脫氨酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起，患者無任何免疫功能。

2000年法國Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的兩個嬰兒(8個月和

11個月)被認(rèn)為是20世紀(jì)人類基因治療上的重大突破。

方法：將ADA基因?qū)氲組LVretro

virus載體取代該病毒DNA中的三個基因結(jié)構(gòu)(gag、pol、env)將重組后的病毒去感染T細(xì)胞，使ADA基因整合到T細(xì)胞的染色體中

實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)59㈥、DNA芯片(DNAchips)：

核酸分子雜交的原理和方法

半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合

形成的一門新技術(shù)。這一技術(shù)可使許多分子雜交反應(yīng)同時進(jìn)行。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)60DNA芯片技術(shù)：

在小面積(如2cm２)基片表面分成不同小格有序點(diǎn)陣排列在一定位置、可尋址的核苷酸分子將待分析核苷酸分子標(biāo)記(如用熒光)，變性成單鏈與芯片上序列相同的核苷酸分子雜交與芯片上序列不同的核酸分子被洗掉利用高精度的激光掃描儀記錄分子已雜交的熒光信號計(jì)算機(jī)軟件分析。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)61擬南芥48種cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，微點(diǎn)樣制成96孔cDNA芯片野生型和HAT4突變型mRNA探針分別用熒光素和麗絲胺標(biāo)記，將兩探針以1:1比例混合并雜交于同一芯片分別用該兩種熒光素激發(fā)波長進(jìn)行掃描得到C、D圖。

桔紅色越深，基因表達(dá)豐度越高。E、F圖也相同。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)62DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龍等。

DNA芯片從幾千個微點(diǎn)（用同位素標(biāo)記）發(fā)展出160萬點(diǎn)陣的芯片（熒光素標(biāo)記）。

應(yīng)用領(lǐng)域：

基因多態(tài)性檢測（如單核苷酸多態(tài)性篩選，singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)；

基因表達(dá)分析（不同細(xì)胞和不同組織的RNA群體比較）；

克隆選擇及文庫篩選（如cDNA文庫）；

基因突變檢測及遺傳病和腫瘤的診斷等。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)63§2．基因組學(xué)(Genomics)

基因組學(xué)(genomics)：

遺傳學(xué)研究進(jìn)入分子水平后發(fā)展起來的一個分支，主要研究生物體內(nèi)基因組的分子特征。

研究對象：以整個基因組為研究單位，而不以單個基因?yàn)閱挝蛔鳛檠芯繉ο蟆?/p>

研究目標(biāo)：認(rèn)識基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化；

闡明整個基因組所包含的遺傳信息和相互關(guān)系；充分利用有效資源，預(yù)防和治療人類疾病。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)64重要組成部分：基因組計(jì)劃(genomeproject)大體上可分為：

⒈構(gòu)建基因組的遺傳圖譜；

⒉構(gòu)建基因組的物理圖譜；

⒊測定基因組DNA的全部序列；

⒋繪制基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；

⒌分析基因組的功能。

基因組計(jì)劃研究開始于1990年。

美國啟動被譽(yù)為“人體阿波羅計(jì)劃”的“人類基因組計(jì)劃”，投資30億美元，計(jì)劃歷時15年測定人類基因組的30億個核苷酸對的排列次序構(gòu)建高分辨率的人類基因組遺傳圖譜和物理圖譜發(fā)展生物信息學(xué)。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)65

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)66。

在美國提出人類基因組計(jì)劃后，日本和中國分別于1991年和1992年啟動了“水稻基因組計(jì)劃”。

2001年12月14日，美、英等國科學(xué)家宣布繪制出擬南芥基因組的完整圖譜

2002年4月5日《Science》以14頁的篇幅刊登和宣布中國科學(xué)家獨(dú)立繪制完成水稻基因組草圖序列（總數(shù)：4.6億），是繼人類基因組工作草圖之后完成測定的最大基因組。

材料：秈稻“9311”。

完成單位：華大基因研究中心、中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等12個單位，2001年7月啟動。

