牛腹瀉疾病防控操作規(guī)程

1牛腹瀉疾病防控操作規(guī)程本文件規(guī)定了牛腹瀉疾病的診斷和防治。本文件適用于奶牛飼養(yǎng)場（戶）、肉牛飼養(yǎng)場（戶）和動物診療單位對牛腹瀉疾病的防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫DB63/T1652病害動物及病害動物產(chǎn)品無害化處理技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1牛腹瀉疾病牛腹瀉是一種以消化不良、腹瀉為主要癥狀的消化道疾病，引起牛腹瀉的原因復(fù)雜，分為傳染性和非傳染性因素兩類，傳染性因素有病毒、細菌、寄生蟲等病原微生物感染，非傳染性因素有營養(yǎng)因素、環(huán)境、管理等。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BVDV：牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrheavirus）BVD/MD：牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙ovineviraldiarrhea-mucosaldisease）BRV：牛輪狀病毒（Bovineratovirus）BcoV：牛冠狀病毒（Bovinecoronavirus）E.coli：大腸桿菌（Escherichiacoli）CPE：致細胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect）MA104細胞：恒河猴腎細胞（Rhesuskidneycell）Vero細胞：非洲綠猴腎細胞（VerdaRenoCell）MDBK細胞：牛腎細胞（MadinDarbyBovineKidneyCell）HRT-18細胞：人直腸癌細胞（HumanRectalTumor-18Cell）Dubos培養(yǎng)基：杜波斯液體培養(yǎng)基（Dubosmedium）2沙門菌：Salmonella副結(jié)核分枝桿菌：M.paratuberculosis球蟲：Sphaerozoumfuscum隱孢子蟲：CryptosporidiumparvumHE瓊脂：HektoenEntericAgar5生物安全措施樣品采集的生物安全措施符合GB/T27401-2008的規(guī)定。樣品處理的生物安全措施符合GB19489的規(guī)定。6病因6.1感染性腹瀉引起牛腹瀉疾病的主要病原有：病毒性病原包括牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛輪狀病毒（BRV）和牛冠狀病毒（BCoV）等；細菌性病原包括致病性大腸桿菌（E.coli）、沙門菌（Salmonella）、副結(jié)核分枝桿菌（M.paratuberculosis）等；寄生蟲性病原包括球蟲（Sphaerozoumfuscum）和隱孢子蟲（Cryptosporidiumparvum）等。6.2非感染性腹瀉引起非感染性腹瀉的主要因素有飼養(yǎng)管理和環(huán)境因素，如消化不良、營養(yǎng)缺乏、中毒、應(yīng)激等。7診斷7.1臨床診斷7.1.1流行病學(xué)不同年齡和品種牛均可感染，幼齡動物易感，致病性大腸桿菌性腹瀉多發(fā)于7日齡以內(nèi)犢牛；沙門菌病多發(fā)于1月齡以后的犢牛；副結(jié)核病多發(fā)于成年牛；牛病毒性腹瀉病毒多發(fā)于6～18月齡牛，牛輪狀病毒和牛冠狀病毒多發(fā)于1周齡犢牛。一年四季均可發(fā)病，尤以氣候多變季節(jié)易發(fā)，呈地方流行性或散發(fā)性。