層析技術(shù)的應(yīng)用

層析技術(shù)的應(yīng)用一、層析技術(shù)的原理和分類（一）層析技術(shù)的原理層析法是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。本世紀(jì)初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。現(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個相組成：一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；另一是流動相，即可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒。當(dāng)待分離的混合物隨溶媒（流動相）通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨溶媒向前移動，各組份不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達到將各組份分離的目的。（二）層析法分類見表16-5～7（三）層析法的特點與應(yīng)用表16-5按兩相所處狀態(tài)分類流動相液體氣體液體液-液層析法氣-液層析法固定相固體液-固層析法氣-固層析法層析法是根據(jù)物質(zhì)的理化性質(zhì)不同而建立的分離分析方法。根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量。層析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時繪出層析圖。層析儀與電子計算機聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動化，大大縮短分析時間。由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點，因此適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。近年來，已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)常用的分析方法。在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境化學(xué)、高分子材料、石油化工等方面也得到了廣泛的應(yīng)用。表16-6按層析原理分類名稱分離原理吸附層析法組份在吸附劑表面吸附固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離表16-7按操作形式不同分類名稱操作形式柱層析法固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達分離薄層層析法將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份分離紙層析法用濾紙作液體的載體，點樣后用流動相展開，使各組份分離薄膜層析法將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進行物質(zhì)的分離⑷高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時水分和低分子量的物質(zhì)就會進入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液。（二）離子交換層析法離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質(zhì)作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的一種方法。⒈離子交換劑預(yù)處理和裝柱對于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對于陽離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6。兩個容器放于同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當(dāng)A1＝A2時為線性梯度，當(dāng)A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。洗脫時應(yīng)滿足以下要求：①洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區(qū)帶在快到柱末端時達到解吸狀態(tài)。目的物的過早解吸，會引起區(qū)帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。圖16-6梯度洗脫示意圖⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗?zāi)康牡牟煌?，可采用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學(xué)測定等）確定圖譜中目的物的位置，并回收目的物。⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/lNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/lNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產(chǎn)品建立用0.02％疊氮鈉。⒌離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析技術(shù)已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域。在生物化學(xué)及臨床生化檢驗中主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)，也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。（三）高效液相層析法高效液相層析法（HPLC）是近二十年來發(fā)展起來的一項新穎快速的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進了氣相層析的理論具有氣相層析的全部優(yōu)點。由于HPLC分離能力強、測定靈敏度高，可在室溫下進行，應(yīng)用范圍極廣，無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物均可用此法測定。對蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等尤為有利。高效液相層析法的基本概念和分離理論與經(jīng)典的液相色譜法及氣相色譜法一致，因而其塔板理論及動力學(xué)理論等都可用于高效液相層析。⒈高效液相層析儀典型的高效液相層析儀包括輸液系統(tǒng)、層析柱與檢測系統(tǒng)三部分。流動相用一高壓泵輸入。