法醫(yī)物證學(xué)課件

法醫(yī)物證學(xué)

第二章法醫(yī)物證分析的遺傳學(xué)基礎(chǔ)

1、遺傳(Heredity)：生物繁衍過程中,子代與親代相同或相似的現(xiàn)

象，包括形態(tài)外貌上相同或相似，以及生物體的構(gòu)造、生理生化特征等方

面都相同或相似。其意義是保持生物世代延續(xù)，保持物種的相對穩(wěn)定。而

生物體表現(xiàn)出來的形態(tài)特征和生理生化特性稱為性狀。如果性狀的產(chǎn)生是

由遺傳因素決定的，稱為遺傳性狀。

2、遺傳標(biāo)記(geneticmarkerGM)：個(gè)體的單位遺傳性狀作為標(biāo)志用于

法醫(yī)物證分析時(shí)，這種遺傳性狀就稱為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記顯然具有以

下特點(diǎn)：特定性一遺傳多態(tài)性；穩(wěn)定性一終身不變、對環(huán)境的耐受性；反

映性一可檢測性。3、基因(gene)：染色體上特定位置上的一段DNA

序列，具有特定的結(jié)構(gòu)，可以編碼產(chǎn)物，決定生物體性狀。

4、基因座(locus)：基因在染色體上的一個(gè)特定位置。

5、等位基因：同一個(gè)基因座上的基因可以有不同類型，它們之間存在

一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異，這種有差異的基因稱為等位基因

復(fù)等位基因：對群體而言，一個(gè)基因座上具有3個(gè)或3個(gè)以上的等

位基因，稱為復(fù)等位基因，如ABO血型。6、基因型(genotype)：個(gè)體

一個(gè)或多個(gè)基因座的等位基因的組合，是生物體可見性狀的實(shí)際基因組成,

在人類等二倍體生物中染色體是成對存在。在基因座上，每個(gè)基因座上的

等位基因成對存在。純合子：成對的等位基因相同的合；雜合子：成對

的等位基因不同的合子。表型，是指生物體某特定基因所表現(xiàn)

出的性狀。

7、法醫(yī)物證遺傳標(biāo)記分類

血型（廣義）：表達(dá)產(chǎn)物水平遺傳標(biāo)記

（狹義）血型

血液蛋白質(zhì)

遺傳多態(tài)性酶型

血清型

DNA遺傳多態(tài)性核DNA多態(tài)性

紅細(xì)胞型

白細(xì)胞型

血小板型

線粒體DNA

紅細(xì)胞酶型

血清酶型

血清蛋白型

同種異型

免疫球蛋白

常染色體DNA

性染色體DNA

多態(tài)性

（HLA）

8、孟德爾分離律：指在生殖細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成配子時(shí)，成對的

等位基因彼此分離，并獨(dú)立地分配到不同配子中，每個(gè)配子中只含有親代

一對基因中的一個(gè)，完成不同遺傳性狀的獨(dú)立傳遞。

9、孟德爾自由組合律：在配子形成時(shí)，不同基因座上的非等位基因

彼此分離后，隨機(jī)地自由組合，形成子代基因型。

其歸納了不同（2個(gè)或2個(gè)以上）基因座上等位基因傳遞的規(guī)律；先

決條件是各基因座間沒有遺傳連鎖關(guān)系；要求是選擇符合自由組合律的遺

傳標(biāo)記：位于不同染色體上，在同一染色體上相距較遠(yuǎn)的位置，通過群體

調(diào)查證實(shí)沒有遺傳連鎖關(guān)系（基因座獨(dú)立性檢驗(yàn)）

10、不同基因座上等位基因組合出現(xiàn)的頻率：兩個(gè)獨(dú)立事件同時(shí)發(fā)生

的概率。可以用乘積定律來計(jì)算。

1.母系遺傳（線粒體DNA）遺傳物質(zhì)位于細(xì)11、非孟德爾遺傳規(guī)律：O

胞質(zhì)中，不受核移植的影響；無有絲分裂減數(shù)分裂的周期變化；子代

2.男性伴性遺傳（Y染色體DNA）Y染色體非重組只表達(dá)母方的特征。O

部分的DNA序列；連鎖遺傳（單倍體形式遺傳）只遺傳給男性子代。

12、連鎖（linkage）：每個(gè)染色體上必然集合著許多基因，基因的這種

集合叫連鎖。

完全連鎖（completelinkage）：同一條染色體上的兩個(gè)非等位基因，在

遺傳過程中完全不分離的遺傳現(xiàn)象。

不完全連鎖（incompletelinkage）：同一條染色體上的兩個(gè)非等位基因，

由于減數(shù)分裂中同源非姐妹染色單體間發(fā)生交換而發(fā)生分離，產(chǎn)生重組配

子，不能連在一起遺傳的現(xiàn)象。這是一種普遍存在的連鎖方式。

13、群體：包含同一物種所有的個(gè)體。

Hardy-Weinberg群體：在一定地域內(nèi)一群隨機(jī)婚配，能實(shí)現(xiàn)基因世代

傳遞并保持穩(wěn)定的許多個(gè)體的集群。

其建立在一個(gè)理想群體模型上，四個(gè)假設(shè)前提：①群體無限大；②隨

機(jī)婚配；③沒有突變；④沒有大規(guī)模的遷移和沒有選擇因素的影響。結(jié)論

是群體中的基因頻率和基因型頻率在逐代傳遞中保持不變?；驇?gene

Pool)一個(gè)群體內(nèi)所包含的全部基因的總和。

14、遺傳多態(tài)性(geneticpolymorphism)對一個(gè)群體而言，控制遺傳標(biāo)

記的基因座上存在有2個(gè)或2個(gè)以上等位基因，并且等位基因的頻率大于

O.Olo

15>基因頻率(allelicfrequency)：群體中某等位基因數(shù)目占該基

因座上所有等位基因總數(shù)目的百分比。所有等位基因頻率和為1。基

因型頻率(genotypefrequency)：指一個(gè)群體中，某基因座上的基因型在

全部基因型中所占的百分比。全部基因型頻率和為1。

表型頻率：就某一性狀而言，某一表型在群體中所占的百分比。直接

法：基因頻率=2X純合子數(shù)+含有該等位基因的雜合數(shù)/

2義總個(gè)體觀察數(shù)

當(dāng)有隱性基因存在時(shí)，計(jì)算方法為方根法和最大似然量估計(jì)法。

16>Hardy-Weinberg平衡定律的意義：(簡答)

1.反映基因頻率和基因型頻率的關(guān)系。基因頻率和基因型頻率O

之間的關(guān)系可以用二項(xiàng)式展開的公式表示：純合子基因型頻率等于該

基因頻率的平方。雜合子基因型頻率等于該兩基因頻率乘積的二倍。

2.群體樣本的檢驗(yàn)。OP>0.05說明所調(diào)查的群體達(dá)到了遺傳平衡,

也說明本次群體調(diào)查的數(shù)據(jù)可信。如果檢驗(yàn)的結(jié)果P<0.05,有三個(gè)問題

要考慮：被調(diào)查的群體不是處于遺傳平衡狀態(tài)；遺傳標(biāo)記分型的技術(shù)或標(biāo)

準(zhǔn)出現(xiàn)誤差；沒有達(dá)到隨機(jī)抽樣的要求。

17、連鎖平衡（linkageequilibrium,LE）：位于不同染色體的基因座，

或者位于同一染色體相距較遠(yuǎn)的基因座之間常常是按照隨機(jī)原則進(jìn)行組

合的，呈不連鎖遺傳，這種基因座之間沒有相關(guān)性的狀態(tài)。（乘法定理）

連鎖不平衡：在遺傳過程中，如果不同基因座上的等位基因沒有按照

孟德爾自由組合定律的隨機(jī)原則組合時(shí)，這些基因座的遺傳則處于一種連

鎖不平衡狀態(tài)。（具有一同遺傳的傾向）

18、雜合度（heterozygosity）：是一個(gè)傳統(tǒng)的遺傳學(xué)指標(biāo)，指群體中某

遺傳標(biāo)記所有基因型中雜合子所占的比例。

基因差異度：某一遺傳標(biāo)記在某群體中的變異程度。

19>個(gè)人識(shí)另！J率（probabilityofdiscriminationpower,DP）在群體中隨機(jī)

抽取兩個(gè)體，二者的遺傳標(biāo)記表型不相同的概率。

20、非父排除概率（excludingprobabilityofpaternity,PE）指孩子的非

親生父親的男子，能夠被某個(gè)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)排除的概率。

第三章DNA多態(tài)性的分子基礎(chǔ)