水平：水稻基因組的總基因數(shù)約為46022－55615個（接近人類基因數(shù)的兩倍），工作框架圖序列已覆蓋水稻整個基因組92％以上的基因。

方法：“鳥槍射擊法”，利用國產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級計(jì)算機(jī)(1000億次/秒)對隨機(jī)DNA碎片進(jìn)行排序和組裝，確定其在基因組的正確位置。

計(jì)劃：功能基因分析和蛋白質(zhì)研究。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)672002年12月21日《Nature》宣布中國獨(dú)立繪制完成粳稻基因組第四號染色體精確測序圖，我國對國際水稻基因組測序計(jì)劃貢獻(xiàn)率為10%。

材料：粳稻“日本晴”。

完成單位：中科院國家基因研究中心等4家單位。

水平：第四號染色體中的總堿基數(shù)目為0.35億堿基對，覆蓋了該染色體全長序列98％的區(qū)域，只剩下7個小空洞，堿基序列的精確度達(dá)到99.99%。完整測定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。

計(jì)劃：對預(yù)測鑒定的4658個基因作進(jìn)一步分析，并對著絲粒功能等作研究。

國際水稻基因組測序計(jì)劃：

國際水稻（粳稻）基因組計(jì)劃始于1998年，日本、美國、中國、法國等國家和地區(qū)參加。

染色體4:36Mb(占9－10%)。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)68一、基因組圖譜的構(gòu)建：基因組中核苷酸順序的測定方法：

利用現(xiàn)有DNA測序方法，每個測序反應(yīng)通常只能得到800個核苷酸的序列。

∴小基因組物種常用鳥槍射擊法。

大基因組測序存在兩個問題：

*片段數(shù)(n)龐大，片段間連接和裝配非常復(fù)雜，重疊數(shù)為2n2–2n；

*基因組中相同或相似的重復(fù)序列在連接和裝配時容易出錯。

解決方法：大規(guī)模序列測定前，構(gòu)建基因組圖譜可作為序列測定中制定測序方案的依據(jù)，以便錨定測知的核酸序列在染色體上的位置。

測序方法：

*克隆連續(xù)序列法(clonecontig)：

將基因組DNA切割成長度為0.1－1Mb的大片段克隆到Y(jié)AC或BAC載體上分別測定單個克隆的序列再裝配連接成連續(xù)的DNA分子。

*定向鳥槍射擊法(directedshotgun)：

以基因組圖譜中標(biāo)記為依據(jù)測序裝配和構(gòu)建不同DNA片段的序列。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)69基因組圖譜根據(jù)構(gòu)建的途徑，可分為兩種：

*遺傳圖譜：

根據(jù)遺傳性狀(如已知基因位點(diǎn)、功能未知的DNA標(biāo)記、可鑒別的表型性狀)的分離比例將其定位在基因組中，構(gòu)建相應(yīng)的連鎖圖譜。

*物理圖譜：

將各種標(biāo)記直接定位在基因庫中的某一點(diǎn)上。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)70㈠、遺傳圖譜的構(gòu)建：

1.圖譜標(biāo)記：可用基因或DNA作為可鑒別的標(biāo)記(marker)。

⑴.基因標(biāo)記：基因控制性狀的表現(xiàn)，利用可鑒別的形態(tài)、生化等表型性狀作標(biāo)記根據(jù)連鎖交換原理來分析基因之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離繪制連鎖圖譜。

缺點(diǎn)：基因數(shù)目有限、所構(gòu)建遺傳圖譜不詳細(xì)、標(biāo)記間的遺傳距離較大。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)71⑵.DNA標(biāo)記：

每種生物DNA具有穩(wěn)定性。

∴DNA本身可作為構(gòu)建遺傳圖譜的標(biāo)記，主要有以下3種類型：

①.限制性內(nèi)切酶多態(tài)性:

限制性內(nèi)切酶能識別和切割特異核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，實(shí)際上相當(dāng)于一對等位基因的差異。

如一對同源染色體二個DNA分子，一個具有某種酶的酶切位點(diǎn)，另一個無此位點(diǎn)酶切后形成的DNA片段長度就會有差異，即多態(tài)性(RFLP)根據(jù)該等位基因的遺傳，將RFLP作為標(biāo)記定位在基因組的某一位置上。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)72②.簡單序列長度多態(tài)性

