體外診斷試劑的分類和基本原理

體外診斷試劑的分類和基本原理

我國(guó)體外試劑得幾個(gè)發(fā)展階段

1七十年代末,乳膠凝集,血球凝(PHA,RPHA)

2八十年代初期,放射免疫測(cè)定(RIA),

抗HBs單克隆抗體

3八十年代中期,酶聯(lián)免疫試劑,基因工程表達(dá)乙肝

病毒核心抗原和e抗原

4九十年代,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),丙肝,戊肝

病毒基因被克隆,各種基因工程抗

原被應(yīng)用

5近期,發(fā)光免疫,生物芯片技術(shù)(基因芯片,

蛋白芯片)

(第一類)

酶聯(lián)免疫(酶標(biāo)板、磁珠、微粒子)類試劑酶聯(lián)免疫法:乙型肝炎病毒e抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法);癌胚抗原定量測(cè)定試劑盒(免疫熒光法)化學(xué)發(fā)光法:人生長(zhǎng)激素(GH)定量測(cè)定試劑盒增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法:巨細(xì)胞病毒抗體檢測(cè)試劑盒時(shí)間分辨熒光法:游離甲狀腺素(FT4)定量測(cè)定試劑盒電化學(xué)發(fā)光法:甲型肝炎病毒抗體診斷試劑盒微粒子酶免法:丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒酶聯(lián)免疫試劑抗原抗體之間得特異反應(yīng)與酶得高效催化反應(yīng)有機(jī)得結(jié)合。固相樣品放大抗原抗體抗抗體-酶-底物-顯色抗體抗原抗體-酶-底物-顯色酶標(biāo)板樣品中HCV抗原HRP酶標(biāo)記抗HCV抗體抗HCV抗體HRP酶單克隆抗體丙肝抗原ELISA試劑HIV-1p24抗原檢測(cè)試劑得原理

1雙抗體夾心法應(yīng)用HBsAg,HBeAg,HBcAg,pres1,pres2

2雙抗原夾心法應(yīng)用抗HBs,抗HIV

3競(jìng)爭(zhēng)法 應(yīng)用抗HBc,抗pres24中和抑制法應(yīng)用抗Hbe5捕獲法應(yīng)用抗HBcIgM6間接法應(yīng)用抗HCV,抗HEV,幾種主要得酶聯(lián)免疫方法模式發(fā)光免疫試劑1、抗原抗體反應(yīng)得基本原理及方法模式與酶聯(lián)免疫試劑完全相同2、檢測(cè)光信號(hào),其光信號(hào)可因酶催化而產(chǎn)生也可用其她方法使其產(chǎn)生酶促化學(xué)發(fā)光以酶為催化劑,通過(guò)氧化反應(yīng),使底物發(fā)光。過(guò)氧化物酶(HRP)促發(fā)光,底物——魯米諾堿性磷酸酶(AP)促發(fā)光,底物——螺旋金剛烷環(huán)氧化物苯磷酸酯(AMPPD)魯米諾及其衍生物得增敏化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(HRP)商業(yè)化產(chǎn)品中常見(jiàn)得化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(一)ROHRBOHOHROHSN魯米諾及其衍生物得增強(qiáng)劑(Enhancer)AMPPD及其衍生物得化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(AP)光子(477nm)APOOOCH3OPO32-O-OOOCH3+*OO-OOCH3商業(yè)化產(chǎn)品中常見(jiàn)得化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(二)大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜非酶促化學(xué)發(fā)光及電化學(xué)發(fā)光非酶促化學(xué)發(fā)光:以吖啶酯、過(guò)氧化氫為發(fā)光系統(tǒng),不需要酶得催化。儀器成本高,技術(shù)復(fù)雜,尚未國(guó)產(chǎn)化(Abbott)電化學(xué)發(fā)光:氧化反應(yīng)就是通過(guò)電極上得電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生,標(biāo)記物為三氯聯(lián)吡啶釕。儀器成本高,技術(shù)復(fù)雜,尚未國(guó)產(chǎn)化。(Roche)CH3C=OORN+OH-H+H2O2+H2O+ROH光子+CO2+CH3C=OORNHOCH3C=OORNHOOCH3ONCH3ONC=OO商業(yè)化產(chǎn)品中常見(jiàn)得化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(三)吖啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)/非酶促e-TPATPA