1、核酸的基本結(jié)構(gòu)單位是核昔酸，每個(gè)核甘酸由1分子磷酸、1分子

五碳糖（戊糖）和1分子堿基組成。

2、構(gòu)成核昔酸的堿基有為腺喋吟A和鳥喋吟（GDNA和RNA中均含

有）,

喀碇有胞喀咤C,胸腺喀咤T（DNA中）和尿喀咤U（RNA中）。DNA

分子中含有A.G.C.T四種堿基的脫氧核甘酸；RNA分子中含有A.G.C.U四種

堿基的核糖核甘酸，不同核甘酸的主要差別在于堿基。

3、DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)是指DNA分子中核昔酸的排列順序；二級(jí)結(jié)構(gòu)是指

兩條DNA單鏈形成的雙股螺旋結(jié)構(gòu)；三級(jí)結(jié)構(gòu)則是指雙鏈DNA進(jìn)一步扭

曲盤旋形成的超級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)（真核生物DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)特征性形式是核小

體。）

4、核酸是由眾多的核甘酸聚合而成的多聚核昔酸鏈?zhǔn)骄€性分子，相

鄰二個(gè)核昔酸之間的連接鍵即3',5'-磷酸二酯鍵。其基本結(jié)構(gòu)是有方向

的，形成不對稱的兩個(gè)末端，5'末端為磷酸，3'末端為羥基。方向：5'

端一3'端。

5、寡核昔酸是二至幾十個(gè)核昔酸殘基連接而成的線性核昔酸片段。

可由儀器自動(dòng)合成，可作為DNA合成的引物、基因探針等。

6、探針：標(biāo)記有示蹤物的寡核昔酸片段，通過與靶DNA特異性結(jié)合

（雜交）檢測靶DNA分子。引物：與模板DNA結(jié)合，引發(fā)DNA的合成反

應(yīng)中合成鏈的延伸反應(yīng)。

7、DNA鏈上不同的核甘酸分子差異部位是堿基，不同的堿基排列組

合包含了相應(yīng)的遺傳信息，堿基位于骨架雙鏈的內(nèi)部，使遺傳信息免受各

種理化因素的影響。雙鏈結(jié)構(gòu)本身較好的保障了遺傳信息的穩(wěn)定儲(chǔ)存和傳

遞。雙鏈中的每一條鏈都可以用對方或自身作為模板，按照堿基互補(bǔ)的原

則合成一條與自身相同或是互補(bǔ)的新鏈?；パa(bǔ)的雙鏈分別含有一套完整的

遺傳信息。

1粘性：溶質(zhì)分子不對稱性越大粘度越大。8、核酸高分子性質(zhì)：O

2酸堿性：兩性電解質(zhì)，酸性較強(qiáng)，在中性或弱堿性的溶液中，帶負(fù)

o

電荷。在電場中由負(fù)極向正極遷移，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)分子量大小不同的核

3紫外吸收：堿基中酸的電泳分離（DNA的提取的基本原理之一）。O

含有共癰雙鍵，具有紫外吸收的性質(zhì)，最大吸收波長為260nm。

9、變性［denaturation］：在一定條件下，堿基間氫鍵被打開，互補(bǔ)DNA

雙鏈變?yōu)閮蓷l單鏈的過程。

增色效應(yīng)［hyperchromiceffect］在熱變性的過程中，隨變性溫度升高，

DNA的紫外吸收增強(qiáng)，A260值升高。

融鏈溫度（meltingtemperature,Tm）是一半DNA發(fā)生變性時(shí)的溫度。

Tm的高低反映了DNA分子的熱穩(wěn)定性程度的高低。與G/C含量成正相關(guān)。

復(fù)性［renatration］變性因素撤除后，原變性的兩條互補(bǔ)單DNA鏈通過

堿基配對重新結(jié)合為雙鏈DNA的過程。

退火［annealing］加熱后變性的DNA在溫度降低過程中的復(fù)性。降解

［degradation］DNA分子的共價(jià)鍵斷裂，形成多個(gè)分子量更小的片段的過程。

雜交［hybridization］在復(fù)性條件下，來源不同、但具有同源性的DNA單

鏈按堿基配對原則形成雙鏈DNA分子的過程。（本質(zhì)：復(fù)性的過程；異源

DNA分子；具有同源性；形成雜合雙鏈。）

10、生物單個(gè)成熟生殖細(xì)胞（單倍體細(xì)胞）分子上的全部基因總和稱

為基因組，人類DNA分為核內(nèi)DNA和線粒體DNA,人類基因組包含核基

因組和線粒體基因組。人單個(gè)體細(xì)胞含有來自父源和母源的兩套基因組。

串聯(lián)重復(fù)序列：其結(jié)構(gòu)是以相對恒定的短序列作為重復(fù)單位，首尾相

接，串聯(lián)連接形成，多數(shù)位于非編碼區(qū)。按重復(fù)序列的長度和序列特征分

成大衛(wèi)星DNA,小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA（法醫(yī)物證中最常用的遺傳標(biāo)

記）等主要類型。

11、遺傳物質(zhì)DNA具有相當(dāng)高的穩(wěn)定性，但不是絕對穩(wěn)定。遺傳物質(zhì)

發(fā)生可遺傳的變異稱為突變?；蛲蛔兩婕癉NA序列中核昔酸順序或數(shù)目

的改變。僅涉及單個(gè)堿基改變的稱為點(diǎn)突變。（基因突變具有稀有性、多

向性、有害性、可逆性和可重復(fù)性）

12、突變后的基因相對于正常沒突變的基因而言，稱為突變型；原

來的、沒發(fā)生DNA分子結(jié)構(gòu)改變的個(gè)體表型則稱為野生型。

13>DNA多態(tài)性（DNApolymorphisms）在基因組中，由不同堿基構(gòu)成

的等位基因所形成的多態(tài)性。

DNA遺傳標(biāo)記是特定的堿基序列。具備遵循孟德爾遺傳規(guī)律和終身不

變等遺傳標(biāo)記特征。

DNA長度多態(tài)性：同一基因座上各等位基因之間的DNA片段長度差異

構(gòu)成的多態(tài)性。包括可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列VNTR和短串聯(lián)重復(fù)序列STR

（簡單序列、復(fù)合序列、復(fù)雜序列）。

DNA序列多態(tài)性：基因座上，不同個(gè)體DNA序列有一個(gè)或多個(gè)堿基的

差異而構(gòu)成的多態(tài)性。

14、在人類基因組范圍內(nèi)，如果任何單堿基突變使特定核昔酸位置上

出現(xiàn)兩種堿基其中最少的一種在群體中的頻率不少于1%,就形成單核昔

酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms,SNPs）。

第四章DNA長度多態(tài)性

1、限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlength

polymorphism,RFLP）利用DNA分子雜交技術(shù)對人類基因組的VNTR基因座

進(jìn)行分型，根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶和探針的特異性產(chǎn)生RFLP分析圖譜的個(gè)

體特異性。

檢驗(yàn)單個(gè)VNTR基因座一DNA紋?。―NAprofile）

同時(shí)檢驗(yàn)多個(gè)VNTR基因座一DNA指紋（DNAfingerprint）

1DNA提取、純化和定量：有機(jī)溶劑提取法，溶解核2、基本技術(shù)：O

膜、消化蛋白質(zhì)、萃取DNA；純化方法有機(jī)溶劑抽提，層析，吸附,

超濾；定量方法瓊脂糖凝膠電泳-EB熒光測定法，紫外分光光度法，

2限制性核酸內(nèi)切酶酶切：限制酶，識(shí)別特定DNADNA探針雜交法。

O

序列，水解序列內(nèi)磷酸二酯鍵，DNA雙鏈斷裂形成長度不同的DNA

片

3電泳分離：0.6%-0.8%瓊段，DNA片段電泳后與探針雜交，顯色。O

4印跡轉(zhuǎn)移。05探針選擇一單基脂凝膠電泳（加樣分子量標(biāo)準(zhǔn)物）。

O

6探針標(biāo)記07分子因座探針（DNA紋?。嗷蜃结槪―NA指紋）

O

8譜帶顯示雜交O

3、DNA紋印圖譜基本特征：高度多態(tài)性；共顯性等位基因遵循孟德

爾遺傳定律；組織同一性；不確切的群體遺傳學(xué)特征；高突變率；種屬特

異性；檢材質(zhì)、量及檢測技術(shù)要求高。

4、DNA指紋：多基因探針在低雜交強(qiáng)度下與不同染色體上多個(gè)VNTR

基因座雜交顯示出的RFLP圖譜

基本特征：片段傳遞符合孟德爾遺傳定律、獨(dú)立遺傳無連鎖；組織同

一性：甲基化、癌變（例外）；群體遺傳學(xué)：無法判定基因座及基因型；

高突變率。

局限：無種屬特靈敏度更低；DNA質(zhì)量更高；耗時(shí)更長；無基因座特

異性影響混合樣本；高突變率影響親子鑒定；結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)方法不統(tǒng)一；結(jié)

