水質(zhì) 喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和氯霉素類抗生素的測定 直接進(jìn)樣液相色譜-質(zhì)譜法

1水質(zhì)喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和氯霉素類抗生素的測定直接進(jìn)樣/液相色譜-質(zhì)譜法警告：實(shí)驗(yàn)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和有機(jī)溶劑為有毒有害物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物具有放射性，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)按要求佩戴防護(hù)器具，避免吸入呼吸道或接觸皮膚和衣物，溶液配制過程應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。1適用范圍本文件規(guī)定了測定地表水、地下水和生活飲用水中喹諾酮類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類和氯霉素類4類共13種抗生素的直接進(jìn)樣/液相色譜-質(zhì)譜法。本文件適用于地表水、地下水和生活飲用水中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、培氟沙星、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑、阿莫西林、氯霉素和氟苯尼考共13種抗生素的測定。當(dāng)進(jìn)樣體積為50.0μl時(shí)，4類13種目標(biāo)化合物的方法檢出限為0.005μg/L～0.009μg/L，測定下限為0.020μg/L～0.036μg/L。詳見附錄A。2規(guī)范性引用文件本文件引用了下列文件或其中的條款。凡是未注日期的引用文件，其最新版本適用于本文件。GB/T14581水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ164地下水環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范HJ493水質(zhì)樣品的保存和管理技術(shù)規(guī)定3方法原理水樣中4類13種抗生素經(jīng)濾膜過濾后，用液相色譜儀分離，串聯(lián)質(zhì)譜儀在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）條件下測定，根據(jù)保留時(shí)間和特征離子對定性，內(nèi)標(biāo)法定量。4試劑和材料除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水為新制備的、不含目標(biāo)化合物的純水。4.1乙腈（CH3CN）：色譜純。4.2甲酸（HCOOH）：色譜純。4.3甲酸水溶液：1+1000（V/V）。移取1.0ml甲酸（4.2）加入1L實(shí)驗(yàn)用水中，混勻。4.4乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）：優(yōu)級(jí)純。4.5抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。阿莫西林、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、諾氟沙星、氧氟沙星、磺胺二甲嘧啶、環(huán)丙沙星、培氟沙星、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考、磺胺甲惡唑、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度≥99%。4.6標(biāo)準(zhǔn)溶液。4.6.1抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：ρ=100.0mg/L。準(zhǔn)確稱取適量的每種抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.5），用乙腈（4.1）配成100.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，或直接購買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯備液在4℃冷藏、密封、避光保存。阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)貯備液的保存期限為5d，2環(huán)丙沙星、培氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液的保存期限為10d，諾氟沙星、氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備液的保存期限為15d，磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑標(biāo)準(zhǔn)貯備液的保存期限為20d，或參照制造商的產(chǎn)品說明保存使用。4.6.2抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液：ρ=1.00mg/L。將抗生素標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（4.6.1）用甲酸水溶液（4.3）稀釋至1.00mg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。4.7抗生素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。環(huán)丙沙星-D8（諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、恩諾沙星的內(nèi)標(biāo)物）、磺胺甲基嘧啶-13C6（磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲惡唑的內(nèi)標(biāo)物）、阿莫西林-D4（阿莫西林的內(nèi)標(biāo)物）、氯霉素-D5（氟苯尼考、氯霉素的內(nèi)標(biāo)物）：純度≥99%。4.7.1抗生素內(nèi)標(biāo)貯備液：ρ=100.0mg/L。準(zhǔn)確稱取適量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.5），用乙腈（4.1）配成100.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，或直接購買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯備液在4℃冷藏、密封、避光保存或參照制造商的產(chǎn)品說明保存使用。4.7.2抗生素內(nèi)標(biāo)使用液：ρ=10.0μg/L。將抗生素內(nèi)標(biāo)貯備溶液（4.7.1）用甲酸水溶液（4.3）稀釋至10.0μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。