TPA+

H+e-e-PlatinumelectrodeMagnet發(fā)光Ru2+基態(tài)Ru2+激發(fā)態(tài)Ru3+++電化學(xué)發(fā)光法原理在電場(chǎng)得作用下,三丙胺(TPA)被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+,后者很不穩(wěn)定,可自發(fā)失去一個(gè)質(zhì)子(H+),形成自由基TPA,這就是一種很強(qiáng)得還原劑,可將一個(gè)電子給三價(jià)得三聯(lián)吡啶釕衍生物[Ru(bpy)3]3+,使其形成激發(fā)態(tài)得[Ru(bpy)3]2+,而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發(fā)態(tài)得[Ru(bpy)3]2+通過(guò)熒光機(jī)制衰減,發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)620nm得光子,重新生成基態(tài)得[Ru(bpy)3]2+。該過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行,產(chǎn)生許多光子,光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度,光強(qiáng)度與[Ru(bpy)3]2+得濃度呈線性關(guān)系,故可測(cè)出待測(cè)抗原得含量。時(shí)間分辨熒光將三價(jià)稀土離子銪(Eu)等通過(guò)絡(luò)合物標(biāo)記到抗原或抗體分子上,通過(guò)檢測(cè)銪等得熒光實(shí)現(xiàn)免疫分析

應(yīng)注意環(huán)境及樣品中同類元素導(dǎo)致得本底干擾,特別就是北方地區(qū)時(shí)間分辨熒光增強(qiáng)原理發(fā)光信號(hào)檢測(cè)光敏二極管、光敏電池、光電偶合器(CCD)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定但靈敏度低、線性范圍較窄。主要特點(diǎn)原理:光信號(hào)光電轉(zhuǎn)換器件電壓或電流信號(hào)放大單光子計(jì)數(shù)器就是目前高靈敏度發(fā)光分析儀得核心部件光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽(yáng)極上形成較強(qiáng)信號(hào)脈沖信號(hào)相對(duì)發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU)在各打拿極之間得到能量和數(shù)目得倍增流動(dòng)池檢測(cè)方式示意圖檢測(cè)器檢測(cè)池負(fù)壓泵廢液四通閥沖洗液樣品管計(jì)量泵干燥空氣原位進(jìn)樣泵氧化劑優(yōu)點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,運(yùn)行成本低缺點(diǎn):明顯得易產(chǎn)生交叉污染,工作效率受限。常見(jiàn)進(jìn)口發(fā)光免疫分析產(chǎn)品生產(chǎn)廠商產(chǎn)品技術(shù)類型反應(yīng)體系產(chǎn)品特點(diǎn)儀器類型ROCHE電化學(xué)發(fā)光、磁微珠腫瘤標(biāo)志物E170ABBOTT化學(xué)發(fā)光、磁微珠堿性磷酸酶、吖啶酯乙肝項(xiàng)目I2000Bayer化學(xué)發(fā)光、磁微珠吖啶酯內(nèi)分泌項(xiàng)目ADVIACentaurBeckman化學(xué)發(fā)光、磁微珠堿性磷酸酶UniCelDxI800DPC化學(xué)發(fā)光、塑料球堿性磷酸酶藥物分析Immuline2000強(qiáng)生化學(xué)發(fā)光辣根過(guò)氧化物酶丙肝生物梅里?；瘜W(xué)發(fā)光堿性磷酸酶HIVPE(Wallac)時(shí)間分辨熒光(第二類)

膠體金(硒、乳膠)類試劑膠體金法:梅毒抗體-乙肝表面抗原診斷試劑盒膠體硒法:HIV(1+2+0)試劑盒膠體金試劑原理硝酸纖維膜加樣

檢測(cè)區(qū)對(duì)照區(qū)(HBsAg)-----------------------------玻璃纖維膜-------------------

抗HBs羊抗鼠鼠抗HBs膠體金免疫層析法反應(yīng)示意圖吸樣墊膠體金墊包被T線包被C線上樣墊NC膜支撐物HIV膠體金類快速診斷試劑檢測(cè)結(jié)果第三類)

免疫印跡試劑免疫印跡試劑盒:風(fēng)濕病自身抗體檢測(cè)試劑盒(免疫印跡法)免疫印跡法示意圖

用于RR樣品得HCV抗體確認(rèn)獨(dú)特得IgG(I/II)及hSOD內(nèi)部質(zhì)控設(shè)計(jì)用于檢測(cè)得固相化抗原

重組表達(dá)蛋白:c33c,NS5合成肽抗原:c100p(5-1-1p),c22pIgGcontrolIIIgGcontrolIIDc100(p)5-1-1(p)c33cc22(p)hSODNS5RIBA?HCV3、0c100-3NS5c33cc22-3SOD3+Control1+ControlPosINDPosNegINDRIBA模式圖3+controlband(serumaddition)CapsidNS3-1NS3-2NS4NS51+controlband(reagentaddition)

