高中生物拓展課件：原生質(zhì)體的分離 高二上學期

原生質(zhì)體的分離，融合，培養(yǎng)及復壁

給我一個活的細胞，我可以創(chuàng)造一個生物世界！

FrancoisVincent,Raspail

新生嬰兒的細胞數(shù)目約為1012個；成年人的細胞數(shù)目約為2×1014個，約200種細胞。給出一個不是定義的定義---什么是細胞？

一切生命的關(guān)鍵問題都要到細胞中去尋找！Wilson

1.一切植物和動物都是由細胞組成－－施旺和施萊登

2.細胞是生命活動完整實施的基本單位。

上述兩項分別說明了生命個體與細胞的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系細胞

細胞是多層次非線性的復雜結(jié)構(gòu)體系

細胞具有高度復雜性和組織性

細胞是物質(zhì)（結(jié)構(gòu)）、能量與信息過程精巧結(jié)合的綜合體

細胞完成各種化學反應(yīng)

細胞需要和利用能量

細胞參與大量機械活動

細胞對刺激作出反應(yīng)

細胞是高度有序的，具有自組裝能力與自組織體系

細胞能進行自我調(diào)控

繁殖和傳留后代原生質(zhì)體定義

《辭海生物學分冊》定義原生質(zhì)：任何細胞和非細胞形態(tài)的生活物質(zhì)都是由具有相似的基本組成成分和特性的“原生質(zhì)”構(gòu)成。

原生質(zhì)體一詞來源于原生質(zhì)，即由質(zhì)膜包圍的裸露細胞，又稱原生質(zhì)球。植物細胞：脫去細胞壁、獲得的裸露細胞，即其原生質(zhì)體。動物細胞：一個動物細胞就是一小團原生質(zhì)體。暴露于5%NaCl溶液中的發(fā)生質(zhì)壁分離的植物細胞Sheenlab提取擬南芥原生質(zhì)體原生質(zhì)體作用

1、遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體：由于沒有細胞壁，原生質(zhì)體可相對容易攝取DNA，染色體，細胞器，病毒等外源遺傳物質(zhì)。2、開辟雜種新途徑：是獲得細胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料，還可通過誘導形成雜種細胞。3、定向培養(yǎng)：將純化后的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到適當條件下，使原生質(zhì)體適合于遺傳轉(zhuǎn)化、細胞融合、生理研究、體胚發(fā)生、器官發(fā)生等操作。原生質(zhì)體培養(yǎng)在植物快速繁殖、植物遠緣遺傳重組、轉(zhuǎn)基因以及品種改良和創(chuàng)造新品種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。人教版選修三實驗原理介紹1、材料的選擇和預(yù)處理2、原生質(zhì)體分離3、原生質(zhì)體純化4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素6、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法7、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素8、原生質(zhì)體融合再生過程

起始材料及生理狀態(tài)對原生質(zhì)體的制備和其活力有很大影響。葉片可以大量獲取并且能得到比較均一的原生質(zhì)體，為最佳材料。此外，花期短的花瓣、根尖、莖尖、嫩葉及對數(shù)生長期的愈傷組織也可作為實驗材料。

1、材料選擇和預(yù)處理

材料的預(yù)處理可以改變細胞的生理狀態(tài)，增加細胞膜的強度，達到提高分離的效率和減少原生質(zhì)體損傷等。如在酶解前預(yù)先質(zhì)壁分離處理，因為此時原生質(zhì)體收縮封閉了胞間連絲，避免了細胞內(nèi)容物的流失。

用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

☆龍膽試管苗的葉片用4℃處理較好。

☆甘蔗植株在黑暗下培養(yǎng)12h后分離的原生質(zhì)體才能分裂。

☆馬鈴薯試管苗葉片在黑暗下處理48h后分離原生質(zhì)體才能獲得高產(chǎn)量。

1、材料選擇和預(yù)處理

分離方法分為機械分離法和酶解分離法。

機械分離法：使細胞處于高滲溶液環(huán)境下，待其發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，磨碎組織，使原生質(zhì)體從傷口處流出。同時改變?nèi)芤簼舛?，使原生質(zhì)體復原。酶解分離法：植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，利用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶降解細胞壁成分，除去細胞壁，即可得到原生質(zhì)體。植物細胞壁組成：纖維素（35-50%），半纖維素（25-30%）木質(zhì)素（或果膠）（10-20%）2、原生質(zhì)體分離

