公豬精液冷凍保存的研究進展

公豬精液冷凍保存的研究進展豬是我國畜牧業(yè)生產(chǎn)的主要品種F是肉類消費的主要來源之一，約總消費肉類的60%~80%。冷凍優(yōu)良種公豬精液對于充分發(fā)揮良種豬的遺傳品質(zhì)以及豬遺傳資源的保護均具有極其重要的應(yīng)用價值。目前為止，豬冷凍精液一直很難在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用，與牛、羊冷凍精液相比存在較大差距。我國豬種資源豐富，具有獨特的品質(zhì)，但卻面臨數(shù)量日趨減少的問題。因此，對地方瀕危遺傳資源進行保護已刻不容緩。精液冷凍保存是人工授精的一項重大變革，不但解決了精液長期保存的問題，有利于本地豬種的資源保護，而且還使精液不受時間、地域的限制，便于開展省際、國際之間的協(xié)作，提高了優(yōu)良種豬的利用率，同時極大地延長了種豬基因物質(zhì)的使用壽命，使優(yōu)良種豬在短期內(nèi)即可進行后裔測定，在保留和恢復(fù)精液供應(yīng)、血統(tǒng)更新、引種、降低生產(chǎn)成本等方面均有重要意義。一、公豬冷凍精液保存研究簡史1949年英國Polge等發(fā)現(xiàn)甘油（丙三醇）對牛精子具有抗凍保護作用，1956年開始應(yīng)用這個原理進行豬精子的冷凍操作，但在1950～1960期間的研究結(jié)果中，冷凍保存、解凍后的精子具有活力，但無法獲得受胎結(jié)果。雖然在1970之前有幾例豬的凍精成功受胎的報道，但其結(jié)果不能被重復(fù)。1970年開始，Polge等學(xué)者利用外科腹腔授精法將解凍后的精子直接注入輸卵管而獲得83%的受精卵，其后，世界各地相繼報道了以常規(guī)的子宮頸輸精并成功分娩的凍精技術(shù)試驗結(jié)果，終于闡明低溫保存后豬的精子仍具有受精的能力。從此，世界學(xué)者為了把豬的冷凍精液技術(shù)應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中作了許多努力，并對操作程序進行不斷優(yōu)化。迄今為止，人們?nèi)匝赜眉毠?、顆料及其改良型保存裝置進行豬精子的冷凍和保存。雖然凍精仍保持一定的受精能力，但產(chǎn)活仔數(shù)、受胎率等繁殖結(jié)果明顯低于液態(tài)保存精液。因此，采用長效、低成本、切合實際的液態(tài)保存精液技術(shù)得到了不斷的改進，可以部分解決國際間遺傳物質(zhì)的交流，受胎率也很接近自然交配結(jié)果。所以，即使凍精的繁殖效果與液態(tài)保存精液達到相似的程度，也不會取代液態(tài)保存精液技術(shù)的廣泛應(yīng)用地位。所以，豬冷凍精液技術(shù)在未來養(yǎng)豬業(yè)中的普遍應(yīng)用的價值仍存在不斷地爭議之處。二、豬冷凍精液技術(shù)的現(xiàn)實意義和局限性與豬的常規(guī)溫度（15℃～17℃）液態(tài)保存相比，豬的冷凍精液技術(shù)具有以下現(xiàn)實意義和局限性：1)由于凍精可以使優(yōu)良基因得到無限期的保存（如本地豬種資源保護），延長公豬使用年限，而不受該公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進展；2)使種豬選擇擴大到世界范圍的各群體進行成為可能，不受時間或地理位置差異的限制，引進國外高性能公豬凍精取代進行活體公豬，可節(jié)省外匯支出；3)有利于人工授精體系的完善，公豬冷凍精液可以在后裔測定或疾病檢測后才開始大量供應(yīng)，為穩(wěn)定的遺傳進展和嚴(yán)格的生物安全提供額外保障。