GLDHCVBLOT3、0(第四類)

蛋白芯片(微陣列)類試劑蛋白芯片(微陣列):丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒(蛋白芯片法);多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒(蛋白芯片法)每張芯片檢測(cè)48個(gè)樣本，每個(gè)樣本同時(shí)檢測(cè)5個(gè)指標(biāo)，

丙型肝炎病毒分片斷抗體檢測(cè)蛋白芯片NS4NS4NS3NS3CC總總NS5NS5（C代表核心,NS3,NS4,NS5代表非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原）陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照空白對(duì)照(第五類)

單抗類試劑血型定型類試劑:血型定型試劑盒(單克隆抗體)免疫組化:ImmuChem免疫組化試劑盒(單抗)免疫比濁:血清載脂蛋白A1免疫比濁試劑盒乳膠凝集:D-dimer二聚體乳膠凝集試劑盒(第六類)

多抗類試劑血型定型類試劑:血型定型試劑盒(人血清/馬血清)免疫組化:癌胚抗原檢測(cè)試劑盒(多抗)免疫比濁:β-微球蛋白測(cè)定試劑盒(免疫比濁法)乳膠凝集:沙門氏菌乳膠凝集試劑盒抗原抗原:指進(jìn)入有免疫活性得組織(宿主)而引發(fā)免疫應(yīng)答得物質(zhì)?；螂m不能引發(fā)免疫,但可以同抗體結(jié)合得物質(zhì)。蛋白質(zhì),多糖,核酸,糖脂,青霉素全抗原性具有多個(gè)抗原決定族抗體宿主對(duì)體內(nèi)存在得外來(lái)分子,微生物或其她因子得應(yīng)答而產(chǎn)生得蛋白質(zhì)(免疫球蛋白,丙種球蛋白)根據(jù)抗體性質(zhì):多克隆抗體,單克隆抗體根據(jù)抗體分子結(jié)構(gòu):IgA,D,E,G,MIgGIgM抗體模式圖單克隆抗體由一株淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,針對(duì)一種抗原決定族抗原免疫小鼠-取脾臟-與瘤細(xì)胞融合-克隆篩選-單克隆抗體細(xì)胞株擴(kuò)增細(xì)胞-注射入小鼠腹腔-采腹水-純化抗體流程雜交瘤技術(shù)多克隆抗體針對(duì)多個(gè)抗原決定族抗原免疫動(dòng)物-采集動(dòng)物血清純化抗體血型抗原/RBC抗體/外周血

AAanti-B

BBanti-A

O noneanti-A&anti-B

ABA&BnoneABO血型測(cè)定空氣柱微柱玻璃珠反應(yīng)艙試劑結(jié)果判讀(第七類)

診斷血清(菌液)診斷血清:侵襲性大腸埃希氏菌診斷血清;志賀氏菌屬四種混合多價(jià)血清診斷菌液:傷寒沙門菌菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原診斷菌液診斷血清工藝流程采集血清收集抗體(離心機(jī))效價(jià)檢測(cè)等分裝、凍干免疫動(dòng)物免疫抗原制備分離血清滅活處理吸收非特異性抗體吸收用抗原制備診斷菌液工藝流程效價(jià)檢測(cè)等分裝、包裝細(xì)菌培養(yǎng)滅活處理(第八類)

血球凝集類試劑抗體致敏血球:破傷風(fēng)抗體診斷試劑(血凝法);白喉抗體診斷試劑(血凝法)間接凝集試驗(yàn)示意圖+

用可溶性抗原致敏紅細(xì)胞或其她顆粒性介質(zhì),可以用來(lái)測(cè)定細(xì)菌、病毒等微生物得抗體。間接血凝試劑基本生產(chǎn)工藝流程醛化紅細(xì)胞得制備致敏抗原或抗體得制備紅細(xì)胞得采集致敏抗原(或抗體)得制備紅細(xì)胞得醛化(洗滌、離心、醛化)致敏抗原(或抗體)得檢定對(duì)照血球得制備紅細(xì)胞得致敏(鞣化、致敏、封閉)稀釋液得制備半成品檢定分裝、凍干、包裝成品檢定(第九類)

