免疫膠體金技術(shù)-2

一.概述第1頁/共33頁(一)發(fā)展歷史u

1971年Faulk和Taylon用兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合,制備成金標(biāo)抗體,檢測細(xì)菌表面抗原的分布u

1975年

Horisberger等 把膠體金技術(shù)推廣應(yīng)用于掃描電鏡、透射電鏡及冰凍蝕刻電鏡的研究發(fā)表了膠體金標(biāo)記物在光鏡水u

1978年Geoghegan平的應(yīng)用u

1981年Danscher建立了銀顯影液增強(qiáng)，光鏡下金顆?？梢娦缘姆椒╱1983年Moeremans等在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳中應(yīng)用了免疫金銀染色法u

1986年Fritz等在免疫金銀法基礎(chǔ)上成功進(jìn)行了彩色免疫金銀染色第2頁/共33頁免疫膠體金技術(shù)第3頁/共33頁以膠體金為標(biāo)記物應(yīng)用在免疫組織化學(xué)研究中,對細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的多糖、糖蛋白、蛋白質(zhì)、多肽、激素和核酸等生物大分子進(jìn)行定位研究（二）膠體金的基本概念膠體金,一般指金的水溶液,又稱金溶膠。---金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶膠。其中分散的金顆粒直徑在1~100nm之間。第4頁/共33頁二.膠體金的制備第5頁/共33頁(一)可用多種方法制備膠體金分散法:包括機(jī)械分散法、超聲波法、電分散法和膠溶法等凝聚法:包括物理凝聚法、化學(xué)凝聚法（氧化法、水解法和還原法）1. 其中應(yīng)用最多的是化學(xué)還原法化學(xué)還原法第6頁/共33頁【基本原理】在氯化金水溶液中加入一定量的還原劑,使金離子還原為金原子。在適當(dāng)條件下,還原的金原子凝聚成一定大小的金顆粒,形成金溶膠?！境Ｓ眠€原劑】檸檬酸鈉、鞣酸、白磷等檸檬酸鈉還原制備的金顆粒直徑較大,15~150nm白磷還原制備的金顆粒直徑較小,3~12nm【具體制備方法】（二）影響溶膠穩(wěn)定性的因素u

電解質(zhì)u

膠體金濃度u

溫度u

大分子物質(zhì)第7頁/共33頁（三）膠體金的鑒定第8頁/共33頁【鑒定方法】在電鏡下觀察金顆粒的大小及金顆粒的均勻程度【鑒定方法】將膠體金滴在覆有Formvar膜或碳-Formvar膜的鎳網(wǎng)上,空氣干燥,透射電鏡下觀察,拍照,測量金顆粒的直徑,并計(jì)算100個(gè)以上膠體金顆粒直徑的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（四）制備膠體金的注意事項(xiàng)第9頁/共33頁1.玻璃器皿的清潔玻璃器皿清洗→清潔液浸泡24h→流水沖→蒸餾水反復(fù)洗滌→晾干試劑配制應(yīng)盡量使用分析純試劑影各響種膠水體溶金液顆必粒須用大三小蒸的水因或素去離子水配制加入還原劑的速度攪拌是否均勻制備膠體金所用的燒瓶大小三.膠體金探針的制備第10頁/共33頁(一)膠體金與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的過程,實(shí)際上是蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)或稍偏堿時(shí),被吸附于膠體金顆粒表面.（二）膠體金的預(yù)處理第11頁/共33頁標(biāo)記之前將膠體金的PH值調(diào)至待標(biāo)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或略偏堿調(diào)節(jié)PH的方法:當(dāng)需要提高膠體金的PH值時(shí)，用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LKOH當(dāng)需要降低膠體金的PH值時(shí),用0.1MHCL或醋酸(三)待標(biāo)記蛋白質(zhì)的處理透析除鹽:將蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中,放在蒸餾水中透析,4℃過夜離心:10000

r/min,4℃,1h,去除蛋白質(zhì)聚合物等沉淀第12頁/共33頁(四)膠體金蛋白質(zhì)最佳結(jié)合率測定不同直徑的金顆粒,及不同分子量大小的蛋白質(zhì),其結(jié)合的比例是不同的常用的檢測二者結(jié)合量的方法有目測法和光電比色法第13頁/共33頁1.目測法先將待標(biāo)記蛋白質(zhì)逐級稀釋取一批小試管,編號,每管內(nèi)加已調(diào)好PH的膠體金100ul按從低→高的濃度,將已稀釋好的蛋白溶液,分別加入已編號的試管中,對照管只加不含蛋白的稀釋液,混勻,靜置5~10min各管分別加10%NaCl10μl,混勻,靜置2hr,觀察結(jié)果第14頁/共33頁1234576膠體金(ml)

1蛋白質(zhì)(ug)