病牛和隱性感染牛是本病自然流行的傳染源，消化道是最主要的傳播途徑，隨糞便排出大量病原微生物，污染外界環(huán)境。7.1.2臨床癥狀7.1.2.1病毒性腹瀉7.1.2.1.1牛病毒性腹瀉/黏膜病牛病毒性腹瀉病毒是引起牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙VD/MD）的病原。急性感染牛突然發(fā)病，體溫升至40℃~42℃,隨體溫升高，白細胞減少，繼而增多，有的可發(fā)生第二次白細胞減少。病牛精神沉郁、厭食，鼻、眼有漿液性分泌物，2d～3d內(nèi)可能有鼻鏡及口腔黏3膜表面糜爛，舌面上皮壞死、流涎增多、呼氣惡臭，通常在口腔損害之后發(fā)生嚴重腹瀉，病初水瀉，后帶黏液和血。部分病牛出現(xiàn)蹄葉炎及趾間皮膚糜爛壞死，導(dǎo)致跛行。慢性病例常出現(xiàn)鼻鏡糜爛，眼部常有漿液性分泌物。門齒齒齦通常發(fā)紅，典型的臨床癥狀是由于蹄葉炎及趾間皮膚糜爛壞死而致的跛行。通常皮膚呈屑狀，在髻甲、頸部及耳后最明顯。母牛妊娠期感染后流產(chǎn)，或產(chǎn)先天性缺陷犢牛，最常見的缺陷是小腦發(fā)育不全。7.1.2.1.2牛輪狀病毒性腹瀉犢牛感染后12～24h出現(xiàn)嚴重腹瀉，發(fā)病突然，病初表現(xiàn)為精神不振、厭食、嘔吐和腹瀉，體溫正常或略高，排黃白色稀便，有時帶有黏液和血液。病程長者脫水明顯，嚴重者常有死亡。成年牛多呈隱性感染，并在一定時間持續(xù)向外界排毒。7.1.2.1.3牛冠狀病毒性腹瀉犢牛感染后發(fā)生腹瀉，發(fā)病初期出現(xiàn)帶血的黃色黏性糞便，后期發(fā)展為水瀉，有時出現(xiàn)脫水、虛弱、體溫低，少數(shù)犢牛出現(xiàn)發(fā)熱、臥地不起等癥狀，嚴重的犢牛會出現(xiàn)昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴發(fā)，排出深褐色帶血稀糞，伴有產(chǎn)奶下降、沉郁及厭食等癥狀。7.1.2.2細菌性腹瀉7.1.2.2.1致病性大腸桿菌性腹瀉犢牛出生后7日齡內(nèi)腹瀉，病初體溫升高達41℃~42℃,有的犢牛出生后數(shù)小時開始腹瀉。初期糞便呈粥樣、黃色，后期呈水樣、灰白色，混有未消化的凝乳塊、血液及泡沫，有酸臭味。末期患病牛伴有腹痛，用蹄踢腹壁?？砂l(fā)生臍炎或關(guān)節(jié)炎，偶見肺炎。耐過病牛發(fā)育遲緩。有些病例可因急性敗血癥突然死亡或在腸毒素作用下脫水休克死亡，可見典型的中毒性神經(jīng)癥狀，興奮不安，后昏迷死亡，死前多有腹瀉。7.1.2.2.2沙門菌病主要由鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌引起。犢牛多發(fā)病突然，病初體溫升高至40℃~41℃,24h后排出灰黃色稀便，混有黏液和血絲，一般于出現(xiàn)癥狀后5d～7d內(nèi)死亡。病程長者可能會出現(xiàn)腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)腫大。成年牛感染初期高熱、昏迷、食欲廢絕、脈搏頻數(shù)、呼吸困難，發(fā)病后12～24h糞便中帶有血塊，隨即腹瀉。糞便惡臭，含有纖維素絮片，間雜有黏膜。病牛常死于高熱期后。病程長者可見迅速脫水、消瘦、眼窩下陷，黏膜（尤其眼結(jié)膜）充血發(fā)黃。妊娠牛多流產(chǎn)。若牛群內(nèi)存在帶菌母牛，犢牛于出生后48h內(nèi)拒食、臥地，迅速衰竭，最終死亡。7.1.2.2.3副結(jié)核病潛伏期較長，一般2～5歲成母牛階段才表現(xiàn)臨床癥狀，早期癥狀不明顯，后期出現(xiàn)特征性癥狀，表現(xiàn)為間斷性腹瀉，逐漸變?yōu)榻?jīng)常性的頑固性腹瀉，排泄物稀薄、惡臭，帶有氣泡、黏液和血液凝塊。