這種高壓泵應(yīng)滿足以下條件：①流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍。②能抗溶劑腐蝕。③有較高的輸出壓力，一般要達到15～300kg/c，也有的高達800kg/c。④泵的死體積要小。梯度洗脫裝置必須具備兩臺高壓泵，一臺輸送強溶劑，一臺輸送弱溶劑，兩泵運轉(zhuǎn)速度用電腦控制，并可按一定的要求改變流動相的組成，以改善分離效果。一般用微量注射器直接進樣，也可采用六通閥門進樣。HPLC中所用的檢測器最多應(yīng)用的是紫外吸收檢測，靈敏度可達ng水平。此外，還有熒光檢測器、示差析光檢測器、電化學(xué)檢測器等。⒉HPLC的類型與應(yīng)用⑴液-固吸附層析：固定相是具有吸附活性的吸附劑，常用的有硅膠、氧化鋁、高分子有機酸或聚酰胺凝膠等。液-固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調(diào)節(jié)試樣組份的滯留時間長短，并對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。流動相中底劑與洗脫劑成分的組合和選擇，直接影響色譜的分離情況，一般底劑為極性較低的溶劑，如正已烷、環(huán)已烷、戊烷、石油醚等，洗脫劑則根據(jù)試樣性質(zhì)選用針對性溶劑，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分離異構(gòu)體、抗氧化劑與維生素等。⑵液-液分配層析：固定相為單體固定液構(gòu)成。將固定液的官能團結(jié)合在薄殼或多孔型硅膠上，經(jīng)酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。這種以化學(xué)鍵合相為固定相的液-液層析稱為化學(xué)鍵合相層析。另一種利用離子對原理的液-液分配層析為離子對層析。化學(xué)鍵合層析分：①極性鍵合相層析：固定相為極性基團，氰基、氨基及雙羥基三種。流動相為非極性或極性較小的溶劑。極性小的組份先出峰，極性大的后出峰，這稱為正相層析法，適用于分離極性化合物。②非極性鍵合相層析：固定相為非極性基團，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動相用強極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機鹽緩沖液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑，水不僅起洗脫作用還可掩蓋載體表面的硅羥基，防止因吸附而至的拖尾現(xiàn)象。極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。本法適用于小分子物質(zhì)的分離，如肽、核苷酸、糖類、氨基酸的衍生物等。離子對分配層析分：①正相離子對層析：此法常以水吸附在硅膠上作為固定相，把與分離組份帶相反電荷的配對離子以一定濃度溶于水或緩沖液涂漬在硅膠上。流動相為極性較低的有機溶劑。在層析過程中，待分離的離子與水相中配對離子形成中性離子對，在水相和有機相中進行分配，而達到分離。本法優(yōu)點是流動相選擇余地大，缺點是固定相易流失。②反向離子對層析：固定相是疏水性鍵合硅膠，如C18鍵合相，待分離離子和帶相反電荷的配對離子同時存在于強極性的流動相中，生成的中性離子對在流動相和鍵合相之間進行分配，而得到分離。本法優(yōu)點是固定相不存在流失問題、流動相含水或緩沖液更適用于電離性化合物的分離。⑶離子交換層析：原理與普通離子交換相同。在離子交換HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。流動相主要是水溶液，pH值最好在被分離酸、堿的pK值附近。（四）親和層析法親和層析是利用待分離物質(zhì)和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的的一類特殊層析技術(shù)。具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNA與互補DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結(jié)合蛋白、糖蛋白與它相應(yīng)的植物凝集素等?？捎H和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當(dāng)含有混合組份的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出，然后改變流動組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質(zhì)，與基質(zhì)共價連接的化合物稱配基。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。親和層析可用于純化生物大分子：稀溶液的濃縮；不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補配體的生物大分子；分離核酸是親和層析應(yīng)用的一個重要方面。應(yīng)用實例：2-胰凝乳蛋白酶的提純⒈親和吸附劑（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制備取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr。攪拌混合物，滴加2-8mol/lNaOH，使溶液pH維持在11.0。20℃左右，8-12分鐘完成反應(yīng)。在布氏漏斗中抽濾活化的瓊脂糖，然后用20倍體積冷的0.1mol/lNaHCO3（pH9.0）溶液洗滌。將上述活化的Sepharose4B與等體積0.1mol/lNaHCO3（pH9.0并在冰箱中預(yù)冷）溶液混合，接著迅速加入α-胰蛋白酶抑制劑（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose4B65μmol/L。4℃緩慢攪拌約24小時，而后再用水和緩沖液反復(fù)地洗至沒有游離的抑制劑為止。制得的親和吸附劑在50mmol/lTris-HCl緩沖液（pH8.0）中保存?zhèn)溆谩＂卜蛛x親和吸附劑裝柱后用50mmol/LTris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡（室溫）。樣品溶于同樣緩沖液中并上柱，再應(yīng)用同樣緩沖液淋洗柱子。流速為30-60ml/小時，直至280nm無光吸收時停止洗滌，然后改用0.2mol/L醋酸緩沖液（pH3.0）洗脫。（五）聚焦層析法聚焦層析是一種操作簡單、廉價的層析技術(shù)。它的原理是根據(jù)各種蛋白質(zhì)的等電點不同進行分離的過程，因此本方法具有高分辨、高度濃縮和高度專一等特點。聚焦層析所用的凝膠首先用高pH溶液平衡，然后用多元緩沖液進行洗脫，多元緩沖液pH呈梯度下降。聚焦層析所用凝膠主要有兩種：MONOP和多元緩沖液交換劑（PBE）。其中MONOP是帶孔小珠，孔中被帶正電荷的胺基填充，適用于高效聚焦層析。多元緩沖液交換劑是一種交換凝膠，適用作普通聚焦層析的介質(zhì)。各種凝膠性質(zhì)見表16-8。表16-8聚焦層析技術(shù)數(shù)據(jù)凝膠名