果分析不統(tǒng)一。

5、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是一種體外擴(kuò)

增特異性DNA片段的技術(shù)，類似于體內(nèi)DNA半保留復(fù)制，以基因組DNA

為模板、人工合成的一對寡核昔酸為引物，dNTP為原料，與待擴(kuò)增的DNA

片段在TaqDNA聚合酶的催化下，經(jīng)過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三

步循環(huán)使目標(biāo)片段達(dá)到百萬倍的擴(kuò)增。

變性：通過加熱（90攝氏度以上）使模板DNA雙鏈間氫鍵斷裂，雙

鏈解離形成兩條單鏈DNA的過程。

退火（復(fù)性）：將反應(yīng)體系降溫（至60攝氏度以下），引物與單鏈模

板DNA按堿基互補(bǔ)配對原則重新形成模板-引物雜化雙鏈的過程。

延伸：DNA聚合酶在適當(dāng)溫度條件（如72攝氏度）下催化4種dNTP

原料按堿基互補(bǔ)配對原則從引物的3,末端開始滲入，沿模板由5'-3'方

向延伸，合成一條新的DNA鏈的過程。

每經(jīng)過一次高溫變性、低溫退火和中溫延伸的循環(huán)周期，靶DNA片段

便被復(fù)制一次，在以后的循環(huán)中，新合成的DNA鏈又成為下一循環(huán)的模板,

一般情況下，在完成30次循環(huán)后，理論上DNA拷貝數(shù)可達(dá)105-107。

6、PCR反應(yīng)體系：①模板DNA②寡核甘酸引物③dNTP④Mg2+

⑤TaqDNA聚合酶；循環(huán)參數(shù)：溫度、時(shí)間。

7、PCR技術(shù)特點(diǎn)：靈敏度高；特異性高；適用于降解DNA檢材；種

屬特異性好；操作簡單，時(shí)間短，儀器自動(dòng)完成。負(fù)作用：有污染，樣本

要求高，影響因素多。

8、VNTR分型：早期應(yīng)用，擴(kuò)增2kb以上片段困難，10多個(gè)基因座曾

被應(yīng)用：D1S80,ApoB,DI7s30等，等位基因數(shù)10?30個(gè)，基因間長度

差異十分規(guī)律，是重復(fù)單位的整倍數(shù)，根據(jù)片段長度確定等位基因和基因

型，按遺傳規(guī)律傳遞。

9、復(fù)合擴(kuò)增：經(jīng)過篩選的STR基因座，擴(kuò)增條件基本相同，可以在

同一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增多個(gè)靶基因座。（多對引物）

復(fù)合擴(kuò)增可提高單次檢測的信息量，提高個(gè)人識(shí)別率，降低成本和檢

材的消耗，對微量檢材的鑒定特別有價(jià)值。

10、銀染系統(tǒng)：多基因座復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分離后，PAG凝膠直接用

銀染顯帶。體系中多個(gè)基因座的基因長度范圍必須互不重疊。

操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。因?yàn)槠伍L度范圍選擇受限制，能夠同時(shí)擴(kuò)增

的基因座個(gè)數(shù)有限。

11、熒光分型：常采用復(fù)合擴(kuò)增即在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或更

多的STR基因座，自動(dòng)化的激光熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行PCR產(chǎn)物分型。

12、miniSTR分型（短片斷STR分型）：通過重新設(shè)計(jì)引物，使其結(jié)合

在更靠近核心重復(fù)區(qū)的側(cè)翼序列，從而降低擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，進(jìn)一步提高

靈敏度和分型成功率的分型技術(shù)。

1因擴(kuò)增片段長度的限制，局限性：。構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)只能同時(shí)

擴(kuò)

增較少的基因座（通常每種顏色的熒光標(biāo)記的基因座一般不超過2個(gè)）。

要達(dá)與傳統(tǒng)試劑盒相近個(gè)人識(shí)別能力，必須增加復(fù)合擴(kuò)增的次

2miniSTR引物與傳統(tǒng)STR引物結(jié)合區(qū)間若存在堿基的缺失或插數(shù)。O

3某些STR基因座核入，易導(dǎo)致miniSTR傳統(tǒng)STR分型結(jié)果不一致。

O

心重復(fù)區(qū)上游或下游側(cè)翼序列存在口票吟或喀咤堿基堆積現(xiàn)象，則不利

4當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物過小時(shí)，于miniSTR引物設(shè)計(jì)。O染料污斑可使產(chǎn)

物

峰變寬、信號(hào)變強(qiáng)。

1連鎖遺傳：其在減13、Y-STR分型的遺傳特征及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：O

2Y染色體為父系遺傳，男性數(shù)分裂過程中Y-特異性區(qū)不發(fā)生重組。O

特有的遺傳標(biāo)記，同一父系的所有男性個(gè)體均具有相同的Y染色體

3Y染色體為單倍型遺傳，4評估Y-STRDNA序列。。除擬常染色體區(qū)。

O

鑒別能力的指標(biāo)是遺傳差異度（單倍型頻率=單倍型組合Xn/總個(gè)體）。

5其分型結(jié)果不具有唯一性，法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值在于排除。O

第五章STR自動(dòng)分型

1、概述：具有自動(dòng)化程度高、快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好

的特點(diǎn)?；A(chǔ)是確定復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物中，每一個(gè)等位基因片段的片段大小。

進(jìn)一步確定所屬基因座。核心是建立多基因復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)，采用3-4種

熒光染料分別標(biāo)記不同的STR基因座引物，同一種熒光染料標(biāo)記的STR基

因座擴(kuò)增產(chǎn)物大小不重復(fù)。

2、熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增：熒光染料標(biāo)記在引物的5,端，擴(kuò)增后使

相應(yīng)PCR產(chǎn)物的一條鏈均攜帶標(biāo)記引物的熒光染料，使擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測設(shè)

備上易識(shí)別。

注意事項(xiàng)：同一熒光標(biāo)記的不同STR的等位基因片段范圍不能重疊，

前一個(gè)STR最大的等位基因與后一個(gè)STR最小的等位基因相距最少lObpo

且兩者差值最好不應(yīng)為4的整數(shù)倍。在一個(gè)熒光復(fù)合擴(kuò)增體系中，組合熒

光染料的發(fā)射波長相差越大越好。以避免不同染料間光信號(hào)檢測時(shí)的相互

干擾。

3、毛細(xì)管電泳（變性凝膠電泳）適用范圍：能夠檢測100?500bp范

圍，長度相差lbp的兩個(gè)DNA片段。是當(dāng)前法醫(yī)DNA分型實(shí)驗(yàn)室用

于擴(kuò)增的主要手段。通過計(jì)算樣品產(chǎn)物從電泳分離起，到檢測窗被熒光檢

測裝置檢測到所用時(shí)間來對DNA片段大小進(jìn)行測量。（線性電泳）

4、對記錄到的等位基因片段峰圖，需要識(shí)別每一個(gè)片段的熒光種類

和片段大小，才能進(jìn)一步分型。過程：光譜分離；DNA片段大小分子量計(jì)

算；與Ladder比較進(jìn)行命名。

光譜分離：不同熒光染料間存在明顯的光譜交叉重疊，其第一步就是

從電泳結(jié)果數(shù)據(jù)收集的眾多片段峰中把每種顏色的峰找出來。（偽峰的消

除，使每個(gè)峰只保留單一顏色信號(hào)，為最強(qiáng)信號(hào)）

DNA片段分子量計(jì)算：在分子量內(nèi)標(biāo)范圍內(nèi)建直線回歸方程計(jì)算。命

名：樣本中等位基因的命名通過對Ladder比較確定。

1分型標(biāo)準(zhǔn)品等位基因命名錯(cuò)誤：在ladder中，每個(gè)5、圖譜分析：

O

基因座的各個(gè)等位基因的量不是完全相等，電泳檢測時(shí)，其相應(yīng)的信

號(hào)強(qiáng)度也不同。若某個(gè)基因座的某個(gè)等位基因片段相對較少，電泳時(shí)上樣

量又偏少，峰的閾值設(shè)置過高，ladder中該等位基因未能被正確識(shí)別。在

對ladder進(jìn)行等位基因命名時(shí);相應(yīng)基因座的等位基因全部或部分命名不

能被命名或錯(cuò)誤命名。

為防止這種錯(cuò)誤出現(xiàn)，要求STR分析中，每次檢測電泳時(shí)需要同時(shí)分

析一個(gè)已知對照DNA樣本。

2內(nèi)標(biāo)識(shí)別錯(cuò)誤：內(nèi)標(biāo)信號(hào)太低，標(biāo)準(zhǔn)品峰信號(hào)太低，電泳系統(tǒng)不能

O

有效分辯相鄰的兩個(gè)等位基因的情況下，自動(dòng)分型系統(tǒng)將不能完成對

分型標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)字化命名。

原因：信號(hào)太低，分析范圍設(shè)置錯(cuò)誤和電泳數(shù)據(jù)不全。

處理方法：信號(hào)低?通過調(diào)整閾值可正確識(shí)別內(nèi)標(biāo)，或重新電泳。分

析范圍設(shè)置錯(cuò)誤?通過調(diào)整分析范圍糾正。電泳數(shù)據(jù)不全?通過修改分子

量內(nèi)標(biāo)參數(shù)可以正確識(shí)別內(nèi)標(biāo)。

3基線跳躍或搖動(dòng)：?；€跳躍或搖動(dòng)可使基線太高，超過閾值峰，

程序?qū)堰@些超過閾值的基線識(shí)別為無數(shù)個(gè)峰片段，在圖譜上標(biāo)為

off-ladder.