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測提供了足夠的時間，凍精還為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時提供了穩(wěn)定的精液供應(yīng)保障。4)凍精沒有得到大面積的主要原因是繁殖成績不理想。與常規(guī)液態(tài)保存精液相比較，分娩率為40%～70%，低20%～30%，窩產(chǎn)仔數(shù)為7～10頭，少2～3頭。5)凍精的體外活力和解凍后受精能力在不同的種公豬個體之間存在很大的差異。6)液態(tài)保存精液每劑只需要20～30億精子數(shù)，而凍精每劑需要更多的精子，一般為50～60億。7)成本高，從工作量和實驗室設(shè)備考慮，冷凍和解凍是一個耗費資金的過程。8)需要可靠的實驗室設(shè)備以供準(zhǔn)確測試精液質(zhì)量，最大的問題是解決體外精子的活力與其實際的受精力、受胎效果的相關(guān)性。9)把握適時輸精的時機。凍精輸入母豬體內(nèi)后的理想受精時間比液態(tài)保存精液大大縮短了。因此，繼續(xù)改進豬精子的冷凍和解凍操作方案仍是養(yǎng)豬業(yè)面臨的一個課題。豬精子與其他家畜相比，有許多不同之處。它一次射精量大，采精后對外界溫度的突然改變相當(dāng)敏感（所謂的“冷休克”反應(yīng)）。冷凍精液技術(shù)的成功與否，關(guān)鍵在于對影響豬精子在冷凍和解凍過程中失去活力、保持受精能力等多因素的理解和監(jiān)控。這些因素包括外界因素、精子本身生物學(xué)特性、種公豬個體差異和每次采精的質(zhì)量差異。外界因素有稀釋液的組成成分、抗凍劑選擇及其濃度、稀釋比例和冷卻或緩沖速度、冷凍和解凍所采取的方法。遺憾的是我們只能通過改變外界因素來優(yōu)化冷凍精液操作過程和提高繁殖成績。為了適應(yīng)豬肉的高效、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)需要，全世界的種豬都在不斷地被更高遺傳水平的群體所更新，在一個國家或地區(qū)范圍內(nèi)，采用保存3～5天的液態(tài)精液或者活種豬進行遺傳物質(zhì)傳遞已經(jīng)足夠，但從我國幅員遼闊的地域、種豬的跨國家貿(mào)易和在遺傳交流時減少疾病傳播的角度考慮，豬的冷凍精液技術(shù)需求非常迫切。三、冷凍保存方式在一些早期研究中，豬的精子采用玻璃瓶或玻璃試管和較高濃度的甘油溶液進行冷凍保存。后來，牛的粒狀干冰方法被應(yīng)用到豬上，把甘油溶液濃度降到1-3%的范圍，可以執(zhí)行快速冷凍降溫操作。公豬精液采用5ml大容量保存,4-5ml鋁袋,0.5ml中型細管,0.25mL微型細管,和不同類型的5mL塑料袋。所有這些保存類型既有它的優(yōu)點又有它的缺點。顆粒和0.25、0.5mL小型細管有較大的表面積/容量比，是適合低溫冷凍保存的形狀。然而顆粒的冷凍精液較難進行不同頭份/來源的區(qū)別，容易造成交叉污染且不易解凍。1頭份一般需要解凍10-20根小型細管或2-3根扁平細管，這是造成普遍推廣應(yīng)用的首要障礙。5mL的大型細管具有1頭份的精子數(shù)量，但其表面積/容量比較小，限制了理想的冷凍和解凍過程。對塑料袋包裝的測試結(jié)果一直表明能均勻地冷凍和解凍，并含有1頭份精子數(shù)量，但其體積太大，不適合放置在液氮罐里保存，因此無法采用。雖然5mL大型細管保存精子解凍后活力略低，但在實踐中易于操作，比顆粒的使用更加廣泛,主要原因是不會引起交叉污染和在使用現(xiàn)場更方便解凍。一些學(xué)者證實：微型、小型、中型細管，扁平細管和塑料袋保存的凍精樣品經(jīng)解凍后，比大型細管在精子直線運動、頂體完整性、活力方面均表現(xiàn)得更加優(yōu)良。