熊源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法

1熊源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法本文件規(guī)定了動(dòng)物源性產(chǎn)品中熊源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本文件適用于動(dòng)物源性產(chǎn)品（肉制品、皮毛類產(chǎn)品、飼料等）中熊源性成分的鑒定，靈敏度為0.01ng/μL。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國(guó)家文件食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB/T5009.1食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。3.1CTAB十六烷基三甲基溴化銨3.2EDTA乙二胺四乙酸實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)三氨基甲烷4設(shè)備4.1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)。4.2高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速12000rpm以上）。24.3離心機(jī)。4.4旋渦振蕩器。4.5單孔道微量移液器和槍頭：0.5μL～10μL、10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。4.6EP離心管。4.7刻度量筒：100mL，500mL，1000mL。4.8試劑瓶和洗滌瓶：500mL。4.9天平。5試劑與材料5.1水：符合GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室二級(jí)水規(guī)格。5.2試劑盒：按說(shuō)明書(shū)使用試劑盒提供的相應(yīng)試劑。5.3自備的試劑：CTAB提取緩沖液（十六烷基三甲基溴化銨CTAB-沉淀液，蛋白酶K（1.2mol/L）氯化鈉。5.4實(shí)時(shí)熒光預(yù)混液。5.5引物對(duì)序列-上游：5’-CTCAGGAATAATTCTACTAACA-3’-下游：5’-GAGCGATTGAAGAGTATG-3’-探針序列：5’-FAM-TCGCACCTCTATCCGTCCTATATCA-TAMRA-3’5.6質(zhì)控物質(zhì)5.6.1陽(yáng)性對(duì)照樣品：采用已知含有熊源性成分的樣品或經(jīng)測(cè)序確認(rèn)的陽(yáng)性質(zhì)粒。5.6.2陰性對(duì)照樣品：采用已知不含有熊源性成分的樣品。5.6.3空白對(duì)照：采用與模板等體積的雙蒸水。6實(shí)驗(yàn)方法6.1樣品的選取與制備動(dòng)物源性食品按照GB/T5009.1和GB4789.1采樣。將實(shí)驗(yàn)室樣品研磨待用。6.2樣品DNA的提取3參照附錄A中方法提取樣品基因組DNA，也可采用商品化的組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。當(dāng)A260/A280比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。除檢測(cè)樣品外，需要設(shè)立陰性、陽(yáng)性及空白對(duì)照。6.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)6.3.1反應(yīng)體系反應(yīng)體系體積為25μL，體系組成見(jiàn)表1。表1熊源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的反應(yīng)體系試劑名稱貯備液濃度μmol/L反應(yīng)體系體積—111—2—6.3.2反應(yīng)條件預(yù)變性：95℃,3min；變性：95℃,15s收集熒光信號(hào)值。6.3.3檢測(cè)過(guò)程分別設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。7結(jié)果判定與表述7.1質(zhì)量控制7.1.1一般要求實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的各種對(duì)照PCR檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合以下情況。否則，任一種對(duì)照如果出現(xiàn)非下述正常結(jié)果，應(yīng)重做試驗(yàn)。7.1.2核酸提取空白對(duì)照和PCR擴(kuò)增試劑空白對(duì)照檢測(cè)結(jié)果Ct≥40.07.1.3PCR擴(kuò)增陰性目標(biāo)DNA對(duì)照檢測(cè)結(jié)果Ct≥40.07.1.4PCR擴(kuò)增陽(yáng)性目標(biāo)DNA對(duì)照4檢測(cè)結(jié)果Ct≤35.07.2結(jié)果判斷和報(bào)告7.2.1樣品2個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果Ct≥40.0，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品結(jié)果為陰性，報(bào)告未檢出熊源性成分。7.2.2樣品至少1個(gè)平行樣檢測(cè)結(jié)果35.0﹤Ct﹤40.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加DNA模板量重做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。再次檢測(cè)結(jié)果仍然Ct﹤40.0并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品檢出熊源性成分，報(bào)告檢出熊源性成分；再次檢測(cè)結(jié)果仍然Ct≥40.0同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品未檢出熊源性成分，報(bào)告未檢出熊源性成分。7.2.3樣品2個(gè)平行樣品檢測(cè)結(jié)果Ct≤35.0并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)各種試驗(yàn)對(duì)照結(jié)果正常，可以判斷樣品檢出熊源性成分，報(bào)告檢出熊源性成分。8防止交叉污染措施按照GB/T19495.2防止檢測(cè)過(guò)程中交叉污染。5樣品DNA的提取及溶液配制A.1CTAB-提取緩沖液將5gCTAB，20.45gNaCL，3.03gTris，1.86gNa2-EDTA溶于200mL水中，用鹽酸調(diào)pH8.0后，定容至250mL，115℃高壓15min。A.2CTAB-沉淀液稱0.2gCTAB，0.234gNaCL，定容至100mL，115℃高壓15min。A.3蛋白酶K按試劑說(shuō)明配制。A.41.2mol/LNaCL溶液稱取28gNaCL，定容至400mL，115℃高壓15min。A.5DNA提取方法A.5.1稱取樣品0.5g～1g加入1.5mL～3.5mLCTAB提取液中，再加入12μL～20μL蛋白酶K（根據(jù)CTAB量調(diào)節(jié)），每個(gè)樣品提取2管，同時(shí)用水做空白對(duì)照?；靹蚝?5℃至少1h(過(guò)夜孵育最好)，如樣品膨脹，則可再多加CTAB，每次多1mL，最多10mL。A.5.2低溫4000rpm～5000rpm離心10min。A.5.3將上清（約1mL）加入無(wú)菌EP中（2mL管），加入700μL氯仿，旋渦30s后，再12000rpm離心10min。A.5.4取上清600μL～650μL加入無(wú)菌EP中，加入2倍體積的CTAB沉淀液，旋渦混勻，室溫靜置1min。A.5.512000rpm離心10min，去上清。沉淀溶解于350μL的1.2mol/LNaCL溶液。（2管合并共用350μL溶液）。A.5.6加入350μL氯仿，渦旋30s，再12000rpm離心10min。A.5.7取上清液至無(wú)菌EP管中（確定體積加入0.8倍體積的異丙醇，手搖混勻，室溫孵化至少20min,12000rpm離心10min，去上清，沉淀用500μL75%的乙醇洗滌，再12000rpm離心10min。6A.5.8A.5.9去上清后，干燥沉淀，60℃下15s～20s（開(kāi)蓋倒立）。將沉淀溶于100μL滅菌水或TEBuffer或DEPC水中。7熊源性成分的目標(biāo)擴(kuò)增序列大小182bpCTCAGGAATAATTCTACTAACATGACAAAAAATCG