基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案

【基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案】緒論、基因工程基礎(chǔ)一、填空題1.基因工程是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的遺傳學(xué)的一個(gè)分支學(xué)科?；蚬こ碳夹g(shù)的誕生使人們從簡(jiǎn)單地利用現(xiàn)存的生物資源進(jìn)行諸如發(fā)酵、釀酒、制醋和醬油等傳統(tǒng)的生物技術(shù)時(shí)代，走向按人們的需要定向地改造和創(chuàng)造具有新的遺傳性品種的時(shí)代。2．Cohen等在1973年構(gòu)建了第一個(gè)有功能的重組DNA分子。3．基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是：（1）分子水平上的操作，（2）細(xì)胞水平上的表達(dá)。4．基因克隆中三個(gè)基本要點(diǎn)是：克隆基因的類(lèi)型、受體的選擇和載體的選擇。5．克隆基因的主要目的有四個(gè)：①擴(kuò)增DNA；②獲得基因產(chǎn)物；③研究基因的表達(dá)調(diào)控；④改造生物的遺傳特性。6．基因工程的基本程序包括DNA制備、體外DNA重組、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選等方面。7．基因工程又稱(chēng)重組DNA技術(shù)/基因操作技術(shù)/基因克隆/分子克隆/遺傳修飾/新遺傳學(xué)。8．克隆的進(jìn)行依賴于各種參與DNA新陳代謝的酶的使用，它們主要是從原核細(xì)胞中分離的。限制性內(nèi)切核酸酶能夠?qū)NA切割成特定大小的片段。各種各樣的DNA聚合酶也是克隆所必需的，包括將RNA轉(zhuǎn)錄出單鏈DNA的反轉(zhuǎn)錄酶。DNA連接酶用于連接限制性片段。克隆也需要來(lái)源于微生物的DNA序列，包括用來(lái)運(yùn)載被被克隆DNA的克隆載體。質(zhì)粒載體來(lái)源于天然細(xì)菌質(zhì)粒，通常攜帶有抗生素抗性基因。其他載體來(lái)源于噬菌體，如λ噬菌體，它們經(jīng)過(guò)修飾后可以運(yùn)輸外源DNA。要想克隆一個(gè)感興趣的真核生物的基因就必須先制作一個(gè)能與該基因雜交的探針。人們已經(jīng)發(fā)展了很多有效而精細(xì)的技術(shù)來(lái)分析克隆的DNA。例如，極微量的DNA片段可以通過(guò)PCR得到擴(kuò)增。在感興趣基因的啟動(dòng)子上連接，如CAT或LacZ之類(lèi)的報(bào)告基因能夠定量檢測(cè)基因的活性。二、選項(xiàng)題（單選或多選）1．因研究重組DNA技術(shù)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是（C）。A.KornbergAB.GilbertWC.BergPD.McClintock2．第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是（A）。A.EcoRIB.EcoBC.EcoCD.EcoRII3.靶（目的）基因通常是指（A）。A、擬進(jìn)行研究或利用的基因B、人工合成的基因C、載體DNA分子D、具有編碼序列的DNA分子三、判斷題1．利用噬菌體或動(dòng)物病毒作為載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)移。錯(cuò)誤，為轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒DNA為轉(zhuǎn)化2．BergP的創(chuàng)造性的工作是在體外構(gòu)建了重組DNA分子，所用的載體是一種具有復(fù)制能力的細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒。錯(cuò)誤，用的是動(dòng)物病毒DNA（猿猴病毒SV40）3．克隆即無(wú)性繁殖的意思。通過(guò)克隆可以在無(wú)性的條件下獲得遺傳結(jié)構(gòu)和表型完全相同的一群個(gè)體。錯(cuò)誤，不嚴(yán)謹(jǐn)，對(duì)分子可以，對(duì)細(xì)胞或個(gè)體不一定4．催生基因工程技術(shù)誕生的關(guān)鍵技術(shù)是DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。錯(cuò)誤，II型酶的分離純化四、問(wèn)答題1．為什么說(shuō)基因工程是在上世紀(jì)70年代初起發(fā)展起來(lái)的？答：這是因?yàn)椋孩?967年發(fā)現(xiàn)了連接酶；②大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)于1970年獲得突破；③限制性內(nèi)切核酸酶的分離始于1970年；④Berg在1972年構(gòu)建了第一個(gè)重組的DNA分子。2．基因工程操作的基本步驟是什么？①施工材料的準(zhǔn)備，即目的基因、載體、工具酶和受體細(xì)胞（宿主）的準(zhǔn)備。用限制性內(nèi)切酶分別將外源DNA和載體分子切開(kāi)。（切）②目的基因與載體DNA的體外重組，形成重組DNA分子。（接）③把重組的DNA分子引入受體細(xì)胞，并建立起無(wú)性繁殖系。