原因：分析調(diào)用的matrix文件錯(cuò)誤或者不適合尤其是信號(hào)過強(qiáng)時(shí)。處

理方法：避免盲目增加電泳上樣量，信號(hào)過強(qiáng)，應(yīng)降少上樣量或稀釋產(chǎn)物。

理想的峰值在1000-3000之間。

4Stutter峰（影子峰或陰影帶）O：在STR分型圖譜中，常常在一個(gè)

目標(biāo)STR等位基因峰前少一個(gè)重復(fù)單位的位置出現(xiàn)一個(gè)信號(hào)較弱的

峰，這種額外的峰就是由于PCR過程中的復(fù)制滑脫形成的擴(kuò)增片段。

形成原因是PCR擴(kuò)增時(shí)復(fù)制滑脫，導(dǎo)致某些PCR產(chǎn)物比正常PCR產(chǎn)物

少一個(gè)重復(fù)序列。

Stutter帶峰高一般是正常PCR峰高的15%以下，且位于主峰小一個(gè)重

復(fù)單位的位置。

在同一位點(diǎn)，Stutter帶的出現(xiàn)機(jī)率隨著等位基因片段的增大或者擴(kuò)增

體系中DNA量的增加而增加。對于混臺(tái)樣品，尤其是隨機(jī)混合的現(xiàn)場檢材,

則判斷混合等位基因時(shí)應(yīng)慎重。

處理方法：減少樣本DNA模板，或者減少電泳的上樣量以降低峰信號(hào)

強(qiáng)度。提高峰閾值或采取峰信號(hào)過濾，就可以消除Stutter帶。

5非模板依賴加A：在DNA聚合酶能夠在擴(kuò)增產(chǎn)物的3'末端非O

特異性地連接一個(gè)腺甘酸。

雙尖峰：同一個(gè)等位基因形成加APCR產(chǎn)物片段與未加APCR產(chǎn)物片

段，在電泳分析時(shí)被識(shí)別為2個(gè)峰，2個(gè)峰基部融合為一個(gè)峰，這種尖部

分分叉形成兩個(gè)峰尖。（加A不全）

形成原因：模板過多、含有PCR抑制劑、酶過少或酶活性減低。一般

小片段的等位基因內(nèi)多見。如果大片段出現(xiàn)雙尖峰，可能是該基因座出現(xiàn)

等位基因微變異。

6其他偽峰：當(dāng)設(shè)備電流輸出出現(xiàn)短暫跳動(dòng)時(shí)。在數(shù)據(jù)峰圖上O

會(huì)出現(xiàn)信號(hào)基線的突然跳動(dòng)。表現(xiàn)為圖峰突然抬高的斷層式圖峰，可

能識(shí)別為片段峰。

特點(diǎn)：左側(cè)近似直線抬高，達(dá)到峰尖后稍慢回落。呈現(xiàn)楔形。每種顏

色在相同的位置都會(huì)類似的峰。

當(dāng)電極緩沖液中有帶負(fù)電固體顆粒，信號(hào)峰上出現(xiàn)棒狀圖形。（直線

上升，直線下降）。處理方法：過濾電極緩沖液。

7性別識(shí)別圖譜異常：男性樣本只檢出X峰或Y峰。O

8峰的均衡性：一般情況下,純合子等位基因的峰高和面積比雜O

合子的高，但相差不會(huì)超過30%。雜合子2個(gè)等位基因的峰高和面

積相當(dāng)。實(shí)際上，在雜合子2個(gè)等位基因中，小片段的峰高大于大片段的。

原因是擴(kuò)增不平衡。

有些檢材9個(gè)STR基因座等位基因均與對照樣品一致，但檢材中每個(gè)

位點(diǎn)內(nèi)等位基因之間峰高相差遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于30%o這主要是因?yàn)镈NA模板量

太少，等位基因不平衡擴(kuò)增所致，這時(shí)應(yīng)重新

或加大模板量后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者用有機(jī)法重新提取DNA后

再擴(kuò)增，一般可以解決上述問題。

若出現(xiàn)兩等位基因的峰高相差超過70%,就要考慮混合樣本。

9雜合性丟失或3等位基因：3等位基因?一個(gè)基因座出現(xiàn)3個(gè)O

等位基因。分析：混合樣本、污染樣本、3等位基因。混合樣本

表現(xiàn)為多個(gè)基因座上存在有3~4個(gè)等位基因，污染常會(huì)波及同批

次多個(gè)樣本。如果僅極個(gè)別樣本一個(gè)基因座出現(xiàn)3等位基因，由

變異造成。

lOoff-ladder峰：在STR分型圖譜中，常會(huì)遇到部分樣本的少O

量片段峰未被程序化數(shù)字命名，在分型圖譜中被識(shí)別為

off-ladder峰。

產(chǎn)生原因：大多數(shù)由于擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳過程中的漂移作用，

使他們被檢測到的片段大小稍稍偏離了相應(yīng)的等位基因，軟件無

法識(shí)別。(少數(shù)是由于出現(xiàn)稀有等位基因)

處理方法：通過分析已判定的等位基因分別于各自等位基因

漂移的情況，對。ff-ladder峰漂移進(jìn)行校正。人工命名該等位

基因。

6、影響因素：降解檢材；PCR抑制物；樣本污染；微量檢材

低拷貝數(shù)DNA(lowcopynumber,LCN)一般把基因座含量小

于lOOpg的樣本。

第六章DNA序列多態(tài)性

1、在人類基因組范圍內(nèi)，如果任何單堿基突變使特定核昔酸位置上

出現(xiàn)兩種或兩種以上堿基，其中最少的一種在群體中的頻率不少于

1%,就形成單核昔酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,

SNPs)o

含量豐富，至少有300萬個(gè)，比小衛(wèi)星和微衛(wèi)星分布更廣泛；遺傳穩(wěn)

定性高，對親子鑒定影響??；單個(gè)SNP多態(tài)性程度低：二等位基因；

需結(jié)合高通量技術(shù)檢測大量的SNPs才能達(dá)到較高的識(shí)別能力。

2、序列多態(tài)性分析技術(shù)：建立在雜交、酶切、PCR、電泳等基本技術(shù)

之上,包括:測序技術(shù);其它傳統(tǒng)技術(shù):等位基因特異性寡核昔酸（ASO）

探針技術(shù)、MVR-PCR序列多態(tài)性、擴(kuò)增片段限制性長度多態(tài)性技術(shù)

PCR-RFLP；高新技術(shù)：基質(zhì)輔助激光解析電離MALID-TOF,焦磷酸測

序技術(shù)、微測序技術(shù)、DHPLC、實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

3、DNA測序：對DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析（ATCG的排列）。

方法與基本原理：雙脫氧核昔酸鏈終止法（4個(gè)基本條件：模板、引

物、dNTP、DNA聚合酶；ddNTP摻入具有隨機(jī)性和競爭性，使片段的合成

隨機(jī)地終止的相應(yīng)的位置）一PCR循環(huán)測序（基于PCR原理的測序采用了

熱循環(huán)高效合成，DNA的特性結(jié)合雙脫氧核昔酸終止法，使引物鏈終止的

延伸產(chǎn)物數(shù)量在循環(huán)過程中得到增加）一DNA自動(dòng)測序。

4、等位基因特異性寡核甘酸（ASO）探針技術(shù)：根據(jù)等位基因的序列

差異，設(shè)計(jì)并合成針對不同等位基因的DNA探針，利用雜交技術(shù)使探針和

經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的靶基因座結(jié)合并顯像，即PCR-ASO技術(shù)。技術(shù)路線：