大型細管保存的精子活力低主要原因是位于細管中間的精子受冷不均勻，但從受精率考慮，活力并不是決定性因素，因為一些學(xué)者報道了大型、中型、扁平的大型細管保存的凍精受精率無明顯的差異。盡管資料顯示利用扁平細管或5ml塑料袋保存的凍精與大型細管相比有更高的受精力、輸卵管富余精子更多，但這些保存方法在生產(chǎn)實踐中均沒有被推廣使用。在目前的實踐應(yīng)用中，仍以傳統(tǒng)的顆?；蚣毠軆鼍珵榛A(chǔ)。四、冷凍與解凍速率冷凍過程中的精子細胞不但要對保存狀態(tài)的低溫有耐受能力，而且要能經(jīng)受從射精時機體溫度到保存時的超低溫度的變化而不過度降低活力，后者比前者更顯得重要。每種細胞都有它理想的冷凍與解凍速率要求，有兩條理論原則是：一、冷凍速率太慢時，要保存的細胞易受高濃度溶解液的影響而死亡或遭到破壞（稱溶解液效應(yīng)）；二、冷凍速率過快時，細胞內(nèi)液體易導(dǎo)致結(jié)冰現(xiàn)象；解凍時的原理恰好相反。理論上講，冷凍/冷卻速率快的情況下，解凍速率也相應(yīng)加快，其程度視不同類型細胞而略有差異。冷凍、解凍效果與稀釋液中的低溫冷凍保護劑有較大的關(guān)系。因為公豬精子對甘油（丙三醇）的濃度敏感，所以，通常采用低濃度的甘油溶液進行快速冷凍。為了保持精子活力和頂體的完整性，理想的冷凍速率推薦為：0.5ml細管采用30°C/分鐘,3%甘油濃度,或者0.25mL細管采用50℃/分鐘,1.5%甘油濃度。當(dāng)5ml大型細管在3.3%甘油濃度下冷凍時，為達到最佳的解凍效果，冷凍速度應(yīng)較慢，為16℃/分鐘。人工授精站在銷售凍精時一般會提供與其冷凍過程相對應(yīng)的解凍操作程序，但冷凍—解凍程序的優(yōu)化一直是國際學(xué)者不斷研究和更新的熱點。五、冷休克與冷凍緩沖時間Polge先生早在1956就已證實公豬精子在迅速冷卻時失去活力。這種現(xiàn)象尤其在發(fā)生在精液采集后迅速冷卻至15℃、以及至5℃和0℃，稱之為“冷休克”。在所有家畜中，公豬的精子對冷休克高度敏感，這可能是因為它特別的組成成分所致，主要是質(zhì)膜中的磷脂和膽固醇。公豬的精子在環(huán)境溫度下用低的稀釋倍數(shù)自然降溫或孵育1～5小時后能增強抗凍能力。基于此發(fā)現(xiàn)，大部分精液冷凍程序均包括一個15℃或六、受精能力與體外受精試驗利用冷凍精液的受胎率低于鮮精和液態(tài)保存精液，原因是經(jīng)冷凍解凍過程后的精子活力降低，能保持受精能力的有效精子濃度也明顯下降(Watson2000)，因為后者，即使輸入與新鮮精液同等數(shù)量的活精子也不能獲得相同的母豬受胎率。精子經(jīng)受冷卻、冷凍和解凍過程后，導(dǎo)致它在母豬生殖道的獲能存活時間大大縮短。冷凍精液的理想受精時間往往在母豬排卵前的4～6小時范圍內(nèi)，而液態(tài)保存精液可以在母豬排卵前12～28小時范圍保持受精能力，時間范圍還因不同的母豬個體而異。精子本身在保持受精能力時必須具備一定的內(nèi)在特性、特征，因此，為了有效地監(jiān)控解凍后活精子的有效性，冷凍程序的評價一般包括對一些精子特征的評估，如運動性、活力和頂體形態(tài)。然而，豬的體外精子質(zhì)量參數(shù)評定與現(xiàn)場母豬受胎結(jié)果相關(guān)性卻不高。這一點并不奇怪，因為受胎是一個極其復(fù)雜的過程，包括能夠達到輸卵管的精子數(shù)量和與卵子結(jié)合的能力，甚至對輸精后形成的精子庫的所有精子特性都應(yīng)進行研究。七、討論全球都在研究如何將冷凍精液和新鮮精液的差距拉近，也許在不久的將來這可以成為現(xiàn)實。雖然制作冷凍精液的過程對豬精子的損傷很大，加上精子對冷休克的敏感性亦極高，在冷凍過程中不但損傷精子，而且對活存的精子壽