（轉(zhuǎn)和擴(kuò)）④篩選出所需要的無(wú)性繁殖系，并保證外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳、正確表達(dá)。（檢）3．如何理解基因工程的兩個(gè)特點(diǎn)？答：基因工程的兩個(gè)基本特點(diǎn)是分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)。分子水平的操作包括DNA分離、切割和連接（還有其他一些DNA的修飾等）。由于體外重組DNA的最終目的是要改變生物的遺傳性，所以分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)是基因工程的兩個(gè)最基本的特點(diǎn)。4．什么是動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器？答：能夠分泌乳汁的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)其他來(lái)源的基因產(chǎn)品，并通過(guò)乳腺分泌出來(lái)。5．基因克隆是如何使含有單個(gè)基因的DNA片段得到純化的？答：大分子質(zhì)量的DNA會(huì)含有許多特殊限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點(diǎn)，因此用一種限制酶處理一完整染色體或整個(gè)基因組會(huì)產(chǎn)生許多不同的DNA片段，每一個(gè)片段帶有基因組的一個(gè)不同的基因或一個(gè)不同的小片段。當(dāng)全部片段與用同種限制酶處理過(guò)的載體分子混合時(shí)（如圖所示），每個(gè)片段將插入一個(gè)不同的載體分子(如一個(gè)質(zhì)粒)。同樣地，當(dāng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，每個(gè)宿主細(xì)胞將只接收一個(gè)質(zhì)粒DNA分子，而篩選出的含重組質(zhì)粒的每個(gè)菌落實(shí)際上會(huì)含有某一特異的供體DNA片段的多個(gè)拷貝。一旦帶有待研究的特定基因的克隆被確認(rèn)了，此重組DNA分子可從宿主細(xì)胞中提取出來(lái)進(jìn)行純化。6．比較遺傳工程、基因工程和生物技術(shù)。答：遺傳工程是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門(mén)技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計(jì)思想，在離體條件下，對(duì)生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作，以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工程的概念有廣義和狹義之分。狹義的遺傳工程就是指基因工程?；蚬こ蹋╣eneengineering）又稱(chēng)基因操作（genemanipulation）、重組DNA（recombinantDNA）。基因工程是以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。生物技術(shù)又稱(chēng)生物工藝學(xué)，生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營(yíng)和開(kāi)發(fā)微生物、動(dòng)植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分，進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來(lái)提供商品或社會(huì)服務(wù)的一門(mén)綜合性科學(xué)技術(shù)。它包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等。限制內(nèi)切核酸酶一、填空題1．基因工程中把那些具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱(chēng)為限制性內(nèi)切核酸酶。2．通過(guò)比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的限制酶切圖譜。3．II類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶分子質(zhì)量較小，一般在20～40kDa。這類(lèi)酶的專(zhuān)一性強(qiáng)，它不僅對(duì)酶切點(diǎn)鄰近的兩個(gè)堿基有嚴(yán)格要求，而且對(duì)更遠(yuǎn)的堿基也有要求，因此，II類(lèi)酶既具有切割位點(diǎn)的專(zhuān)一性，也具有識(shí)別位點(diǎn)的專(zhuān)一性，一般在識(shí)別序列內(nèi)切割。切割的方式有平切和交錯(cuò)切，產(chǎn)生平末端的DNA片段或突出黏性末端的DNA片段。作用時(shí)需要Mg2+作輔助因子，但不需要ATP和SAM。4.完全的回文序列具有兩個(gè)基本的特點(diǎn)：①能夠在中間劃一個(gè)對(duì)稱(chēng)軸，兩側(cè)的序列兩兩對(duì)稱(chēng)互補(bǔ)配對(duì)；②兩條互補(bǔ)鏈的5’→3’的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180°，則兩條鏈重疊。