(simplesequencelengthpolymor-phisms，SSLP)：

SSLP是一些長度不等的重復(fù)序列、有多個等位基因位點(diǎn)。

*多次重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeats，VNTR)：

也稱微隨體(minisatellite)，重復(fù)序列長度為幾十個核苷酸。

*簡單重復(fù)序列(simpletandemrepeats，STRs)：

又稱為小隨體(microsatellite)，常只有2－4個核苷酸重復(fù)單位。

利用STR作為標(biāo)記更為普遍：

∵STR分布在整個基因組中，而VNTR主要集中在染色體末端；

STR的PCR檢測速度更快、準(zhǔn)確性更高，因?yàn)镾TR長度通常在300bp以下，而VNTR相反。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)73③.單核苷酸多態(tài)性

(simplenucleotidepolymorphisms，SNPs)：

基因中點(diǎn)突變數(shù)量多，其中有些可產(chǎn)生RFLP（發(fā)生在酶切位點(diǎn)）。

人類基因組中的編碼序列中約有20萬個SNPs標(biāo)記，非編碼序列中約有多10倍以上的標(biāo)記。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)74SNP位點(diǎn)可用寡核苷分子雜交來檢測：

*DNA芯片技術(shù)：將不同的寡核苷酸固定在芯片上標(biāo)記待測DNA一次就可檢測很多SNPs標(biāo)記；

*特異等位基因動力學(xué)雜交法：利用液體雜交法檢測，在酶標(biāo)偶聯(lián)反應(yīng)板的96孔中進(jìn)行分子雜交用一種只與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料檢測當(dāng)兩條DNA分子完全互補(bǔ)配對時，形成雙鏈DNA時才有信號檢測SNPs。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)752.遺傳圖譜的構(gòu)建：

⑴.人類基因組遺傳圖譜的構(gòu)建：

家系分析法：分析8個家系134個成員（186個減數(shù)分裂）根5264個STR(簡單重復(fù)序列)標(biāo)記繪制而成（X染色體分析是利用12家系170個成員［105個減數(shù)分裂］）將5264個標(biāo)記定位在2335個位點(diǎn)?構(gòu)建的人類基因組遺傳圖譜密度為每個標(biāo)記599kb。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)76⑵.植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建：

①.選擇親本：

親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異性大，親本間分子標(biāo)記多態(tài)性強(qiáng)。

②.產(chǎn)生構(gòu)圖群體：

配制組合?建立分離群體：

*單交組合產(chǎn)生的F2；

*衍生的F3、F4家系；

*由連續(xù)多代自交或姐妹交產(chǎn)生的重組近交系(recombinantinbred

lines，RIL)；

*通過單倍體加倍而成的雙單倍體(doubledhaploids，DH)；

*利用回交或三交(復(fù)交)產(chǎn)生的后代群體。

③.遺傳標(biāo)記的染色體定位：

有單體、三體、代換系與附加系分析等方法，依據(jù)染色體劑量的差異?將遺傳標(biāo)記定位在特定染色體上。

∵當(dāng)供體材料總DNA等量時，DNA雜交帶的信號強(qiáng)弱與該標(biāo)記位于的染色體劑量成正比。

④.標(biāo)記間的連鎖分析：

通過分析分離群體內(nèi)雙親間有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記的連鎖交換情況和趨于協(xié)同分離的程度即可確定標(biāo)記間的連鎖關(guān)系和遺傳距離。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)77(二)、物理圖譜的構(gòu)建：1.構(gòu)建物理圖譜的原因：

⑴.遺傳圖譜的分辯率有限：

低等生物可重復(fù)進(jìn)行多次雜交、測交在短期內(nèi)可產(chǎn)生大量群體、得到大量重組交換的子代群體構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。