4.8針式過濾器：濾膜孔徑0.22μm，親水性聚四氟乙烯（PTFE）、玻璃纖維或其他等效材質(zhì)。4.9氮?dú)猓杭兌取?9.99%。5儀器和設(shè)備除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)A級(jí)玻璃量器。5.1高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜儀：高效液相色譜儀具備大體積進(jìn)樣器；三重四極桿質(zhì)譜儀配有電噴霧離子化源（ESI）。5.2色譜柱：固定相填料為五氟苯基F5，粒徑3.0μm，柱長100mm，內(nèi)徑2.6mm，或其他等效色譜柱。5.3棕色樣品瓶：2.0ml。5.4采樣瓶：500ml棕色玻璃瓶，螺旋蓋（具聚四氟乙烯涂層的密封墊）。5.5微量注射器：10μl、50μl、100μl、1ml。5.6一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。6樣品6.1樣品采集與保存按照GB/T14581、HJ91.2、HJ164和HJ493的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行樣品的采集和保存。采集樣品時(shí)，向采樣瓶（5.4）中加入250mgEDTA-2Na（4.4），以消除金屬離子干擾，加入500μl甲酸（4.2），然后采集樣品至滿瓶，擰緊螺旋蓋密封，搖勻。水樣0℃~4℃以下冷藏、密封、避光保存，48h內(nèi)完成分析。采集樣品時(shí)應(yīng)同時(shí)采集全程序空白樣品。用采樣瓶（5.4）裝滿水帶至采樣現(xiàn)場，采樣時(shí)將水轉(zhuǎn)移至另一個(gè)采樣瓶（5.4）中，作為全程序空白樣品，隨實(shí)際樣品一起保存并運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。6.2試樣制備樣品經(jīng)針式過濾器（4.8）過濾，棄去至少1ml初濾液后，取1.0ml置于棕色樣品瓶（5.3）中，加入10.0μl內(nèi)標(biāo)使用液（4.7.2），混勻待測。6.3空白試樣的制備以實(shí)驗(yàn)用水代替樣品，按照與試樣的制備（6.2）相同的步驟制備實(shí)驗(yàn)室空白試樣。7分析步驟37.1儀器參考條件7.1.1液相色譜儀參考條件流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈（4.1），流動(dòng)相B為甲酸水溶液（4.3），線性梯度洗脫程序見表1；柱溫：40℃;進(jìn)樣體積：50μl；流速：0.4ml/min。表1液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序07.1.2質(zhì)譜儀參考條件正/負(fù)離子模式（ESI+/ESI-）；離子噴霧電壓：5500/-4500V；離子源溫度：550℃;檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）；氣簾氣（CUR）壓力：35.0kPa（5psi噴霧氣（GS1）壓力：55.0kPa（8psi）；輔助加熱氣（GS2）壓力：35.0kPa（5psi），多反應(yīng)監(jiān)測條件見表2。表2目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測條件磺胺甲基嘧啶-13C647.1.3儀器調(diào)諧按照儀器使用說明書在規(guī)定時(shí)間和頻次內(nèi)校正液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜儀的質(zhì)量數(shù)和分辨率，以確保儀器處于最佳測試狀態(tài)。7.2校準(zhǔn)7.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取一定量抗生素標(biāo)準(zhǔn)使用液（4.6.2）于甲酸水溶液（4.3）中，制備至少5個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列，諾氟沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度分別為0.040μg/L、0.100μg/L、0.200μg/L、0.500μg/L、1.00μg/L，其他11種抗生素的質(zhì)量濃度分別為0.020μg/L、0.050μg/L、0.100μg/L、0.200μg/L、0.500μg/L、1.00μg/L。每毫升標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中加入10.0μl抗生素內(nèi)標(biāo)使用液（4.7.2），貯存在棕色樣品瓶（5.3）中。將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中抗生素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抗生素的峰面積（或峰高）與內(nèi)標(biāo)物的峰面積（或峰高）比值和內(nèi)標(biāo)物濃度的乘積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線?；蛘甙凑展剑?）和（2）計(jì)算目標(biāo)抗生素的平均相對響應(yīng)因子RRF。（1）（2）n式中：RRFi——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)抗生素的相對響應(yīng)因子，無量綱；Ai——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)抗生素定量離子的峰面積（或峰高Ais——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)抗生素相對應(yīng)內(nèi)標(biāo)定量離子的峰面積（或峰高ρis——標(biāo)準(zhǔn)系列中目標(biāo)抗生素內(nèi)標(biāo)的濃度，μg/L；ρi——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度，μg/L； RRF——目標(biāo)物的平均相對響應(yīng)因子，無量綱；n——標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)數(shù)。7.2.2標(biāo)準(zhǔn)參考譜圖在本文件推薦的儀器參考條件下，陽離子模式目標(biāo)化合物的總離子色譜圖見圖1，陰離子模式目標(biāo)化合物的總離子色譜圖見圖2。目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為1.0μg/L，內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度為0.1μg/L。5圖1正離子模式11種抗生素和3種內(nèi)標(biāo)物的總離子色譜圖圖2負(fù)離子模式2種抗生素和1種內(nèi)標(biāo)物的總離子色譜圖7.3測定7.3.1試樣測定按照與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立（7.2.1）相同的步驟進(jìn)行試樣（6.2）的測定。