5．II類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶一般識(shí)別4～6個(gè)堿基，也有識(shí)別多序列的限制性內(nèi)切核酸酶。6．個(gè)體之間DNA限制性片段長(zhǎng)度的差異叫限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。7．限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個(gè)大寫(xiě)字母取自屬名的第一個(gè)字母，第二、三兩個(gè)字母取自種名的前兩個(gè)字母，第四個(gè)字母則用菌株名表示。8．限制性內(nèi)切核酸酶AcyI識(shí)別的序列是5’-GRCGYG-3’，其中R代表A或者T，Y代表G或者C。9．在酶切反應(yīng)管加完各種反應(yīng)物后，需要離心幾秒鐘，其目的是混合均勻和防止部分酶切。10．基因組DNA分子部分酶切消化可采取的措施有：①減少酶量；②縮短反應(yīng)時(shí)間；③增大反應(yīng)體積等。11．第一個(gè)分離得到的限制性內(nèi)切核酸酶是EcoK，而第一個(gè)用于構(gòu)建重組DNA分子的限制性內(nèi)切核酸酶是EcoRI。12．限制性內(nèi)切核酸酶BsuRI和HaeIII的來(lái)源不同，但識(shí)別的序列都是GGCC,，因此他們屬于同裂酶。13．由于DNA是由四種堿基組成的，所以任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應(yīng)該是4n。14．部分酶切是指控制反應(yīng)條件，使得酶在DNA序列上的識(shí)別位點(diǎn)只有部分得到切割，它的理論依據(jù)是酶切速度是不均衡的。15．I類(lèi)限制酶識(shí)別DNA的位點(diǎn)和切割的DNA位點(diǎn)是不同的，切割位點(diǎn)的識(shí)別結(jié)合有兩種模型，一種是限制酶移動(dòng)，另一種是DNA彎曲。16．限制性內(nèi)切核酸酶通常保存在50%濃度的甘油溶液中。二、選項(xiàng)題（單選或多選）1．關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有(B)不太恰當(dāng)。A．由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成B．這一系統(tǒng)中的核酸酶都是II類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶C．這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過(guò)甲基化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾D．不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制--修飾系統(tǒng)2．RFLP產(chǎn)生自(C)。A．使用不同的限制性內(nèi)切核酸酶B．每種類(lèi)型的染色體有兩條(二倍體)C．DNA序列中堿基的隨機(jī)變化D．Southern印跡E．不同探針的使用3．II類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶(B)。A．有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列B．僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供C．限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列D．有外切核酸酶和甲基化酶活性E．僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供4．III型限制性內(nèi)切核酸酶(C)。A．由兩個(gè)亞基組成，僅識(shí)別半甲基化位點(diǎn)。甲基化位點(diǎn)相對(duì)于限制位點(diǎn)的位置（上游或下游）決定了DNA是被甲基化還是被限制B．不同亞基的識(shí)別位點(diǎn)甲基化和限制活性相互排斥：MS亞基促使甲基化，R亞基促使限制C．由兩個(gè)亞基組成，在識(shí)別位點(diǎn)附近識(shí)別并進(jìn)行甲基化或限制D．在錯(cuò)配修復(fù)中起關(guān)鍵作用，因?yàn)槊附Y(jié)合到DNA上是以結(jié)構(gòu)扭曲為基礎(chǔ)而不是序列錯(cuò)誤識(shí)別5．分析限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA所得到的DNA片段的長(zhǎng)度有助于物理作圖，這是因?yàn)?C)。A．即使只用一種限制酶，因?yàn)镈NA是線性的，所以也可以迅速確定限制性片段序列B．內(nèi)切核酸酶在等距離位點(diǎn)切割DNA，同時(shí)對(duì)于每個(gè)生物體的長(zhǎng)度是特異的C、DNA的線性意味著單限制酶切片段的長(zhǎng)度之和等于DNA的總長(zhǎng)，而雙酶切產(chǎn)生的重疊片段則產(chǎn)生模糊的圖譜D．這些內(nèi)切核酸酶的消化活性是物種特異的E．