體溫常無變化，下頜部皮下水腫等。7.1.2.3寄生蟲性腹瀉7.1.2.3.1球蟲病感染牛精神不振、食欲下降、腹瀉，病情加劇時體溫升至41℃左右，發(fā)病后期出現(xiàn)貧血，體溫下降至35℃~36℃,后肢和肛門周圍被血糞污染。47.1.2.3.2隱孢子蟲病發(fā)病后主要表現(xiàn)為腹瀉，食欲下降，嚴重脫水，在腹瀉期間的犢牛失去吃乳能力，飲水欲望增加。7.1.3病理變化7.1.3.1病毒性腹瀉7.1.3.1.1牛病毒性腹瀉/黏膜病整個口腔可見糜爛灶。典型病變是食管黏膜糜爛斑呈縱行排列。胃黏膜可見出血、糜爛。小腸黏膜腫脹、出血，呈急性卡他性炎變化，尤以空腸和回腸嚴重，伴有潰瘍形成。消化道淋巴結(jié)腫脹、充血、出血和水腫。頸部和咽背淋巴結(jié)亦腫大，呈急性淋巴結(jié)炎變化。肝臟脂肪變性。全身皮下組織、陰道黏膜及心內(nèi)外膜出血。7.1.3.1.2牛輪狀病毒性腹瀉牛輪狀病毒病變主要表現(xiàn)在消化道，腔內(nèi)充滿凝乳塊和乳汁，小腸腸壁變薄、半透明，腸內(nèi)容物呈液狀、灰黃或灰黑色，有時小腸黏膜出現(xiàn)廣泛出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大。7.1.3.1.3牛冠狀病毒性腹瀉小腸腸壁變薄、透明，腸腔液體增多，嚴重者引起腹腔積水，胃內(nèi)有未消化的凝乳塊。牛冠狀病毒感染的?？赡馨殡S呼吸道癥狀，表現(xiàn)為氣管黏膜充血、局限性肺炎等。7.1.3.2細菌性腹瀉7.1.3.2.1致病性大腸桿菌性腹瀉腹瀉的病犢，皺胃和小腸黏膜可見充血、水腫和出血，皺胃內(nèi)有大量凝乳塊，黏膜表面覆蓋膠狀黏液。腸內(nèi)容物常混有血液和氣泡，惡臭。腸系膜淋巴結(jié)腫大。經(jīng)臍帶感染的病例可見出血性臍炎和出血性臍動脈炎。病程長者伴有漿液纖維素性關(guān)節(jié)炎和出血性或漿液出血性肺炎。因敗血癥或腸毒素作用下休克死亡的病犢，常無明顯的病理變化。7.1.3.2.2沙門菌病犢?？梢娖⑴K明顯腫大而柔軟，呈灰紅或暗紅色，邊緣鈍圓，被膜緊張，可見出血斑點和粟粒大的壞死灶，切面結(jié)構(gòu)模糊。肝臟腫大，質(zhì)地柔軟，被膜下散在針尖大的灰黃或灰白色病灶。皺胃黏膜充血、水腫，表面被覆大量黏液，有時可見出血點。腸腔內(nèi)充滿稀薄內(nèi)容物，混有黏液和血液，內(nèi)容物呈咖啡色。病程較長時，小腸可見浮膜性與固膜性腸炎，腸系膜淋巴結(jié)呈不同程度的水腫、出血。成年牛胸膜出血和較嚴重的出血性與浮膜性腸炎，其余病變與犢牛相同。7.1.3.2.3副結(jié)核病尸體極度消瘦，可視黏膜因貧血呈蒼白色，被毛粗亂無光，肌肉色淡、變薄，脂肪組織消失殆盡，位于眼窩與心外膜部的脂肪組織呈漿液性萎縮狀態(tài)。特征性病變?yōu)槁栽錾阅c炎及相應(yīng)的淋巴結(jié)炎。小腸病變多集中于空腸后段和回腸，其次是空腸中段。病變腸管變粗，質(zhì)地如食管；腸腔狹窄，常缺乏內(nèi)容物，或黏膜覆蓋一層灰白色黏稠的糊狀物。腸黏膜增厚2～30倍，折疊形成腦回樣皺襞，觸摸柔軟富有彈性。大腸病變多見于回盲瓣、盲腸及結(jié)腸近端，回盲瓣黏膜充血、出血、水腫，瓣口緊縮形成球形，盲腸和結(jié)腸病變與小腸相似。病變部腸管的漿膜淋巴管和相應(yīng)的腸系膜淋巴管擴張、增粗，呈彎曲的細繩索狀，切開流出稍渾濁的液體。57.1.3.3寄生蟲性腹瀉7.1.3.3.1球蟲病以出血性腸炎為特征，尸體消瘦，可視黏膜蒼白，腸道廣泛性的卡他性炎或出血性炎癥，小腸后段、盲腸和結(jié)腸內(nèi)充滿半凝固的血樣內(nèi)容物，腸黏膜腫脹、增厚或糜爛性壞死，淋巴濾泡腫大，有白色或灰色小病灶和潰瘍，表面有凝乳狀薄膜覆蓋。直腸內(nèi)容物呈褐色、惡臭，有纖維素性薄膜和黏膜碎片。