原生質(zhì)體分離方法優(yōu)缺點比較2、原生質(zhì)體分離優(yōu)點缺點機械分離法

避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用獲得量較少；能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。（細胞較大，高度液泡化）酶解分離法操作簡單，獲得量大，適用廣泛商品酶制劑均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，會影響所獲原生質(zhì)體的活力優(yōu)缺點分離方法

原生質(zhì)體純化方法主要有離心沉淀法、漂浮法、界面法等，其原理都是利用原生質(zhì)體和雜質(zhì)比重不同而進行分層。沉降法利用比重原理，在一定的滲透壓溶液內(nèi)低速離心，使完整的原生質(zhì)體沉于試管底部。漂浮法用較原生質(zhì)體比重大的滲透壓較高的溶液，使原生質(zhì)體漂浮于溶液表面。界面法用兩種比重不同的溶液，使健康和完整的原生質(zhì)體處于兩液相的界面之中。3、原生質(zhì)體純化

形態(tài)識別：形態(tài)完整、富含細胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，可正常膨大。

FDA(熒光素二乙酸)染色法：FDA本身無極性，無熒光，可自由出入細胞。但在活細胞中經(jīng)過酯酶的催化，轉(zhuǎn)化為熒光素。熒光素是熒光極性物質(zhì)，不能自由出入細胞，在細胞內(nèi)積累，而死細胞則不產(chǎn)生熒光素，不發(fā)出熒光。

4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)

臺盼藍染色法：完整細胞膜的排斥，沒活力或者受損的細胞顯藍色，有活力的細胞不吸收染料為無色。CFW(酚藏花紅)染色法：紅色的為死的原生質(zhì)體，活的原生質(zhì)體不著色。觀察胞質(zhì)環(huán)流法：顯微鏡下觀察具有胞質(zhì)環(huán)流者為代謝旺盛的原生質(zhì)體。氧電極法：用氧電極檢測放氧速率來代表呼吸代謝，光合作用活力。原生質(zhì)體存活率＝活的原生質(zhì)體數(shù)/觀察的原生質(zhì)體總數(shù)

4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)

4、原生質(zhì)體活力測定和計數(shù)

產(chǎn)量測定一般用血球計數(shù)板法。讓滴出的原生質(zhì)懸液憑毛細管作用吸入計數(shù)室內(nèi)，剛好充滿計數(shù)室為宜(圖8－3)。靜置2min后計數(shù)，先用低倍鏡觀察，不均勻則拋棄。計數(shù)時用虹彩、集光器、反光鏡等調(diào)節(jié)入射光角度和強度，認清計數(shù)室位置。采用“由上至下，由左至右，順序如弓”的順序，對壓邊線細胞采取“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則(圖8～4)。（1）供試材料及預(yù)處理方法。根據(jù)不同材料的不同性質(zhì)，確定相應(yīng)的預(yù)處理方式。（2）離心條件：離心次數(shù)、離心速度、離心時間。5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素（3）

酶解條件：酶質(zhì)量

、組合、滲透壓、pH、濃度、光照和溫度、持續(xù)時間等。

酶解液最好現(xiàn)配現(xiàn)用。酶解時，針對不同的取材會相應(yīng)的添加一些其他酶或調(diào)整不同酶的濃度。如：分離根尖原生質(zhì)體時加入崩潰酶，分離愈傷組織時加上半纖維素酶，從花粉中分離原生質(zhì)體時加入蝸牛酶。5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素（3）