這一技術(shù)同時(shí)為核苷酸序列提供了廣泛信息6、通過(guò)限制性片段分析，可以對(duì)等位基因進(jìn)行精確的分析比較，其原因是(BD)。A．限制性內(nèi)切核酸酶只切割兩個(gè)變異等位基因中的一個(gè)B．它利用限制性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記C、一個(gè)特定細(xì)胞中等位基因的核苷酸序列不會(huì)是相同的D．它不依賴于變異等位基因產(chǎn)物的功能E．限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)被限制在DNA的編碼區(qū)域內(nèi)7、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)是(C)。A．用于遺傳的“指紋結(jié)構(gòu)”模式分析的技術(shù)B．二倍體細(xì)胞中的兩個(gè)等位基因限制性圖譜的差別C．物種中的兩個(gè)個(gè)體限制性圖譜間的差別D．兩種物種個(gè)體間的限制性圖譜差別E．兩種酶在單個(gè)染色體上限制性圖譜的差別8.下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的？（BCDE）A.限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶B.限制酶在特異序列（識(shí)別位點(diǎn)）對(duì)DNA進(jìn)行切割C.同一種限制酶切割DNA時(shí)留下的末端序列總是相同的D.一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生黏末端E．一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端9．因研究噬菌體的限制與修飾現(xiàn)象的本質(zhì)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是（C）。A.LederbergJB.ArberWC.SmithHD.SangerF10．第一個(gè)被分離的II類(lèi)酶是(C)。A．EcoKB．HindIIIC．HindIID．EcoB11．雙鏈DNA中一段自我互補(bǔ)的序列被稱(chēng)為回文序列，這種序列一般具有(ABC)特征。A、有對(duì)稱(chēng)軸B．兩條鏈的5’→3’方向的序列相同C．是Ⅱ類(lèi)酶的識(shí)別序列D．可增強(qiáng)基因的表達(dá)12．在下列進(jìn)行DNA部分酶切的條件中，控制哪一項(xiàng)最好?(B)A．反應(yīng)時(shí)間B．酶量C．反應(yīng)體積D．酶反應(yīng)的溫度13．在下列試劑中，哪一種可以螯合Ca2+？(D)A．EDTAB．檸檬酸鈉C．SDSD．EGTA14．BstBI(TT↓CGAA)消化可產(chǎn)生怎樣的末端?(C)A．含5'CGAA3'序列的黏末端B．含5'CG3'序列的黏末端C．含5'AAGC3'序列的黏末端D．平末端E．含5'GC3'序列的黏末端15．限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別(B)。A．雙鏈DNA的特定堿基對(duì)B．雙鏈DNA的特定堿基序列C．特定的三聯(lián)密碼D．以上都正確16.下面關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的表示方法中，正確的一項(xiàng)是（D）。A.Sau3AIB.E.coRIC.hindIIID.Sau3AI17．限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指(A)。A.在非常規(guī)條件下，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性B．活性大大提高C．切割速度大大加快D．識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同18．下面哪一種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因?(D)A．甘油含量過(guò)高B．反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑C．含有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子D．酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低19.DNA被某種酶切割后，電泳得到的電泳帶有些擴(kuò)散，下列原因中，哪一項(xiàng)不太可能？(A)A．酶失活B．蛋白質(zhì)(如BSA)同DNA結(jié)合C．酶切條件不合適D．有外切核酸酶污染20．關(guān)于回文序列，下列各項(xiàng)中(ABC)是不正確的。A．是限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列B．是某些蛋白質(zhì)的識(shí)別序列C．是基因的旁側(cè)序列D．是高度重復(fù)序列21．為什么使用限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行部分酶切？(E)A．為了產(chǎn)生平末端B．為了產(chǎn)生黏末端C．