針對序列多態(tài)性等位基因序列設(shè)計(jì)特異性探針；PCR擴(kuò)增各等位基因；ASO

探針與PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng);洗膜洗去未結(jié)合/結(jié)合部牢固的非特異性探針；

檢測標(biāo)記物是否存在

點(diǎn)印記雜交：正向雜交一固定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、標(biāo)記探針；反向雜交一

固定探針、標(biāo)記PCR擴(kuò)增引物。

技術(shù)優(yōu)勢：分型技術(shù)簡單，結(jié)果容易判定；無電泳步驟，省時(shí)；重復(fù)

性好；特異性及靈敏度高；

局限：基因座少、識(shí)別能力有限。

5、擴(kuò)增片段限制性長度多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP）：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增

靶基因片段，限制性酶切擴(kuò)增片段，由于不同個(gè)體的酶的識(shí)別位置不同、

變異的堿基使酶切位點(diǎn)消失或移動(dòng)，導(dǎo)致酶切后片段長度的不同，從而把

序列多態(tài)性（序列差異）轉(zhuǎn)變成長度差異進(jìn)行檢測。基本技術(shù):PCR擴(kuò)增

一限制性酶切一電泳分型

技術(shù)優(yōu)勢：分型技術(shù)簡單，結(jié)果容易判定；電泳后不需測定片段長度，

避免了測量誤差，可準(zhǔn)確判斷基因型；分型結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性好；特異

性及靈敏度高；

局限：序列差異涉及限制酶識(shí)別序列，可用基因座少，約有1/3序列

多態(tài)性變異；二態(tài)性，等位基因數(shù)少；限制酶消化要求嚴(yán)格，酶切必須完

全。

6、序列多態(tài)性的其它分析技術(shù)：

1DNA芯片技術(shù)：本質(zhì)是核酸分子雜交；將數(shù)以萬計(jì)的探針有序地排

O

列在支持膜上，同時(shí)與樣品DNA中大量的序列多態(tài)性基因座雜交。通

過雜交信號(hào)的檢測和計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析處理，對樣本的進(jìn)行定量和定性分析。

是DNA檢測技術(shù)向微型化、自動(dòng)化、高通量方向的發(fā)展。2基質(zhì)輔助激

光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）O：高靈敏

度，高質(zhì)量檢測范圍。樣品分散在基質(zhì)中形成晶體，激光照射晶體，

樣品吸收能量與基質(zhì)解吸附，基質(zhì)-樣品間的電荷轉(zhuǎn)移使樣品電離，是一種

軟電離技術(shù)。

TOF-MS的原理：離子在電場作用下加速飛過真空飛行管，離子的飛

行時(shí)間與成正比離子的質(zhì)荷比（M/Z）成正比，根據(jù)離子到達(dá)檢測器的飛

行時(shí)間不同而檢測到樣品離子的分子量。

法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：靈敏度高；分析準(zhǔn)確；快速、高效。

3變性高效液相色譜：O是一種快速篩選DNA序列變異的技術(shù)。適用

于對mtDNA多態(tài)性的分析，可以直接將需要比對的樣本（或檢材）混合

后進(jìn)行比對。

4焦磷酸測序技術(shù)：一種基于發(fā)光法測定焦磷酸鹽PPi測序技術(shù)。O

法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：Pyrosequencing技術(shù)操作簡單，不需要電泳，適合短片

段DNA序列分析，結(jié)果準(zhǔn)確。焦磷酸測序基于堿基逐個(gè)延伸的原理來測序,

產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度含有定量信息，是估計(jì)SNP等位基因頻率的好辦法。多個(gè)

樣本混合后按一個(gè)樣本檢測，根據(jù)峰高可估計(jì)某個(gè)SNP等位基因的頻率。

焦磷酸測序法可用于檢測SNP單倍型和mtDNA-SNP多態(tài)性。

5微測序技術(shù)：法醫(yī)常用SNaPshot方法，是一種能進(jìn)行復(fù)合分析的O

引物延伸分析技術(shù)。是以熒光染料標(biāo)記的ddNTP進(jìn)行等位基因特異性

引物延伸，通過電泳平臺(tái)顯示結(jié)果。

6實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中引入熒光基團(tuán)，利用熒光信

O

號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對未知

模

板進(jìn)行定量分析的方法。是一種指數(shù)增長期定量的方法。

第七章線粒體DNA多態(tài)性

1、線粒體mitochondrion：氧化磷酸化和提供能量的場所，是細(xì)胞核

外DNA。光鏡下線粒體外型多樣，一般為顆粒狀；電鏡下的主要特征是雙

層膜且有喳?；|(zhì)中一-三較酸循環(huán)所需的全部酶類，內(nèi)膜上--呼吸鏈酶

系及ATP復(fù)合體。

線粒體是唯一含DNA的細(xì)胞器，mtDNA編碼能量代謝相關(guān)的酶類和

RNAo人體不同組織細(xì)胞的代謝不同，所含線粒體的數(shù)目及mtDNA的拷

貝數(shù)不同。除了紅細(xì)胞外，人類所有體細(xì)胞都含有線粒體。不同組織一個(gè)

細(xì)胞內(nèi)mtDNA數(shù)目在數(shù)百至數(shù)萬之間變化。結(jié)構(gòu)和功能：雙鏈反向平行，

外環(huán)為重鏈（H鏈），內(nèi)環(huán)為輕鏈（L鏈）。

2、線粒體遺傳體系與細(xì)菌具有相似的特征：環(huán)形分子，不含內(nèi)含子；

核糖體為70srRNA；RNA聚合酶不同，對藥物反應(yīng)性不同；氨酰基t-RNA

合成酶與細(xì)胞質(zhì)中的不同；起始氨酰基t-RNA為N甲酰甲硫氨酰"RNA；

遺傳密碼與通用密碼不同。

3、線粒體DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄：自身復(fù)制一單向復(fù)制:置換環(huán)復(fù)制或D-

環(huán)（D-loop）復(fù)制。不對稱的復(fù)制一H鏈和L鏈各有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，先復(fù)制H

鏈，H鏈復(fù)制到達(dá)L鏈起始點(diǎn)后，L鏈開始復(fù)制，H鏈復(fù)制起點(diǎn)附近。對

稱轉(zhuǎn)錄-兩條鏈同時(shí)轉(zhuǎn)錄合成RNAo

1母系遺傳：4、mtDNA的遺傳學(xué)特征：OmtDNA直接從母親傳遞給

她的

2高拷貝和異質(zhì)性：孩子；。高拷貝是mtDNA在一個(gè)細(xì)胞中具有數(shù)百

到數(shù)萬個(gè)拷貝，因此mtDNA突變比例可以在0到100%之間變化。異質(zhì)

性是指當(dāng)兩種不同的mtDNA序列存在于一個(gè)個(gè)體的細(xì)胞、組織和

3瓶頸效應(yīng)和復(fù)制分離：不同的個(gè)體。O卵細(xì)胞中有100000左右拷

貝

的mtDNA,在受精卵形成時(shí)，只有1到數(shù)個(gè)拷貝卵細(xì)胞的mtDNA進(jìn)

入到受精卵，這個(gè)現(xiàn)象稱為瓶頸效應(yīng)，可解釋在一些線粒體遺傳病具有很

高的家族間臨床變異性。個(gè)體中，突變mtDNA的比例可隨細(xì)胞分裂及有

絲分裂后期組織中mtDNA復(fù)制而發(fā)生變化，最終可致表現(xiàn)型變化。4閾值

效應(yīng)：對于異質(zhì)性的mtDNA突變，細(xì)胞可以承受正常的mtDNA。

減少直到一個(gè)閾值時(shí)細(xì)胞才調(diào)亡或細(xì)胞的功能受損。當(dāng)一個(gè)組織中有

足夠多的細(xì)胞受到影響時(shí)就表現(xiàn)出臨床癥狀.