510%NaCl

0.11100.11

1

1

1

115

20

25

30

350.1

0.1

0.1

0.1

0.1結(jié)果判斷:對照管或加入蛋白量不足,膠體金出現(xiàn)由紅變藍(lán)的凝聚現(xiàn)象；加入蛋白質(zhì)量達(dá)到或超過穩(wěn)定量,則膠體金保持紅色不變第15頁/共33頁2.光電比色法第16頁/共33頁利用分光光度計(jì)測各管580nm的OD值,然后以O(shè)D

值為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作一曲線,取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)的蛋白質(zhì)濃度,即為最適穩(wěn)定量.(五）標(biāo)記第17頁/共33頁1.計(jì)算所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金溶液總體積及所測定的最適蛋白質(zhì)穩(wěn)定量，計(jì)算出所需待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量2.調(diào)節(jié)PH:根據(jù)所標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來調(diào)節(jié)膠體金的PH常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金的

PH蛋白質(zhì)

PH抗體

SPA過氧化物酶

低密度脂蛋白9.06.08.05.5第18頁/共33頁磁力攪拌下,逐滴加入蛋白質(zhì)溶液,作用5～15min繼續(xù)磁力攪拌,加入5％牛血清白蛋白,使其終濃度為1％,攪拌10min；也可加3％聚乙二醇,使其終濃度為0.05％第19頁/共33頁（六）標(biāo)記探針的純化第20頁/共33頁u

純化的目的去除溶液中未標(biāo)記的蛋白質(zhì),未充分穩(wěn)定的膠體金,以及在標(biāo)記過程中可能產(chǎn)生的各種聚合物u

純化的方法超速離心法和凝膠過濾法1.超速離心法速度快,適合大樣品的制備離心1500rmin,20min 棄沉淀超速離心4℃1h 棄上清沉淀用PBS或TBS緩沖液（含0.1％牛血清白蛋白重新懸浮至原體積的110～120離心1500rmin,20min 棄沉淀分裝4℃保存第21頁/共33頁2.凝膠過濾法u將探針溶液裝入透析袋內(nèi),4℃,置于硅膠或聚乙二醇中濃縮至原體積的14～15u離心1500rmin,20min 棄沉淀u經(jīng)Sephacryl（丙烯葡聚糖）S400層析柱分離純化。用0.02mol/LTBS(0.1%BSA)洗脫TBS的PH根據(jù)蛋白質(zhì)種類而定u按紅色深淺分管收集洗脫液第22頁/共33頁(七)標(biāo)記探針的鑒定第23頁/共33頁負(fù)染色檢查:將膠體金溶液滴在覆有Formavar膜(支持膜)的鎳網(wǎng)上,空氣中干燥,醋酸鈾負(fù)染,透射電鏡下觀察生物活性鑒定:可用直接或間接法放射免疫測定,凝聚試驗(yàn)及免疫組化染色進(jìn)行鑒定四.免疫膠體金染色方法第24頁/共33頁(一)免疫金染色法第25頁/共33頁Immunogold

staining,

IGS【基本原理】直接法---將膠體金標(biāo)記的一抗直接對標(biāo)本進(jìn)行染色,然后在光鏡或電鏡下觀察方法簡單,但一種探針僅限于檢測一種抗原,較局限間接法---先將未標(biāo)記的特異性一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合,然后加金標(biāo)二抗或SPA與一抗結(jié)合,在光鏡或電鏡下對抗原的分布進(jìn)行定位研究第26頁/共33頁【特點(diǎn)】陽性部位顯紅色染色程序簡便,不需顯色或顯影過程但一般要求金顆粒的直徑>20nm,并要求用高濃度的免疫金溶液第27頁/共33頁(二)免疫金銀染色法第28頁/共33頁Immunogold

silver

staining,

IGSS1983年Holgate及其同事在IGS的基礎(chǔ)上與銀顯影方法相結(jié)合,建立了免疫金銀法【基本原理】經(jīng)免疫反應(yīng)沉積在抗原位點(diǎn)處的膠體金顆粒作為一種催化劑,在對苯二酚存在的情況下,將顯影液中的銀離子催化還原成銀原子,可將抗原位點(diǎn)清楚顯示出來1.光鏡免疫金銀法3在免疫金染色的基礎(chǔ)上增加物理顯影的步驟3顯影液的配制及顯影過程應(yīng)在暗處進(jìn)行3陽性部位呈黑色顆粒狀2.電鏡免疫金銀法包埋前染色,包埋后染色第29頁/共33頁【IGSS法優(yōu)點(diǎn)】第30頁/共33頁1.可被用于光鏡和電鏡觀察敏感性高定位準(zhǔn)確背景清晰,對比度好方法簡便,安全成本較低,標(biāo)本可長期保存(三)彩色免疫金銀染色法第31頁/共33頁Coloured

IGSS,

CIGSS【基本原理】組織切片經(jīng)IGSS染色后,抗原抗體反應(yīng)部位生成的銀顆粒通過鐵氰化