腸系膜淋巴結(jié)腫大和發(fā)生炎癥。7.1.3.3.2隱孢子蟲病剖檢可見腹腔內(nèi)蓄積大量液體，呈淡黃或微黃色，皺胃黏膜表面存在出血點和出血斑，回腸黏膜存在大面積的出血斑。7.1.4結(jié)果判定出現(xiàn)上述臨床癥狀和病理變化，可初步判定為牛腹瀉疾病疑似病例。7.2實驗室診斷7.2.1器材7.2.1.137℃恒溫細菌培養(yǎng)箱7.2.1.2CO2細胞培養(yǎng)箱7.2.1.3T25細胞培養(yǎng)瓶7.2.1.4漩渦振蕩器7.2.1.5倒置顯微鏡7.2.1.6電鏡7.2.1.7電泳儀7.2.1.8水平電泳槽7.2.1.9凝膠成像儀7.2.1.100.22μm濾器7.2.1.11不同規(guī)格可調(diào)移液器與槍頭7.2.1.12PCR儀7.2.1.13臺式高速離心機7.2.1.14水浴鍋7.2.1.15電子天平7.2.1.16酒精燈7.2.1.17接種環(huán)7.2.1.18無菌棉拭子7.2.1.19培養(yǎng)皿7.2.1.20不同規(guī)格離心管7.2.1.21PCR管7.2.1.22無菌密封袋7.2.1.23手術(shù)刀7.2.1.24手術(shù)剪7.2.1.25無菌鑷67.2.1.267.2.1.27玻片PE手套7.2.2試劑7.2.2.1生理鹽水7.2.2.2商品化細菌培養(yǎng)基7.2.2.3細菌微量生化反應(yīng)管及指示劑7.2.2.4病原診斷血清7.2.2.5PBS7.2.2.6DMEM7.2.2.7胎牛血清7.2.2.8青鏈霉素7.2.2.90.25%EDTA-胰酶7.2.2.10MA104細胞7.2.2.11Vero細胞7.2.2.12MDBK細胞7.2.2.13HRT-18細胞7.2.2.14無酶水7.2.2.15Taq酶7.2.2.16電泳緩沖液7.2.2.17瓊脂糖7.2.2.18DNAMarker7.2.3樣品采集7.2.3.1糞便樣品將棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，放入裝有3mLPBS管中；地上有剛排出新鮮糞便時無菌采集。編號并記錄相關(guān)信息。7.2.3.2組織樣品取病死牛腸道及內(nèi)容物、肝、脾、淋巴結(jié)、胃等，置于無菌密封袋內(nèi)。7.2.4樣品處理7.2.4.1樣品用于病毒檢測：將采集的糞便樣品放入盛有3mLPBS管中，充分振蕩，4℃、12000r/min離心5～8min，取上清編號備用；稱取1g組織樣品置于研缽，充分研磨后加5mLPBS，混勻，4℃、8000r/min離心5min，取上清編號備用。將上清于0.22μm濾器過濾，-80℃冰箱保存?；蛑苯咏臃N細胞。7.2.4.2樣品用于細菌檢測：將糞便樣品漩渦震蕩，用無菌接種環(huán)接種于增菌培養(yǎng)基；直接取少許組織樣品接種于增菌培養(yǎng)基，于37℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。7.2.4.3樣品用于寄生蟲檢測：稱取1g糞便于燒杯中，加入12～29mL的飽和鹽水進行飽和鹽水漂浮法檢測。7.2.5病原檢測77.2.5.1病毒檢測7.2.5.1.1電鏡檢查收集糞便及腸內(nèi)容物，電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。7.2.5.1.2病毒分離鑒定將處理的樣品接種適宜細胞（MA104細胞、Vero細胞、MDBK細胞、HRT-18細胞）進行病毒分離培養(yǎng)，根據(jù)中和試驗（固定血清-稀釋病毒法）進行病毒鑒定。7.2.5.1.3免疫熒光染色應(yīng)用相應(yīng)的病毒抗體對細胞培養(yǎng)物進行免疫熒光檢測，根據(jù)熒光信號強弱判定結(jié)果。