公豬精液冷凍保存的研究進(jìn)展

公豬精液冷凍保存的研究進(jìn)展豬是我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)的主要品種F是肉類(lèi)消費(fèi)的主要來(lái)源之一，約總消費(fèi)肉類(lèi)的60%~80%。冷凍優(yōu)良種公豬精液對(duì)于充分發(fā)揮良種豬的遺傳品質(zhì)以及豬遺傳資源的保護(hù)均具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。目前為止，豬冷凍精液一直很難在生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用，與牛、羊冷凍精液相比存在較大差距。我國(guó)豬種資源豐富，具有獨(dú)特的品質(zhì)，但卻面臨數(shù)量日趨減少的問(wèn)題。因此，對(duì)地方瀕危遺傳資源進(jìn)行保護(hù)已刻不容緩。精液冷凍保存是人工授精的一項(xiàng)重大變革，不但解決了精液長(zhǎng)期保存的問(wèn)題，有利于本地豬種的資源保護(hù)，而且還使精液不受時(shí)間、地域的限制，便于開(kāi)展省際、國(guó)際之間的協(xié)作，提高了優(yōu)良種豬的利用率，同時(shí)極大地延長(zhǎng)了種豬基因物質(zhì)的使用壽命，使優(yōu)良種豬在短期內(nèi)即可進(jìn)行后裔測(cè)定，在保留和恢復(fù)精液供應(yīng)、血統(tǒng)更新、引種、降低生產(chǎn)成本等方面均有重要意義。一、公豬冷凍精液保存研究簡(jiǎn)史1949年英國(guó)Polge等發(fā)現(xiàn)甘油（丙三醇）對(duì)牛精子具有抗凍保護(hù)作用，1956年開(kāi)始應(yīng)用這個(gè)原理進(jìn)行豬精子的冷凍操作，但在1950～1960期間的研究結(jié)果中，冷凍保存、解凍后的精子具有活力，但無(wú)法獲得受胎結(jié)果。雖然在1970之前有幾例豬的凍精成功受胎的報(bào)道，但其結(jié)果不能被重復(fù)。1970年開(kāi)始，Polge等學(xué)者利用外科腹腔授精法將解凍后的精子直接注入輸卵管而獲得83%的受精卵，其后，世界各地相繼報(bào)道了以常規(guī)的子宮頸輸精并成功分娩的凍精技術(shù)試驗(yàn)結(jié)果，終于闡明低溫保存后豬的精子仍具有受精的能力。從此，世界學(xué)者為了把豬的冷凍精液技術(shù)應(yīng)用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)踐中作了許多努力，并對(duì)操作程序進(jìn)行不斷優(yōu)化。迄今為止，人們?nèi)匝赜眉?xì)管、顆料及其改良型保存裝置進(jìn)行豬精子的冷凍和保存。雖然凍精仍保持一定的受精能力，但產(chǎn)活仔數(shù)、受胎率等繁殖結(jié)果明顯低于液態(tài)保存精液。因此，采用長(zhǎng)效、低成本、切合實(shí)際的液態(tài)保存精液技術(shù)得到了不斷的改進(jìn)，可以部分解決國(guó)際間遺傳物質(zhì)的交流，受胎率也很接近自然交配結(jié)果。所以，即使凍精的繁殖效果與液態(tài)保存精液達(dá)到相似的程度，也不會(huì)取代液態(tài)保存精液技術(shù)的廣泛應(yīng)用地位。所以，豬冷凍精液技術(shù)在未來(lái)養(yǎng)豬業(yè)中的普遍應(yīng)用的價(jià)值仍存在不斷地爭(zhēng)議之處。二、豬冷凍精液技術(shù)的現(xiàn)實(shí)意義和局限性與豬的常規(guī)溫度（15℃～17℃）液態(tài)保存相比，豬的冷凍精液技術(shù)具有以下現(xiàn)實(shí)意義和局限性：1)由于凍精可以使優(yōu)良基因得到無(wú)限期的保存（如本地豬種資源保護(hù)），延長(zhǎng)公豬使用年限，而不受該公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進(jìn)展；2)使種豬選擇擴(kuò)大到世界范圍的各群體進(jìn)行成為可能，不受時(shí)間或地理位置差異的限制，引進(jìn)國(guó)外高性能公豬凍精取代進(jìn)行活體公豬，可節(jié)省外匯支出；3)有利于人工授精體系的完善，公豬冷凍精液可以在后裔測(cè)定或疾病檢測(cè)后才開(kāi)始大量供應(yīng)，為穩(wěn)定的遺傳進(jìn)展和嚴(yán)格的生物安全提供額外保障。