注：若樣品中抗生素濃度過高，超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)采用甲酸水溶液（4.367.3.2空白試驗(yàn)按照與試樣測定（7.3.1）相同的步驟進(jìn)行空白試樣（6.3）及全程序空白試樣的測定。8結(jié)果計(jì)算與表示8.1定性分析按照表2中確定的抗生素的母離子和子離子進(jìn)行檢測，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，試樣中抗生素的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品中抗生素的保留時(shí)間相對偏差的絕對值應(yīng)小于2.5%；且待測樣品中定性離子的相對豐度（Ksam）與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子相對豐度（Kstd）進(jìn)行比較，所得偏差在表3規(guī)定的最大允許偏差范圍內(nèi)，則可判定為樣品中存在相應(yīng)種類的抗生素。Ksam=×100%（3）式中：Ksam——樣品中目標(biāo)抗生素定性離子的相對豐度；A2——樣品中目標(biāo)抗生素定性離子的峰面積（或峰高A1——樣品中目標(biāo)抗生素定量離子的峰面積（或峰高）。Kstd=×100%（4）式中：Kstd——標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)抗生素定性離子的相對豐度；Astd2——標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)抗生素定性離子的峰面積（或峰高Astd1——標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)抗生素定量離子的峰面積（或峰高）。表3定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差KstdKsam相對于Kstd的最大允許偏差Kstd＞508.2結(jié)果計(jì)算8.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量時(shí)，樣品中目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度ρx按公式（5）計(jì)算：Px=Pi×f（5）式中：ρx——樣品中目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度，μg/L；ρi——計(jì)算抗生素的峰面積（或峰高）與內(nèi)標(biāo)物的峰面積（或峰高）比值和內(nèi)標(biāo)物濃度的乘積后，由標(biāo)準(zhǔn)曲線（7.2.1）所得試樣中目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度，μg/L；f——稀釋倍數(shù)。78.2.2平均相對響應(yīng)因子法當(dāng)采用平均相對響應(yīng)因子法進(jìn)行定量時(shí)，樣品中目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度ρx按公式（6）計(jì)算。（6）式中：ρx——樣品中目標(biāo)抗生素的質(zhì)量濃度，μg/L；Ax——樣品中目標(biāo)抗生素的峰面積（或峰高）；ρis——標(biāo)準(zhǔn)系列中目標(biāo)抗生素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，μg/L；Ais——樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積（或峰高）；f——稀釋倍數(shù)； RRF——由公式（2）所得目標(biāo)物的平均相對響應(yīng)因子，無量綱。8.3結(jié)果表示測定結(jié)果小數(shù)位數(shù)與檢出限保持一致，最多保留三位有效數(shù)字。9準(zhǔn)確度9.1精密度3家實(shí)驗(yàn)室分別對4類抗生素的加標(biāo)濃度為除諾氟沙星、環(huán)丙沙星0.040μg/L、0.100μg/L和0.500μg/L外，其他均為0.020μg/L、0.100μg/L和0.500μg/L的地表水和地下水進(jìn)行了6次重復(fù)測定，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.0%～11%，實(shí)驗(yàn)室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.58%～14%之間，重復(fù)性限在0.003μg/L～0.121μg/L之間，再現(xiàn)性限在0.003μg/L～0.121μg/L之間，參見附錄B中表B.1。9.2正確度3家實(shí)驗(yàn)室分別對4類抗生素的加標(biāo)濃度為除諾氟沙星、環(huán)丙沙星0.040μg/L、0.100μg/L和0.500μg/L外，其他均為0.020μg/L、0.100μg/L和0.500μg/L的地表水和地下水進(jìn)行了6次重復(fù)測定，加標(biāo)回收率范圍在83.0%～117%之間，具體見附錄B中表B.2。10質(zhì)量保證和質(zhì)量控制10.1空白試驗(yàn)每20個(gè)樣品或每批次樣品（少于20個(gè)）至少做一個(gè)實(shí)驗(yàn)室空白、一個(gè)全程序空白，空白試樣值不得超過方法的檢出限。10.2校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r≥0.995，或相對響應(yīng)因子（RRF）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤20%，否則應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；每批樣品(≤20個(gè)）應(yīng)測定一個(gè)曲線中間校核點(diǎn)，其測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)點(diǎn)濃度的相對誤差應(yīng)在±20%以內(nèi)。10.3精密度控制每20個(gè)樣品或每批次樣品（少于20個(gè)）應(yīng)至少測定一個(gè)平行樣，平行樣的相對偏差應(yīng)≤40%。810.4正確度控制每20個(gè)樣品或每批次樣品（少于20個(gè)）應(yīng)至少測定5%的基體加標(biāo)樣品，樣品數(shù)量少于20個(gè)時(shí)，應(yīng)至少測定一個(gè)基體加標(biāo)樣品，加標(biāo)回收率應(yīng)在60%～140%之間。11廢物處置實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的廢液和廢物應(yīng)分類收集、集中保管，并做好相應(yīng)標(biāo)識(shí)，依法委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處置。9附錄A（規(guī)范性附錄）表A.1方法的檢出限和測定下限1No