5、mtDNA多態(tài)性：主要分布：非編碼區(qū)(控制區(qū)、D-環(huán)區(qū))和部分

編碼區(qū)，含有啟動(dòng)子和重鏈復(fù)制的起點(diǎn)，跨距約llOObp,個(gè)體間存在較大

差異。

多態(tài)性形成的主要原因：mtDNA沒有組蛋白的保護(hù)；DNA聚合酶缺乏

3'-5'外切酶校正功能；缺乏DNA損傷的修復(fù)體系；控制區(qū)極少或不受

來自選擇壓力的影響

6、單核昔酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)：線粒體

DNA的SNP多態(tài)性是指在一個(gè)種族不同個(gè)體的基因組或共同序列之間，存

在一個(gè)單核甘酸A、T、C、G的差異，這種DNA序列的差異稱為單核甘酸

多態(tài)性。

單倍群(haplogroup)或單倍型類群：一組類似的單倍型，他們有共

同的單核甘酸多態(tài)性祖先。

7、mtDNA分型命名：個(gè)體mtDNA分型以修正的劍橋序列(rCRS)作

為參照序列進(jìn)行分型命名。

1唯一的核外DNA來源：可8、mtDNA的特點(diǎn)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用優(yōu)勢:

o

檢測樣品范圍增大，為很少或沒有nDNA（nucleicDNA）的樣本的檢

2拷貝數(shù)多：適于微量、高驗(yàn)提供了希望，如骨骼、指甲、毛干等；

O

3母系遺傳：可選擇的比對參照樣本范圍擴(kuò)大。度降解樣本。O

如遺骸的個(gè)人認(rèn)定或一個(gè)失蹤的人無法提供參考樣本，可用其母親、

兄弟姐妹等血液作為參考樣本。

9、mtDNA序列分析的一般用于下列情況：脫落毛發(fā)；指甲、骨骼或

牙齒樣本；極微量血痕；核DNA分型失敗樣本。

10、mtDNA分型的特殊問題：

1母系遺傳：鑒定意義不在于認(rèn)定，而在于排除同一性；。同一母系

后

代，mtDNA序列相同，可將遺傳情況追溯到一代以上，適用于失蹤

2多態(tài)性程人員；對于母子、母女等母系親緣關(guān)系鑒定有參考價(jià)值。

O

度有限:無論有多少堿基變異，都只是一個(gè)單倍型個(gè)人識(shí)別率低，隨機(jī)

匹配概率對于STR基因座而言，幾乎沒有任何意義。

在mtDNA的雙向測序結(jié)果中，在同一堿基的位置出現(xiàn)了明顯高于背

景水平的兩個(gè)峰（次峰信號(hào)占主峰的40%以上），則可考慮該位點(diǎn)的異質(zhì)

性。

結(jié)果解釋（排除、不能定論、未能排除）：比對樣品有2個(gè)以上的堿

基序列不同-一排除；比對樣品有1個(gè)堿基序列不同一異質(zhì)/不能確定；比

對樣品堿基序列相同一不能排除，匹配-一可能來自嫌疑人；可能來自與嫌

疑人同一母系的人；可能來自與嫌疑人無母系關(guān)系的同一個(gè)體?？紤]案件

限定范圍，可有認(rèn)定意義。

第十三章法醫(yī)物證檢材的提取、包裝和送檢

一、掌握法醫(yī)物證檢材的概念、類型及特點(diǎn)。

二、掌握法醫(yī)物證檢材的發(fā)現(xiàn)、提取、包裝、保存和送檢原則與方法。

三、掌握法醫(yī)物證檢驗(yàn)的一般程序和基本要求。

凡是與案件有關(guān)并可為偵察提供線索、為審判提供證據(jù)，能揭露和證

實(shí)案件性質(zhì)的生物物品皆為法醫(yī)學(xué)物證。物證檢驗(yàn)的基本過程包括從發(fā)

現(xiàn)檢材到檢驗(yàn)、做出鑒定結(jié)論的全過程，主要分為兩個(gè)階段。第一階段主

要在案件勘查或案件調(diào)查過程中完成，通過對案件發(fā)生現(xiàn)場，犯罪嫌疑人

住所、活動(dòng)場所、衣物、用品等進(jìn)行勘查，對發(fā)現(xiàn)的檢材進(jìn)行觀察、記錄、

拍照、錄像并制定恰當(dāng)?shù)牟杉?、保存方案。第二階段為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)鑒定,

這一階段是對現(xiàn)場收集

的可疑樣品及舉證需要的參考樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，重點(diǎn)解決個(gè)體識(shí)別，即

判斷現(xiàn)場采集的法醫(yī)物證檢材來自何人。

檢材的特點(diǎn)：容易變性、變質(zhì)、降解和腐敗

一、檢材的發(fā)現(xiàn)：血痕、精斑、唾液斑、皮膚及其他臟器組織碎塊、

毛發(fā)、植物斑痕

原則：全面、充分和仔細(xì)。

二、檢材的提?。盒迈r血液、血痕、精斑、唾液及唾液斑、其他體液、

毛發(fā)、組織器官、植物

原則：不損失、不污染、不破壞檢材的可檢測性

細(xì)節(jié)：小件整取、大件分割、空白對照、必須戴手套。

三、檢材包裝、保存與送檢

原則：獨(dú)立包裝、唯一標(biāo)識(shí)、根據(jù)情況恰當(dāng)保存

細(xì)節(jié)：斑痕陰涼風(fēng)干，不用塑料袋；乙醇保存組織；短時(shí)間低溫保存，

長時(shí)間-20℃。

四、檢驗(yàn)程序和要求（實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)）

原則：選擇的檢驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確、高效、靈敏；非消耗性實(shí)驗(yàn)先于消

耗性實(shí)驗(yàn)

細(xì)節(jié)：嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)流程和規(guī)范、檢驗(yàn)程序和方法步驟。

第十四章血痕檢驗(yàn)

掌握：血痕預(yù)試驗(yàn)、確證試驗(yàn)、種屬鑒定的基本原理、方法及意義。

血痕ABO血型測定的原理、方法、結(jié)果評價(jià)。

熟悉：血痕檢驗(yàn)的任務(wù)、意義及步驟；

了解：血痕的紅細(xì)胞酶型、血清型、DNA多態(tài)性檢測的價(jià)值、方法及

結(jié)果評價(jià)。血痕的性別鑒定、出血部位判斷及出血量估計(jì)。血痕是血液

在人體外干燥后所形成的斑跡。

血痕的特點(diǎn)：1.最為常見。2.一旦離開人體，就面臨外界物理、化學(xué)

以及生物學(xué)因素的作用和影響。離開機(jī)體的時(shí)間越長，血液成分改變越大。

3.血痕的物理化學(xué)特點(diǎn)與血痕檢驗(yàn)的方法及策略密切相關(guān)。血痕檢驗(yàn)的目

的和要求L是否血痕；2.是人血還是動(dòng)物血；3.血痕的個(gè)人識(shí)別；4.與

案情有關(guān)的其他問題

血痕的檢驗(yàn)程序：肉眼檢查；預(yù)試驗(yàn)；確證試驗(yàn)；種屬鑒定；遺傳標(biāo)

記測定；其他檢驗(yàn)等。

肉眼觀察觀察的主要內(nèi)容為：血痕的部位、血痕的顏色、血痕的形狀、

血痕的范圍

注意：肉眼檢查以及后續(xù)的所有實(shí)驗(yàn)室檢查，不能用手觸摸檢材。血

痕預(yù)試驗(yàn)(preliminarytest)

類型：篩選試驗(yàn)；目的：排除非血痕檢材

檢測對象：血痕中的血紅蛋白或正鐵血紅素的過氧化物酶活性。主

要方法：聯(lián)苯胺試驗(yàn)、酚醐實(shí)驗(yàn)、無色孔雀綠實(shí)驗(yàn)等

聯(lián)苯胺試驗(yàn)

原理：利用血痕中的血紅蛋白或正鐵紅素具有的過氧化物酶活性，使

過氧化氫釋放出新生態(tài)氧，將無色聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍(lán)。嚴(yán)格遵守試

劑滴加順序：冰醋酸一聯(lián)苯胺一雙氧水

兩類干擾物質(zhì)：1.植物、水藻、蔬菜、膿液、鼻涕等具有天然過氧化

酶活性。2.氧化劑：未加雙氧水，直接將聯(lián)苯胺一藍(lán)色所以不能改變加

樣順序。

注意事項(xiàng)：1.靈敏度高，1/50萬。2.特異性不高，兩類干擾物質(zhì)。

3.聯(lián)苯胺可以破壞血痕，試劑容易失效。4.聯(lián)苯胺是致癌物質(zhì)，自

我保護(hù)。5.陽性說明可能是血痕，不能確證為血痕。

6.意義在陰性結(jié)果；未檢出血痕(不是血痕或者血痕徹底破壞)。血

痕確證試驗(yàn)(conclusivetest)可省略

類型：肯定性分析；目的：確證檢材是否為血；檢測對象：血紅蛋白

及其衍生物

主要方法：結(jié)晶試驗(yàn)（血色原結(jié)晶試驗(yàn)、氯化血紅素結(jié)晶試驗(yàn)）、吸

收光譜檢查、細(xì)胞學(xué)方法

血色原結(jié)晶試驗(yàn)