人類或其它高等生物難以獲得大量的子代群體，減數(shù)分裂的后代有限限制連鎖分析。

⑵.遺傳圖譜的精確性不高：

染色體上有一些重組熱點(diǎn)，其發(fā)生重組的頻率高于其它位點(diǎn)?影響重組熱點(diǎn)鄰近區(qū)段的遺傳圖譜準(zhǔn)確性。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)782.構(gòu)建物理圖譜的三條途徑：

⑴.限制性酶圖譜：

利用限制性內(nèi)切酶繪制圖譜，對于DNA分子長度小于50kb的片段，一般沒有困難。而對于>50kb的DNA分子，可選用稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶酶切DNA。用識別位點(diǎn)較多核苷酸的內(nèi)切酶：

如Not

I，為8個核苷酸出現(xiàn)的頻率為1/48=1/65536bp；

而識別位點(diǎn)為6個核苷酸的出現(xiàn)頻率為1/46=1/4094bp。選用其酶切位點(diǎn)在基因組中出現(xiàn)頻率低的內(nèi)切酶：

人類基因組中，5’-CG-3’出現(xiàn)的頻率很低：

SmaI(5’-CCCGGG-3’)酶切DNA，每78kb有一個切點(diǎn)；

BssHII(5’-GCGCGC-3’)酶切DNA，每390kb有一個切點(diǎn)；NotI(5’-GCGGCCGC-3’)酶切DNA，每10Mb只有一個酶切點(diǎn)

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)79⑵.熒光原位雜交(fluorescentinsituhybridization，F(xiàn)ISH)：

物理圖譜構(gòu)建方法：熒光標(biāo)記的探針與DNA分子雜交染色體上雜交信號（即探針DNA在染色體上的圖譜位點(diǎn)）在顯微鏡下可直接觀察。

步驟：取有絲分裂中期的細(xì)胞制片將染色體變性成單鏈將標(biāo)記DNA探針變性后雜交到染色體上觀察分析。

右圖為pSc119.2探針均可與小麥B組染色體雜交，產(chǎn)生黃色的雜交信號。

)2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)80

⑶.序列標(biāo)簽位點(diǎn)：

已知序列為標(biāo)簽的位點(diǎn)（sequencetaggedsites，STS）作探針，與基因組DNA雜交?繪制物理圖譜。

STS的要求：

*為已知序列，便于PCR檢測；

*基因組中僅此一個位點(diǎn)，無重復(fù)。

常用的兩大類型STS：

①.特異DNA序列：

*表達(dá)的序列標(biāo)簽(expressedsequencetag，EST)，表達(dá)的序列來自cDNA。

*簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)也可用于物理圖譜的構(gòu)建，比較遺傳圖譜和物理圖譜。

*DNA隨機(jī)片段，測序后經(jīng)分析比較，非重復(fù)序列可作為STS。

②.DNA片段：

分為兩種不同類型：

*輻射雜交系(radiationhybrid)：指嚙齒動物細(xì)胞含有另一個生物染色體片段的細(xì)胞株。2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)81細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明：

用3000－8000radX射線處理后人類染色體會出現(xiàn)隨機(jī)斷裂將處理細(xì)胞與正常倉鼠或其它嚙齒動物細(xì)胞融合斷裂的人類染色體可與倉鼠染色體融合復(fù)制利用100個人類基因組輻射后與缺失倉鼠細(xì)胞融合形成的輻射雜交系（能在HAT培養(yǎng)基上生長的就是含有人類染色體片斷的細(xì)胞進(jìn)行人類基因組物理圖譜的構(gòu)建。

*克隆的DNA片段序列：

利用YAC或BAC克隆的DNA，測序后可作為分子標(biāo)記。

不同克隆測定后，進(jìn)一步分析克隆之間的重疊部分，將各克隆連接進(jìn)來，可作為STS使用。

2024/9/26遺傳學(xué)第九章基因工程和基因組學(xué)82

3.人類基因組物理圖譜:

人類基因組序列開始測定時，已有45萬個EST，其中有一些重復(fù)序列經(jīng)計(jì)算機(jī)分析篩選后得到49625個，各代表一個基因再從中篩選出3萬個EST、二個輻射雜交系庫（分別有83和93個細(xì)胞株）、一