(高清版)DB34∕T 1435-2011 抗蟲玉米MON810及其衍生品種 實時熒光PCR檢測方法　　

B22抗蟲玉米MON810及其衍生品種實時熒光Real-timePCRmethodforinsect-resistantmaizeMON810僅供學習交流使用，請勿傳播或其他用途安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由安徽省技術(shù)監(jiān)督局提出。本標準由安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局歸口。本標準起草單位：安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所和安徽省標準化研究院。本標準主要起草人：馬卉、汪秀峰、楊劍波、李莉、張士勝、陸徐忠、倪大虎、宋豐順、張毅、陳萍、倪金龍、楊亞春。僅供學習交流使用，請勿傳播或其他用途1抗蟲玉米MON810及其衍生品種實時熒光PCR檢測方法件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求和定義轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測抽樣農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007抗蟲玉米MON810及其衍生品種定性PCR方法外源插入載體3端與玉采基因組的連接區(qū)序列，包括外源基因cryIAb'部分序列和玉米基因組部2實時熒光PCR中以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。TaqMan熒光PCR技術(shù)是以TaqMan熒光探針為基礎(chǔ)，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標除非另有說明，僅使用分析純試劑和重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級水。中，配成10mg/mL的濃度，于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，分裝成小份保存于-20℃。5.410mol/LNaOH溶液：在160mL水中加入80.0g氫氧化鈉(NaOH),溶解后再加水定容到200mL。至8.0,加水定容到100mL,在-103.4kPa(121℃)滅菌20min。用水定容至1000mL。5.7dNTPs混合溶液：將濃度為10mmol/L的dATP,dCTP,dGTP,dTTP四種脫氧核糖核苷酸等體積混5.8適用于PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶(5U/μL)及其反應(yīng)緩沖液。5.9引物和探針：序列信息應(yīng)按附錄A執(zhí)行。用TE緩沖液(5.6)或重蒸餾水將上述引物和探針稀釋36儀器6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2普通PCR儀和Real-timePCR儀。7.3DNA模板制備7.5對照設(shè)置在PCR反應(yīng)的同時，應(yīng)設(shè)置陰性對照和空白對照。以非轉(zhuǎn)基因玉米DNA作為陰性對照PCR反應(yīng)體系的模板；以轉(zhuǎn)基因玉米MON810DNA作為陽性對照的模板；以重蒸水作為空白對照PCR反應(yīng)體系7.6PCR定性檢測按農(nóng)業(yè)部869號公告-9-2007/規(guī)定的執(zhí)行。當PCR反應(yīng)體系正常工作時，試樣中擴增出內(nèi)標準基因-zSSIIb,說檢測要求。同時，對試樣進行轉(zhuǎn)化體MON810的檢測若出現(xiàn)搪增條帶，伊護增木小與預期片段大小一實時熒光PCR體系反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照附錄B和附錄C執(zhí)行。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件應(yīng)根據(jù)試劑要求進行適當調(diào)整。每個反應(yīng)體系設(shè)置3個平行。4在擴增內(nèi)標準基因zSSIIb時，空白對照熒光曲線平直，陰性對照和陽性對照出現(xiàn)典型的擴增曲線，或空白對照熒光值低于陰性對照和陽性對照熒光值的15%,表明反應(yīng)體系正常工作；在擴增檢測轉(zhuǎn)化體MON810時，空白對照和陰性對照的熒光曲線平直，陽性對照出現(xiàn)典型的擴增曲線，且檢測Ct值≤36或空白對照和陰性對照的熒光值低于陽性對照熒光值的15%,表明反應(yīng)體系正常工作。否則，表明PCR反應(yīng)體系不正常，需要查找原因重新檢測。8結(jié)果分析與表述a)試樣中內(nèi)標準基因檢測Ct值≤36,轉(zhuǎn)化體MON810檢測Ct值≥40,則表明該試樣中不含轉(zhuǎn)基因成分MON810。表述為“樣品中未檢測出抗蟲玉b)試樣中內(nèi)標準基因檢測Ct值≤36,轉(zhuǎn)化體MON810檢測Ct值≤36,則表明該試樣中含有轉(zhuǎn)基因成分MON810。表述為“樣品中檢測出抗蟲玉米MON810,檢測結(jié)果為陽性”。c)試樣中轉(zhuǎn)化體MON810檢測Ct值在36～40,則需調(diào)整模板濃度，重新檢測。經(jīng)重復檢測后，當檢測體系正常時，轉(zhuǎn)化體MON810檢測Ct值<40,則表明該試樣中含有轉(zhuǎn)基因成分MON810,表述為“樣品中檢測出抗蟲玉米MON810,檢測結(jié)果為陽性”;否則，表明該試樣中不含轉(zhuǎn)基因成分MON810,表述為“樣品中未檢測出抗蟲玉米MON810,檢測結(jié)果為陰性”。9防污染措施轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810的實時熒光PCR檢測過程的防污染措施應(yīng)符合NY/T672的規(guī)定。僅供學習交流使用，請勿傳播或其他用途5(規(guī)范性附錄)實時熒光PCR檢測引物和探針序列信息表A.1被檢測基因引物或探針序列zSSIIb-F:5′-CGGTGGAzSSIIb-R:5′-AAAGGGCCAGGTTzSSIIb-P:5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCMON810-F:5′-CACCACAGCCACCAMON810-R:5′-ATTCGGAAATGAAAGAAGGCTACC-3MON810-P:5′-FAM-CTCGTTCAGGTCGGTGCAGCCCA-B僅供學習交流使用，請勿傳播或其他用途6(規(guī)范性附錄)終濃度水10Hmol/L上游引物總體積注1:如果PCR緩沖液中含有氯化鎂，則不加氯化鎂溶液注2:玉米內(nèi)標準基因PCR檢測反應(yīng)體系中，上下游引物和探針分別為zS