酶解條件：酶質(zhì)量、組合、滲透壓、pH、濃度、光照和溫度、持續(xù)時間等。

酶液的滲透壓必須與處理細胞的滲透壓相似。通常加入葡萄糖、甘露醇或者山梨醇等滲透劑調(diào)節(jié)。使用的濃度范圍因材料而異，一般0.35-0.8

mol/L，pH值為5.4-5.8。MES(嗎啉乙基磺酸)作為緩沖調(diào)節(jié)劑，可增加原生質(zhì)體的釋放量和原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。5、影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素6、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)直接于培養(yǎng)液中培養(yǎng)固體培養(yǎng)與低熔點瓊脂糖混合培養(yǎng)固液雙層培養(yǎng)淺層培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基之上看護培養(yǎng)淺層培養(yǎng)于含看護細胞的固體培養(yǎng)基之上瓊脂糖培養(yǎng)與瓊脂糖混合培養(yǎng)，混合液滴加于器皿底部，凝固后滴加液體培養(yǎng)基7、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素（1）植物基因型同一植物不同基因型的原生質(zhì)體脫分化與再分化所需要的條件不同，造成不同品種在相同條件下的再生能力也不盡相同。（2）原生質(zhì)體初植密度合理調(diào)整培養(yǎng)密度，過大，易形成競爭空間養(yǎng)分；過小影響植板率（3）滲透壓穩(wěn)定劑（4）培養(yǎng)基配方（5）培養(yǎng)條件7、影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素培養(yǎng)液里有無機物，有機物，激素，固化劑以及其它。無機物包括N,

P,

S,

K,Ca,

Mg(大量元素),Cu,Fe,Zn,B,Mn,Mo有機物包括碳源，維生素，氨基酸，有機酸，肌醇，天然復合物。激素包括生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸等。固化劑有瓊脂糖，瓊脂等。其它的包括抗生素等。注意：葡萄糖為首選碳源，培養(yǎng)基中要除去銨（對原生質(zhì)體存在有害），鐵、鋅也適當減少，鈣濃度要增加2-4倍，為了改善膜穩(wěn)定性。8、原生質(zhì)體融合再生過程

通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合或細胞雜交。

同核體：基因型相同的細胞融合成的雜交細胞

異核體：不同基因型的雜交細胞。8、原生質(zhì)體融合再生過程

根據(jù)是否人工誘導分為：自發(fā)融合和誘導融合自發(fā)融合率非常低，我們通常進行人工誘導。

誘導融合方法：物理方法（電擊融合法）化學方法（聚乙二醇（PEG）細胞融合）生物方法（仙臺病毒誘導細胞融合）人教版選修三電擊細胞融合法細胞電融合原理:（1）通過雙向電泳使細胞間的接觸變得非常緊密:采用了高頻交流電，誘導細胞去極化，引起細胞聚集，排列成串珠狀，互相緊密接觸;（2）然后給予短暫的高壓脈沖，引起細胞膜的穿透，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩個細胞融合逐步完成。為了穩(wěn)定這個過程，在短期內(nèi)需要施加交流電壓。（3）剛完成電融合的融合細胞可稱為異核體，盡管表面的細胞膜已經(jīng)發(fā)生了融合，細胞內(nèi)仍可以看到兩個或兩個以上的細胞核。隨后，細胞核也會在細胞內(nèi)部發(fā)生融合。8、原生質(zhì)體融合再生過程

聚乙二醇（PEG）細胞融合改良為PEG(聚乙二醇)高Ca2+高pH融合法。以PEG為融合劑的一種化學融合法，PEG與原生質(zhì)體膜結(jié)合后引起膜結(jié)構(gòu)紊亂，使得原生質(zhì)體互相聚集，在高Ca2+高pH條件下，原生質(zhì)體融合，完成融合過程。PEG在細胞融合中的作用：(1）促進細胞凝聚；（2）改變細胞膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處的磷脂分子層的脂類分子發(fā)生疏散和重組，引起細胞融合。8、原生質(zhì)體融合再生過程仙臺病毒誘導細胞融合：仙臺病毒屬于RNA病毒，直徑為50-600μm，其質(zhì)膜表面存在兩種糖蛋白：一種是HANA蛋白，它具有凝集紅細胞能力和神經(jīng)氨酸普酶活性；一種是F蛋白，它具有質(zhì)膜融合能力、細胞融合能力和溶血能力。HANA蛋白使病毒吸附于細胞表面，并水解表面糖蛋白，F(xiàn)蛋白使兩原生質(zhì)體融合。