原理：血紅蛋白在堿性溶液中分解為正鐵血紅素和變性珠蛋白。在還

原劑的作用下正鐵血紅素還原為血紅素，同變性珠蛋白和其他含氮化合物

（如此咤、氨基酸等）結(jié)合形成血色原結(jié)晶

特點(diǎn)及注意事項(xiàng)：1.操作簡單，效果較好；2.特異性好，肯定是血痕；

3.意義在陽性結(jié)果；4.靈敏度低，1/200,陰性一種屬；5.試劑易失效，

強(qiáng)調(diào)陽性對照。

吸收光譜檢查

原理：有色物質(zhì)能吸收一定波長的光，當(dāng)日光通過有色物質(zhì)時(shí)，再經(jīng)

過分光鏡時(shí)，因其中某些波長的光被吸收，便會(huì)在光譜上相應(yīng)波長區(qū)域內(nèi)

出現(xiàn)黑色吸收線。血紅蛋白及其衍生物均系有色物質(zhì)，具很強(qiáng)的選擇性吸

收光線的性質(zhì)，在分光鏡下檢查是否有特定的吸收線，可確

定是否是血痕。

種屬鑒定（speciesidentification）

類型：肯定性分析，關(guān)鍵步驟；目的：確證檢材是否為人血；要求:

靈敏度比確證實(shí)驗(yàn)高

主要方法：1、血清學(xué)方法-沉淀反應(yīng)（環(huán)狀沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、

絮狀反應(yīng)）；凝集反應(yīng)（抗人血紅蛋白凝集反應(yīng)、活性炭凝集反應(yīng)）；酶聯(lián)免

疫吸附試驗(yàn)；2、細(xì)胞學(xué)方法-抗球蛋白消耗試驗(yàn)3、生化方法：血紅蛋白

等電聚焦4、分子生物學(xué)方法：DNA-PCR技術(shù)環(huán)狀沉淀反應(yīng)

沉淀反應(yīng)（precipitationreaction）：是一種經(jīng)典的免疫反應(yīng)?？扇苄钥?/p>

原與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，當(dāng)抗原抗體比例適合時(shí)可形成肉眼可見的

抗原-抗體復(fù)合物沉淀。

實(shí)驗(yàn)方法：1.抗血清制備2.血痕浸出液的制備3.環(huán)狀沉淀反應(yīng)過程。

1.抗血清質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1）無菌、澄清透明。2）效價(jià)達(dá)10000倍以上，

lOmin內(nèi)出現(xiàn)明顯沉淀。3）特異性好，與其他動(dòng)物血不發(fā)生反應(yīng)。種屬特

異性：某一種屬抗原發(fā)生反應(yīng)。臟器特異性：某一臟器發(fā)生反應(yīng)。

1.近親反應(yīng)：親緣關(guān)系較近的動(dòng)物血（猴）與抗人血清或抗人血紅蛋白血

清發(fā)生沉淀反應(yīng)。

2.類屬反應(yīng)：抗血清與抗原親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的其它動(dòng)物蛋白發(fā)生的交叉

反應(yīng)。

吸收法、稀釋法。類屬反應(yīng)容易消除，近親反應(yīng)難以消除

血痕浸出液的要求：1）澄清透明，淡稻草黃色2）蛋白濃度在1/1000

以下。（觀察浸出液的顏色；氣泡能維持?jǐn)?shù)十秒）3）pH中性，否則酸性條

件出現(xiàn)假陽性，堿性條件出現(xiàn)假陰性。

抗人血紅蛋白膠體金試驗(yàn)

原理：膠體金由金屬化合物制成，帶負(fù)電荷，可作為抗體染料結(jié)合物。

膠體金將抗體免疫球蛋白吸附在表面，形成一種標(biāo)記了該種免疫球蛋白的

“探針”，用此“探針”可以結(jié)合相對應(yīng)的抗原。免疫層析膠體金試劑

條是將所有反應(yīng)物均固定在硝酸纖維素膜上，反應(yīng)利用膜的毛細(xì)作用原理。

免疫膠體金+相應(yīng)的抗原結(jié)合一膠體金顆粒呈紅色，即陽性。

膠體金人血紅蛋白檢測試紙條：加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)（檢測線：檢測抗原

的抗體；質(zhì)控線：抗免疫球蛋白抗體）吸附區(qū)

DNA檢驗(yàn)（Alu序列檢測、28srRNA序列鑒定、細(xì)胞色素b基因鑒別）

選擇遺傳標(biāo)記的原則：①遺傳多態(tài)性高；②穩(wěn)定性好；③檢測方法已標(biāo)準(zhǔn)

化、簡便快速、結(jié)果重復(fù)性好。

個(gè)人識(shí)別

原則：具有良好的遺傳多態(tài)性；較穩(wěn)定；檢測方法已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化、簡

便快速、結(jié)果重復(fù)性好。

遺傳標(biāo)記檢測主要障礙：檢材保存不當(dāng)、被水浸濕-導(dǎo)致其中蛋白質(zhì)成

分嚴(yán)重降解遺傳標(biāo)記被破壞；真菌污染并大量生長

血痕的紅細(xì)胞血型測定

血痕的ABO血型：紅細(xì)胞上有凝集原，血清中有凝集素，所以有兩種

方法檢測凝集原和檢測凝集素

1.ABH凝集原測定a:紅細(xì)胞懸液的制備b:抗體效價(jià)的標(biāo)化

紅細(xì)胞混懸液制備：取血液數(shù)滴滴入小試管內(nèi)，加入多量生理鹽水,

混勻后置離心機(jī)內(nèi)離心，4000rpm,lmin,取出，棄去上清液。再重復(fù)一

次，留下管內(nèi)的壓積紅細(xì)胞備用。

紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白逸出并進(jìn)入血漿中的現(xiàn)象，稱為紅細(xì)胞溶解,簡稱溶

血。

抗體效價(jià)：能使紅細(xì)胞凝集的抗體最高稀釋倍數(shù)即為該抗體的效價(jià)

若抗體的效價(jià)為128時(shí)，要將之效價(jià)標(biāo)化為16,則16/128=1/8,即1份抗

體，7份生理鹽水混勻即成。

吸U攵試驗(yàn)(absorptiontest)P317表14-2

用血痕中的血型物質(zhì)吸收抗血清中的抗體，檢測抗血清中抗體效價(jià)在

吸收前后的變化，判斷血痕血型。

血清抗體-加入未知血痕-抗體吸收-指示紅細(xì)胞檢測--同型血痕吸收

抗體

吸收試驗(yàn)特點(diǎn)：(1)經(jīng)典方法，結(jié)果穩(wěn)定可靠。⑵抗血清效價(jià)宜用8?

16o抗血清效價(jià)太高，可能被抗原吸收不全，導(dǎo)致假陰性。⑶要求檢

材量較多，如檢材太少，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。⑷血痕基質(zhì)對抗血清試劑有

非特異性吸收作用，無血痕部位基質(zhì)作對照。

解離試驗(yàn)(elutiontest)P318表14-3

是用血痕吸收抗血清中的抗體，然后檢測與血痕中血型物質(zhì)結(jié)合的抗

體類型，判斷血痕的血型

未知血痕-置于抗血清中吸收抗體-生理鹽水洗滌數(shù)次-56°釋放抗體

-取出已經(jīng)釋放抗體的血痕，加入指示紅細(xì)胞檢測

特點(diǎn)：⑴實(shí)驗(yàn)靈敏度高，檢材用量少，適用微量檢材。⑵實(shí)驗(yàn)所需時(shí)

間較短，實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備簡單。⑶實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，其中洗

滌步驟是關(guān)鍵，洗多容易出假陰性；洗少容易出假陽性結(jié)果。⑷抗體效價(jià)

應(yīng)高于64,蛋清粘附解離試驗(yàn)抗血清效價(jià)不應(yīng)低于1：128o⑸必須設(shè)置

已知A和B型血痕對照。選擇對照血痕時(shí)應(yīng)注意與檢材血痕濃度相當(dāng)、時(shí)

間相近、基質(zhì)相同。

2.ABH凝集素測定：原理是血痕的血清成分含有抗-A、抗-B凝集素，

用已知紅細(xì)胞測定血痕中的凝集素成份，也可以判斷血痕的ABO血型。凝

集素測定的意義在陽性結(jié)果，陰性結(jié)果沒有意義。

DNA分析重點(diǎn)在于DNA的提取

第十五章精液斑檢驗(yàn)