核酸擴(kuò)增類試劑熒光PCR:乙型肝炎病毒核酸定量測(cè)定試劑盒PCR-ELISA:結(jié)核分支桿菌檢測(cè)試劑盒(核酸擴(kuò)增酶聯(lián)免疫法)PCR-毛細(xì)管電泳:性染色體多倍體(分型與突變)檢測(cè)試劑盒;PCR-電泳:α-地中海貧血基因診斷試劑盒(gap-PCR法)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA):沙眼衣原體與結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒PCR基本原理示意圖PCR過(guò)氧化物酶聯(lián)物96孔酶標(biāo)法加樣分析觀察數(shù)據(jù)PCR產(chǎn)物得檢測(cè)

96孔酶標(biāo)法

Taqman法得原理Polymerization5‘5‘3‘3‘5‘ForwardPrimer5‘ReversePrimerStrandDisplacement5‘5‘3‘3‘5‘5‘P3‘RQRQProbeP3‘RQCleavage5‘5‘3‘3‘5‘5‘P3‘RQPolymerizationpleted5‘5‘3‘3‘5‘5‘P3‘RQReporterQuencherContinuouscyclingDegradeRNAwithRNaseHactivityandprimer2hybridizesChironProcleixHIV-1/HCVAssay

Step2:Transcription-MediatedAmplificationRNAtranscriptionbyRNApolymeraseRNAamplificationproductIsothermalincubation>109foldamplificationinonehourcDNAsynthesisbyreversetranscriptaseDNAsynthesisbyreversetranscriptaseTargetRNAPromoter-primerhybridizes(第十類)

基因芯片(微陣列)類試劑基因芯片(微陣列):α-地中海貧血基因芯片診斷試劑盒PCR-雜交:人乳頭瘤病毒基因分型檢測(cè)試劑盒(PCR-反向雜交法)基因芯片法聯(lián)合檢測(cè)HBVDNA－HCVRNA

乙型肝炎病毒基因多態(tài)性檢測(cè)芯片芯片外觀及點(diǎn)樣區(qū)示意圖如上:點(diǎn)陣信息:點(diǎn)陣信息:A1:1896野生型B1:1896突變型A2:1814野生型B2:1814突變型A3:1762野生型B3:1762突變型A4:1764野生型B4:1764突變型A5:P區(qū)528位野生型B5:P區(qū)528位突變型A6:P區(qū)552位野生型B6:P區(qū)552位突變型A7:P區(qū)552位突變型B7:陰性參照Ⅱ

檢測(cè)結(jié)果圖

1762/64位點(diǎn)聯(lián)合變異丙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)

芯片示意圖Ⅰ:陽(yáng)性內(nèi)參照I;Ⅱ:陰性內(nèi)參照I;Ⅲ:陽(yáng)性內(nèi)參照II;Ⅳ:陰性內(nèi)參照II。

A1:I型B1:I型A2:1a/2aB2:1a/1bA3:1bB3:1bA4:II型B4:II型A5:2aB5:2aA6:3a/3bB6:3bA7:3bB7:6aA8:陰性A8:陰性

丙型肝炎病毒基因分型芯片示意圖(第十一類)

探針?lè)糯?原位雜交)類試劑bDNA類:HIV-1bDNA檢測(cè)試劑盒;mRNA檢測(cè)試劑盒(生物素原位雜交法)探針?lè)糯箢愒噭?-支鏈DNA技術(shù)病毒得RNA釋放后加入微孔板中——板孔中包被有可與病毒特異結(jié)合得一系列靶探針(TargetProbe),另一系列靶探針得一端可標(biāo)記在游離得病毒核酸鏈上,另一端可與bDNA結(jié)合——bDNA信號(hào)放大——加入酶標(biāo)記物對(duì)結(jié)合得bDNA進(jìn)行標(biāo)記——經(jīng)過(guò)清洗后加入底物進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定反應(yīng)強(qiáng)度。(第十二類)

普通生化類試劑(十萬(wàn)級(jí)要求)(包括酶類化學(xué)試劑、凝血試劑類等試劑)酶類化學(xué)試劑:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒;堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒凝血試劑:凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定試劑盒;組織纖溶酶原激活物(t-PT)測(cè)定試劑盒普通生化類試劑(十萬(wàn)級(jí)要求)(1)★原理:臨床普通生