8、原生質(zhì)體融合再生過程

經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)的植株再生一般經(jīng)過細胞壁再生，細胞分裂成細胞團、愈傷組織（或胚狀體）、植株再生這幾個過程。細胞壁再生：原生質(zhì)體在合適條件下（接種密度，碳源，激素以及光照等因素都影響其復壁率）短時間內(nèi)開始膨脹，葉綠體重排，并開始合成新的細胞壁，進而由球形變成橢圓形。在原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中，多數(shù)細胞能再生壁，但不同材料復壁的遲緩期差異很大。蠶豆10

min就開始復壁，煙草8-10

h復壁，小麥6-10

h復壁，水稻24

h復壁。利用細胞融合技術(shù)觀察蛋白質(zhì)運動

利用細胞融合技術(shù)觀察蛋白質(zhì)運動單克隆抗體的制備原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)原生質(zhì)體融合復壁具體實驗操作（1）植株培養(yǎng)將野生型本氏煙播種于培養(yǎng)基質(zhì)上，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(光/暗周期為16/8h,相對濕度80%,光照度6000lx)。

市場上購買的小青菜幼葉。（2）預(yù)處理去除小青菜與煙草葉背表皮；采用EP管管蓋打孔取葉片2片（或取生長狀態(tài)良好的葉片適量,切成0.5mm的細絲）,用預(yù)質(zhì)壁分離液(組成為0.4mol/L甘露醇和10mmol/L氯化鈣)分離1h。二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)（3）酶解加入10mL酶液(1%的纖維素酶R-10、0.25%的果膠酶、6.8

mM氯化鈣、0.4M甘露醇,

pH5.5)。28(或37)℃對材料進行14h靜置酶解。期間每半小時取出EP管，輕柔搖晃，促使酶液與材料充分接觸；（4）純化酶解結(jié)束后,依次用60目和100目的不銹鋼網(wǎng)篩過濾原生質(zhì)體溶液，濾去雜質(zhì),濾液分裝入2mLEP管,在600

r/min的條件下,離心5min,棄上清,沿管壁加入洗液（MS培養(yǎng)基）后繼續(xù)離心,如此重復1-3次，最后定容于0.5mL.。（沉降法）（5）計數(shù)

用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計算4個角上大格及中央大格(共5個大格)內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)，然后按公式計算原生質(zhì)體數(shù)，每個樣品計數(shù)6個重復，最后計算出每克鮮重材料游離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量。原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/g)=5個大格內(nèi)總原生質(zhì)體數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)÷葉片質(zhì)量(g)二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)（6)活力檢測

取一滴EP管中下層原生質(zhì)體溶液，置于光學顯微鏡下觀察。二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)二、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)撕去下表皮酶解前后10倍鏡下的原生質(zhì)體40倍鏡下的原生質(zhì)體三、原生質(zhì)體融合復壁

參考王金發(fā)等編撰的《細胞生物學實驗教程（第二版）》(1)取一干凈離心管，輕柔加入煙草原生質(zhì)體0.1ml，再沿管壁逐滴加入小青菜原生質(zhì)體0.1ml；

(2)靜置10-15min，使原生質(zhì)體貼于管底或管壁。(3)用吸管吸取PEG3350溶液，等體積（0.2ml）緩慢加于原生質(zhì)體液面上，靜置10—15min。在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體粘連情況。(4)用吸管向原生質(zhì)體液滴中慢慢加入高pH高鈣洗滌稀釋液3次，每次0.5mL，每次間隔5

min。(5)600rpm離心5min，棄上清，再緩慢加入2mL高pH高鈣洗滌稀釋液，5min后再次離心；。(6)

棄上清，用MS培養(yǎng)基如上換洗兩次，加入1mLMS培養(yǎng)基，蓋上管，置于26℃培養(yǎng)24h，再轉(zhuǎn)到弱光下培養(yǎng)。三、原生質(zhì)體融合復壁(7)觀察融合復壁過程。取一滴原生質(zhì)體懸浮液滴在載玻片上，用光學顯微鏡觀察。培養(yǎng)兩周后，可以發(fā)展成細胞團。這時應(yīng)該添加新鮮培養(yǎng)基，滲透壓減半。一般培養(yǎng)24h后可以觀察到再生細胞壁。三、原生質(zhì)體融合復壁