7.2.5.1.4PCR檢測應(yīng)用普通或熒光定量PCR/RT-PCR方法進行病原核酸擴增及檢測。7.2.5.1.5ELISA檢測應(yīng)用ELISA試劑盒，根據(jù)說明書進行病原檢測。7.2.5.1.6膠體金試紙條檢測應(yīng)用商品化試劑盒，根據(jù)說明書進行病原檢測。7.2.5.2細菌檢測7.2.5.2.1細菌分離將采集的糞便或組織樣品，用相應(yīng)細菌培養(yǎng)基培養(yǎng)。大腸桿菌用伊紅美藍瓊脂或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)；沙門菌用沙門菌-志賀菌培養(yǎng)基（SS培養(yǎng)基）、HE瓊脂培養(yǎng)基或去氧膽鹽鈉-枸櫞酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)；副結(jié)核分枝桿菌初代分離困難，在病變腸段及腸淋巴結(jié)分離率較高，可先用4%H2SO4或2%NaOH處理，再用Dubods培養(yǎng)基上或HEYM培養(yǎng)基培養(yǎng)。7.2.5.2.2染色鏡檢將分離純化的菌進行革蘭染色，副結(jié)核分枝桿菌可用抗酸染色法，顯微鏡下觀察細菌形態(tài)。7.2.5.2.3生化鑒定將分離純化的菌用相應(yīng)的生化鑒定管進行生化特性鑒定，根據(jù)伯杰細菌手冊統(tǒng)計結(jié)果。7.2.5.2.4血清學(xué)鑒定對副結(jié)核分枝桿菌進行定期抗體檢測。7.2.5.2.5分子檢測用特異性的引物進行病原的普通或熒光定量PCR檢測。7.2.5.3寄生蟲檢測7.2.5.3.1分子檢測8用特異性的引物進行病原的普通或熒光定量PCR檢測。7.2.5.3.2ELISA檢測使用商品化的牛隱孢子蟲檢測試劑盒、牛球蟲ELISA檢測試劑盒進行檢測。7.2.5.3.3飽和鹽水漂浮法配制飽和鹽水，顯微鏡下觀察球蟲卵囊形態(tài)并計數(shù)。7.2.5.3.4直接涂片染色將糞便涂片，室溫滴加10%NaOH1min后水洗，采用金胺-酚改良抗酸復(fù)染法進行染色鏡檢。鏡下可觀察到玫瑰紅色的卵囊。7.3綜合診斷7.3.1初診符合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化可初步診斷為牛腹瀉疾病。7.3.2確診符合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，實驗室診斷任一檢測結(jié)果為陽性可判定為牛腹瀉疾病。8預(yù)防8.1加強飼養(yǎng)管理，保持飼料和飲水的清潔、衛(wèi)生。8.2避免應(yīng)激，消除可能降低機體抵抗力的各種應(yīng)激因素。8.3自然哺乳母牛定期消毒乳頭，防止致病微生物傳染犢牛。8.4分娩時，落地犢牛口鼻切勿接觸臟污。8.5奶壺、奶桶、奶嘴、毛巾等哺乳用具嚴格消毒；圈舍、圍欄、飲水器具等進行定期消毒。8.6創(chuàng)造良好生活環(huán)境，及時將牛舍中的糞污清理干凈，每隔3d噴霧消毒1次，采用暖風(fēng)爐管道送風(fēng)，在保證舍內(nèi)溫度的前提下，中午開門窗，自然通風(fēng)，保證牛舍干燥、衛(wèi)生、舒適、溫暖。8.7初生犢牛及時吮吸初乳。荷斯坦奶牛犢牛出生后1h內(nèi)哺喂經(jīng)巴氏消毒的初乳4L，奶溫36℃~38℃,12小時后視情況再飼喂2L。8.8哺乳犢牛給予開食料，補充硒，防止飼料因缺硒造成腹瀉死亡。飼料配比適當(dāng)，降低斷奶應(yīng)激。8.9堅持自繁自養(yǎng)，如引進牛則必須進行健康檢查才能混群；副結(jié)核存在問題的牛場，定期進行抗體檢測，標記陽性牛，血清抗體陽性牛的初乳丟棄，出現(xiàn)臨床癥狀