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測(cè)提供了足夠的時(shí)間，凍精還為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時(shí)提供了穩(wěn)定的精液供應(yīng)保障。4)凍精沒(méi)有得到大面積的主要原因是繁殖成績(jī)不理想。與常規(guī)液態(tài)保存精液相比較，分娩率為40%～70%，低20%～30%，窩產(chǎn)仔數(shù)為7～10頭，少2～3頭。5)凍精的體外活力和解凍后受精能力在不同的種公豬個(gè)體之間存在很大的差異。6)液態(tài)保存精液每劑只需要20～30億精子數(shù)，而凍精每劑需要更多的精子，一般為50～60億。7)成本高，從工作量和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備考慮，冷凍和解凍是一個(gè)耗費(fèi)資金的過(guò)程。8)需要可靠的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備以供準(zhǔn)確測(cè)試精液質(zhì)量，最大的問(wèn)題是解決體外精子的活力與其實(shí)際的受精力、受胎效果的相關(guān)性。9)把握適時(shí)輸精的時(shí)機(jī)。凍精輸入母豬體內(nèi)后的理想受精時(shí)間比液態(tài)保存精液大大縮短了。因此，繼續(xù)改進(jìn)豬精子的冷凍和解凍操作方案仍是養(yǎng)豬業(yè)面臨的一個(gè)課題。豬精子與其他家畜相比，有許多不同之處。它一次射精量大，采精后對(duì)外界溫度的突然改變相當(dāng)敏感（所謂的“冷休克”反應(yīng)）。冷凍精液技術(shù)的成功與否，關(guān)鍵在于對(duì)影響豬精子在冷凍和解凍過(guò)程中失去活力、保持受精能力等多因素的理解和監(jiān)控。這些因素包括外界因素、精子本身生物學(xué)特性、種公豬個(gè)體差異和每次采精的質(zhì)量差異。外界因素有稀釋液的組成成分、抗凍劑選擇及其濃度、稀釋比例和冷卻或緩沖速度、冷凍和解凍所采取的方法。遺憾的是我們只能通過(guò)改變外界因素來(lái)優(yōu)化冷凍精液操作過(guò)程和提高繁殖成績(jī)。為了適應(yīng)豬肉的高效、優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)需要，全世界的種豬都在不斷地被更高遺傳水平的群體所更新，在一個(gè)國(guó)家或地區(qū)范圍內(nèi)，采用保存3～5天的液態(tài)精液或者活種豬進(jìn)行遺傳物質(zhì)傳遞已經(jīng)足夠，但從我國(guó)幅員遼闊的地域、種豬的跨國(guó)家貿(mào)易和在遺傳交流時(shí)減少疾病傳播的角度考慮，豬的冷凍精液技術(shù)需求非常迫切。三、冷凍保存方式在一些早期研究中，豬的精子采用玻璃瓶或玻璃試管和較高濃度的甘油溶液進(jìn)行冷凍保存。后來(lái)，牛的粒狀干冰方法被應(yīng)用到豬上，把甘油溶液濃度降到1-3%的范圍，可以執(zhí)行快速冷凍降溫操作。公豬精液采用5ml大容量保存,4-5ml鋁袋,0.5ml中型細(xì)管,0.25mL微型細(xì)管,和不同類(lèi)型的5mL塑料袋。所有這些保存類(lèi)型既有它的優(yōu)點(diǎn)又有它的缺點(diǎn)。顆粒和0.25、0.5mL小型細(xì)管有較大的表面積/容量比，是適合低溫冷凍保存的形狀。然而顆粒的冷凍精液較難進(jìn)行不同頭份/來(lái)源的區(qū)別，容易造成交叉污染且不易解凍。1頭份一般需要解凍10-20根小型細(xì)管或2-3根扁平細(xì)管，這是造成普遍推廣應(yīng)用的首要障礙。5mL的大型細(xì)管具有1頭份的精子數(shù)量，但其表面積/容量比較小，限制了理想的冷凍和解凍過(guò)程。對(duì)塑料袋包裝的測(cè)試結(jié)果一直表明能均勻地冷凍和解凍，并含有1頭份精子數(shù)量，但其體積太大，不適合放置在液氮罐里保存，因此無(wú)法采用。雖然5mL大型細(xì)管保存精子解凍后活力略低，但在實(shí)踐中易于操作，比顆粒的使用更加廣泛,主要原因是不會(huì)引起交叉污染和在使用現(xiàn)場(chǎng)更方便解凍。一些學(xué)者證實(shí)：微型、小型、中型細(xì)管，扁平細(xì)管和塑料袋保存的凍精樣品經(jīng)解凍后，比大型細(xì)管在精子直線(xiàn)運(yùn)動(dòng)、頂體完整性、活力方面均表現(xiàn)得更加優(yōu)良。大型細(xì)管保存的精子活力低主要原因是位于細(xì)管中間的精子受冷不均勻，但從受精率考慮，活力并不是決定性因素，因?yàn)橐恍W(xué)者報(bào)道了大型、中型、扁平的大型細(xì)管保存的凍精受精率無(wú)明顯的差異。