理論課加實驗課，理論課講解實驗原理知識。設(shè)置兩次實驗課。主要以體驗實驗過程，運用理論知識分析實驗結(jié)果為主。1、原生質(zhì)體的分離染色計數(shù)，在酶解等待時可以介紹廖嘉明等人所做實驗的實驗步驟。讓同學們和自己所做的實驗進行對比，對實驗結(jié)果形成原因進行分析和提出實驗改進。2、原生質(zhì)體融合復壁實驗關(guān)鍵是讓學生觀察復壁的過程，以及意識到分離純化原生質(zhì)體對該實驗的影響。四、課程安排五、幾種細胞融合的成功例子人教版選修三題目

（2015浙江寧波市鄞州中學測試）科學家以番茄（2N）和馬鈴薯（4N）為材料利用下圖技術(shù)得到“番茄-馬鈴薯”植株．請回答下列問題：（1）獲得a,b所選用的酶為

，c,d的名稱依次是，

。（2）圖示技術(shù)名稱是

；由d培育成植株的過程運用的技術(shù)手段是

，其依據(jù)的原理是。（3）過程稱為，所用的化學誘導劑一般是，過程成功的標志是。（4）過程④是，⑤過程增值的方式為。誘導f中植株生根過程中培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比較值較④過程

（高/低）；最終獲得的“番茄-馬鈴薯屬于”

倍體植株。

纖維素酶和果膠酶植物細胞全能性PEG(聚乙二醇)植物體細胞雜交技術(shù)原生質(zhì)體融合脫分化（形成新細胞壁）雜種細胞原生質(zhì)的培養(yǎng)雜種細胞再生細胞壁有絲分裂(正在融合的)原生質(zhì)體高六題目

（2017浙江臺州選考質(zhì)檢）某科研團隊利用植物細胞工程技術(shù)，把基因序列已知的抗除草劑（Bar）基因?qū)朐|(zhì)體獲得抗除草劑大豆。請回答下列相關(guān)問題：

(1)對于已獲得的Bar基因可以用

技術(shù)進行擴增。圖中的a過程通常使用相同的

酶和DNA連接酶，使目的基因與載體連接形成重組DNA。(2)在b過程中，獲得原生質(zhì)體除了需要纖維素酶和果膠酶，還需要用到的試劑是

。(3)成功導入重組DNA的原生質(zhì)體經(jīng)脫分化形成I

,進而生長發(fā)育成植株。下列不屬于Ⅰ細胞應(yīng)具有的特征是

。A.薄壁細胞B.細胞質(zhì)豐富C.液泡小D.細胞核小(4)若要判斷轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆是否成功，比較簡便的檢測方法是

。PCR

限制性核酸內(nèi)切適宜濃度的甘露醇愈傷組織D用一定濃度的除草劑噴灑，觀察轉(zhuǎn)基因大豆的生長情況參考文獻[1]彭邵鋒,陸佳,陳永忠,等.木本植物原生質(zhì)體培養(yǎng)體系研究進展[J].中國農(nóng)學通報,2013,29(1):1-6.[2]王莉,姚占軍.植物原生質(zhì)體的制備與活力檢測研究進展[J].生物技術(shù)通報,2009(s1):46-50.[3]梅興國,潘學武,董妍玲.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)方法[J].生物學通報,2001,36(7):14-15.[4]徐文錦,劉湘,寧勇.植物原生質(zhì)體融合技術(shù)的研究進展[J].中國農(nóng)學通報,2008,32(1):46-48.[5]李文安.第八講植物原生質(zhì)體培養(yǎng)[J].植物生理學報,1979(3):52-59.[6]張穎.唐菖蒲原生質(zhì)體分離、純化及培養(yǎng)的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學,2006.[7]李春艷,李妮亞,陳少良.植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合的研究進展[J].海南師范大學學報:自然科學版,2005,18(3):264-268.[8]LentzBR,LeeJK.Poly(e