掌握精斑的概念、特點(diǎn)；精斑的預(yù)試驗(yàn)（酸性磷酸酶實(shí)驗(yàn)）、確證試

驗(yàn)（精子檢出法、前列腺特異抗原P30檢測）、個(gè)人識(shí)別（中和法測定ABO

血型；DNA檢驗(yàn)）；

熟悉精斑的檢驗(yàn)?zāi)康暮蜋z驗(yàn)程序；精斑的肉眼觀察；

了解精斑的血清型檢驗(yàn)和酶型檢驗(yàn)；精斑檢驗(yàn)的其它檢測方法。精

液斑（seminalstain）：簡稱精斑，精液浸潤或附著于基質(zhì)上，干燥后形成

的斑痕。

特點(diǎn)：1）附著的部位或基質(zhì)多樣化；2）陰道擦拭物（陰道拭子）是

常見的重要的精斑檢材；3）精斑沒有固定的形態(tài)，外觀常因附著物不同

而有差異。

精液主要由精子及精漿組成，是一種含蛋白質(zhì)、各種酶及果糖等多種

成分的堿性乳白色膠狀液體。精漿組成-精囊液、前列腺液（酸性磷酸酶）、

尿道球腺液和尿道旁腺液，蛋白成分1）與人血清共有的蛋白成分：如白

蛋白、維生素D結(jié)合蛋白等一具有多態(tài)性，用于個(gè)人識(shí)別；2）精漿中特

有的蛋白成分：如前列腺特異性抗原（p30）一精斑的確證實(shí)驗(yàn)；a2-精

漿蛋白（a2-SGP）-測定ABH抗原，個(gè)人識(shí)別；8-微精蛋白、B-精漿蛋

白等。酶類1）酸性磷酸酶一一精斑的預(yù)試驗(yàn)2）乳酸脫氫酶：LDH-X-

一精斑的確證試驗(yàn)3）黃遞酶（DIA3）、磷酸葡萄變位酶（PGM）、Y-谷氨酰

轉(zhuǎn)肽酶、乙二醛酶等一多態(tài)性，用于個(gè)人識(shí)別4）凝固酶、中性蛋白酶、

纖溶酶等。精液在體外的形狀，正常精子分頭、尾兩部分，正面

觀呈卵圓形，側(cè)面觀呈梨形，主要由頂體和致密的精子細(xì)胞核組成。

精斑檢驗(yàn)的目的與程序：1.檢驗(yàn)?zāi)康?）可疑斑痕是否為精斑？2）

若為精斑，確定精斑的個(gè)人來源。2.檢驗(yàn)程序1）肉眼觀察;2）預(yù)試驗(yàn)；3）

確證試驗(yàn)；4）遺傳標(biāo)記的檢測，進(jìn)行個(gè)人識(shí)別。

精斑的肉眼檢查：典型的精斑呈不規(guī)則地圖狀。可將檢材置于紫外光

下于暗處觀察。

精液斑的預(yù)試驗(yàn)

酸性磷酸酶實(shí)驗(yàn)

前列腺液含有大量的酸性磷酸酶，濃度為540?4000u/ml,較其他體

液、分泌液及臟器的含量高100倍以上。由于ACP來源于前列腺，故無精

子的精液ACP試驗(yàn)也呈陽性結(jié)果。

特點(diǎn)：1、精斑中的ACP相當(dāng)穩(wěn)定，對腐敗及高熱有較強(qiáng)的抵抗力；2、

靈敏度高（1/2萬倍），特異性不高；3、其他組織、分泌液中有ACP；部分

蔬菜、水果、某些避孕藥的ACP檢測液呈弱陽性反應(yīng)。磷酸苯二鈉試驗(yàn)

（King-King試法）

原理：精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二鈉，產(chǎn)生蔡酚，后者經(jīng)鐵

氟化鉀作用并與氨基安替比林結(jié)合，生成紅色醍類化合物。

檢材+緩沖液-37℃,30min-顯色液-深紅色+陽性，說明含有酸性磷酸

酶，可能是精斑；淡黃色

+陰性，說明檢材不是精斑或精斑酸性磷酸酶被破壞

所有的預(yù)試驗(yàn)中除酸性磷酸酶檢驗(yàn)外，其他各項(xiàng)試驗(yàn)靈敏度均不高,

因此精斑檢驗(yàn)和血痕檢驗(yàn)不同

精斑的確證實(shí)驗(yàn)

目的：檢驗(yàn)精液中特有的成分，陽性結(jié)果可以確證精斑。

方法：一、形態(tài)學(xué)檢查：精子的檢出二、免疫學(xué)檢驗(yàn)三、生化檢驗(yàn)

一、精子的檢出一染色法

1）檢材處理

檢材1.5cm義1.5cm,剪碎，置試管內(nèi)，加0.5mlNS浸漬，室溫2h后

4℃過夜；陳舊檢材：5-10%的氨液浸漬全部浸液置另一試管內(nèi)，2500

rpm離心5min；上清液一確證實(shí)驗(yàn)和中和試驗(yàn)；沉渣一涂片，染色，鏡

檢精子。

1、蘇木素-伊紅染色

涂片滴加95%酒精2min；80%酒精2min；50%酒精2min；水洗2min；

蘇木素染液5-10min；漂洗玻片數(shù)次；1%鹽酸酒精分化數(shù)秒；流水沖洗

20-30min；伊紅染色1.5min；漂洗數(shù)次；

滴加50%酒精后立即用95%酒精沖洗并保留10s；無水酒精5-lOs；

鏡檢。精子細(xì)胞核染蘭色，其它部分紅色。

2、酸性復(fù)紅染色

?滴加酸性復(fù)紅亞甲蘭染液5-10min；自來水沖洗2min；鏡檢精子頭

部的后半部即核呈蘭色，前半部不著色或是淺染，體及尾部染紅色。

3、酸性品紅靛蘭胭脂紅染色

?滴加酸性品紅靛蘭胭脂紅染液第一液30s；1%鹽酸沖洗；第二液染

色15s；鏡檢精子頭部呈深紫紅色，頸段呈白色，尾部主段和末端呈紫蘭

色

陰道拭子檢測精子影響因素

（1）取的時(shí)間越早越好（2）方法與部位有關(guān)

二、免疫學(xué)方法

1.抗人精血清沉淀反應(yīng)

結(jié)果判定：陽性：是人精斑；陰性：不是人精斑或者精斑已破壞。特

點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，特異性高；既可以精斑的確證，亦可用于種屬鑒定；

還用于確證輸精管結(jié)扎術(shù)者和精子缺乏癥患者。注意事項(xiàng)：設(shè)立陽性和

陰性對照

2.前列腺特異性抗原P30檢測（抗P30血清沉淀試驗(yàn)）

1）前列腺特異性抗原（PSA）,又稱丫-精漿蛋白，由人類前列腺上皮細(xì)

胞分泌，屬于糖蛋白，分子量30000,稱P30.含量豐富，性質(zhì)穩(wěn)定，是

確證精斑的理想標(biāo)記。

2）方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一直接斑點(diǎn)ELISA法；膠體金法酶聯(lián)免

疫吸附試驗(yàn)一直接斑點(diǎn)ELISA法

原理：固相載體上的P30抗原可與酶標(biāo)記的抗P30抗體反應(yīng)。陽性：

人精斑；陰性：不是人精斑或精斑已破壞；

特點(diǎn)：I：靈敏度高，簡便、快速；II：高度的種屬特異性與器官特異

性；III：無精子的精斑亦可為陽性；IV：P30性質(zhì)穩(wěn)定，檢出時(shí)間長。

注意事項(xiàng)：設(shè)立陽性和陰性對照

精斑的個(gè)人識(shí)別

目的：確定現(xiàn)場精斑是誰所留

方法：1.ABO血型測定和DNA檢驗(yàn)；2.血清型和酶型測定等。結(jié)果

判定：通常給予不排除結(jié)論，同時(shí)要結(jié)合案情。

一、ABO血型測定

1.中和實(shí)驗(yàn)：分泌型精斑2.ELISA法：非分泌型精斑3.DNA分型：

PCR-RFLP技術(shù)等

中和試驗(yàn)（Theneutralizationtest）是檢驗(yàn)各種分泌液斑跡的ABO血型

及分泌狀況。

原理：（凝集-抑制試驗(yàn)）精斑中的可溶性A、B、H抗原與相應(yīng)的已知

效價(jià)抗體結(jié)合，使其效價(jià)降低或完全消失，再加入相應(yīng)型別指示紅細(xì)胞后，

指示紅細(xì)胞不發(fā)生凝集，由此推斷精斑的血型。

①剪取待檢斑痕檢材，約lcm2。放入小試管中，加生理鹽水浸泡0.5ml,

充分?jǐn)嚢韬?，根?jù)檢材的陳舊程度浸泡2?12h。②浸出液用生理鹽水作

2-4稀釋，至32倍；③分別加4-8倍的抗A、抗B、抗H各2滴后，室溫

中和3