盡管資料顯示利用扁平細(xì)管或5ml塑料袋保存的凍精與大型細(xì)管相比有更高的受精力、輸卵管富余精子更多，但這些保存方法在生產(chǎn)實(shí)踐中均沒(méi)有被推廣使用。在目前的實(shí)踐應(yīng)用中，仍以傳統(tǒng)的顆?；蚣?xì)管凍精為基礎(chǔ)。四、冷凍與解凍速率冷凍過(guò)程中的精子細(xì)胞不但要對(duì)保存狀態(tài)的低溫有耐受能力，而且要能經(jīng)受從射精時(shí)機(jī)體溫度到保存時(shí)的超低溫度的變化而不過(guò)度降低活力，后者比前者更顯得重要。每種細(xì)胞都有它理想的冷凍與解凍速率要求，有兩條理論原則是：一、冷凍速率太慢時(shí)，要保存的細(xì)胞易受高濃度溶解液的影響而死亡或遭到破壞（稱(chēng)溶解液效應(yīng)）；二、冷凍速率過(guò)快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液體易導(dǎo)致結(jié)冰現(xiàn)象；解凍時(shí)的原理恰好相反。理論上講，冷凍/冷卻速率快的情況下，解凍速率也相應(yīng)加快，其程度視不同類(lèi)型細(xì)胞而略有差異。冷凍、解凍效果與稀釋液中的低溫冷凍保護(hù)劑有較大的關(guān)系。因?yàn)楣i精子對(duì)甘油（丙三醇）的濃度敏感，所以，通常采用低濃度的甘油溶液進(jìn)行快速冷凍。為了保持精子活力和頂體的完整性，理想的冷凍速率推薦為：0.5ml細(xì)管采用30°C/分鐘,3%甘油濃度,或者0.25mL細(xì)管采用50℃/分鐘,1.5%甘油濃度。當(dāng)5ml大型細(xì)管在3.3%甘油濃度下冷凍時(shí)，為達(dá)到最佳的解凍效果，冷凍速度應(yīng)較慢，為16℃/分鐘。人工授精站在銷(xiāo)售凍精時(shí)一般會(huì)提供與其冷凍過(guò)程相對(duì)應(yīng)的解凍操作程序，但冷凍—解凍程序的優(yōu)化一直是國(guó)際學(xué)者不斷研究和更新的熱點(diǎn)。五、冷休克與冷凍緩沖時(shí)間Polge先生早在1956就已證實(shí)公豬精子在迅速冷卻時(shí)失去活力。這種現(xiàn)象尤其在發(fā)生在精液采集后迅速冷卻至15℃、以及至5℃和0℃，稱(chēng)之為“冷休克”。在所有家畜中，公豬的精子對(duì)冷休克高度敏感，這可能是因?yàn)樗貏e的組成成分所致，主要是質(zhì)膜中的磷脂和膽固醇。公豬的精子在環(huán)境溫度下用低的稀釋倍數(shù)自然降溫或孵育1～5小時(shí)后能增強(qiáng)抗凍能力?；诖税l(fā)現(xiàn)，大部分精液冷凍程序均包括一個(gè)15℃或六、受精能力與體外受精試驗(yàn)利用冷凍精液的受胎率低于鮮精和液態(tài)保存精液，原因是經(jīng)冷凍解凍過(guò)程后的精子活力降低，能保持受精能力的有效精子濃度也明顯下降(Watson2000)，因?yàn)楹笳?，即使輸入與新鮮精液同等數(shù)量的活精子也不能獲得相同的母豬受胎率。精子經(jīng)受冷卻、冷凍和解凍過(guò)程后，導(dǎo)致它在母豬生殖道的獲能存活時(shí)間大大縮短。冷凍精液的理想受精時(shí)間往往在母豬排卵前的4～6小時(shí)范圍內(nèi)，而液態(tài)保存精液可以在母豬排卵前12～28小時(shí)范圍保持受精能力，時(shí)間范圍還因不同的母豬個(gè)體而異。精子本身在保持受精能力時(shí)必須具備一定的內(nèi)在特性、特征，因此，為了有效地監(jiān)控解凍后活精子的有效性，冷凍程序的評(píng)價(jià)一般包括對(duì)一些精子特征的評(píng)估，如運(yùn)動(dòng)性、活力和頂體形態(tài)。然而，豬的體外精子質(zhì)量參數(shù)評(píng)定與現(xiàn)場(chǎng)母豬受胎結(jié)果相關(guān)性卻不高。這一點(diǎn)并不奇怪，因?yàn)槭芴ナ且粋€(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，包括能夠達(dá)到輸卵管的精子數(shù)量和與卵子結(jié)合的能力，甚至對(duì)輸精后形成的精子庫(kù)的所有精子特性都應(yīng)進(jìn)行研究。七、討論全球都在研究如何將冷凍精液和新鮮精液的差距拉近，也許在不久的將來(lái)這可以成為現(xiàn)實(shí)。雖然制作冷凍精液的過(guò)程對(duì)豬精子的損傷很大，加上精子對(duì)冷休克的敏感性亦極高，在冷凍過(guò)程中不但損傷精子，而且對(duì)活存的精子壽