只切割一條鏈上的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生開(kāi)環(huán)分子D．可得到比完全酶切的片段略短的產(chǎn)物E．可得到比完全酶切的片段略長(zhǎng)的產(chǎn)物22.BamHI、XbaI、BglII的識(shí)別位點(diǎn)分別是：G↓GATCC、T↓CTAGA、A↓GATCT，哪些酶切結(jié)果可產(chǎn)生互補(bǔ)的末端?(C)A．以上幾種酶切結(jié)果產(chǎn)生的末端都可互補(bǔ)B．產(chǎn)生的末端都不能互補(bǔ)C．僅BamHI與BglII的酶切末端互補(bǔ)D．僅BamHI與XbaI的酶切末端互補(bǔ)E．僅XbaI與BglII的酶切末端互補(bǔ)23．從細(xì)菌中分離基因組DNA，經(jīng)過(guò)識(shí)別GAATTC序列的6堿基酶長(zhǎng)時(shí)間消化后，發(fā)現(xiàn)DNA分子未被切動(dòng)，基因組大小為4Mb，造成該結(jié)果的原因是什么?(C)A．基因組中沒(méi)有GB．基因組中沒(méi)有AC．該細(xì)菌的DNA已經(jīng)過(guò)甲基化修飾D．所有酶切位點(diǎn)都位于基因內(nèi)，而該限制性內(nèi)切核酸酶不作用于基因內(nèi)E．所有酶切位點(diǎn)都位于啟動(dòng)子及調(diào)控區(qū)內(nèi)，而該限制性內(nèi)切核酸酶只作用于基因內(nèi)24.關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的來(lái)源及其天然存在的意義，下列哪種說(shuō)法是正確的?(D)A．來(lái)自噬菌體，用于復(fù)制病毒DNAB．來(lái)自噬菌體，具有抗微生物作用C．來(lái)自酵母菌，參與DNA復(fù)制D．來(lái)自細(xì)菌，有防御病毒侵染的意義E．是細(xì)菌內(nèi)的DNA復(fù)制酶25.識(shí)別10堿基序列的限制酶，大約每隔(A)進(jìn)行一次切割。A．4l0B．104C．2l0D．102E．24三、判斷題1．限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護(hù)體系，它是通過(guò)對(duì)外源DNA的修飾和對(duì)自身DNA的限制實(shí)現(xiàn)的。錯(cuò)誤，正相反2．限制性內(nèi)切核酸酶在DNA中的識(shí)別／切割位點(diǎn)的二級(jí)／三級(jí)結(jié)構(gòu)也影響酶切效率。一般來(lái)說(shuō)，完全切割質(zhì)?；虿《綝NA，要比切割線狀DNA需要更多的酶，最高的需要20倍。正確3．如果限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影響切割，如HpaII和MboI要求識(shí)別序列之前至少有一個(gè)堿基對(duì)存在才能切割。正確4．能夠產(chǎn)生防御病毒侵染的限制性內(nèi)切核酸酶的細(xì)菌，其本身的基因組中沒(méi)有被該核酸酶識(shí)別的序列。正確5．限制性圖譜與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)圖譜的最顯著的區(qū)別在于前者是一個(gè)物理圖譜而后者是一個(gè)連鎖圖。正確6．用限制性內(nèi)切核酸酶HaeIII分別切割載體DNA和供體DNA后，可用E．coliDNA連接酶進(jìn)行連接。錯(cuò)誤，HaeIII產(chǎn)生平末端，此酶不能連接平末端7．已知某一內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA上有三個(gè)切點(diǎn)，因此，用此酶切割該環(huán)狀DNA，可得到三個(gè)片段。正確8．迄今所發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶既能作用于雙鏈DNA，又能作用于單鏈DNA。錯(cuò)誤9．基因工程中使用的II類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶不僅有內(nèi)切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。錯(cuò)誤，II型無(wú)甲基化活性10．DNA多態(tài)性就是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。錯(cuò)誤，RFLP只是DNA多態(tài)性一部分11．甘油會(huì)使許多限制性內(nèi)切核酸酶的特異性發(fā)生改變，這是導(dǎo)致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的辦法是在酶切反應(yīng)體系中，將甘油的濃度控制在5％以下。正確12．具有EcoRII末端的外源片段只能以一個(gè)方向插入到EcoRII末端的載體中。正確，↓CCWGG，W=A或T？13．從EscherichiacoliK中分離的限制性內(nèi)切核酸酶命名為E．coK。錯(cuò)誤，EcoK14．同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割靶DNA,得到的片段的兩個(gè)末端都是相同的。錯(cuò)誤，如果識(shí)別的不是完整的回文序列，末端不同15．在限制與修飾系統(tǒng)中，修飾主要是甲基化作用，一旦位點(diǎn)被甲基化了，其他的限制酶就不能切割了。錯(cuò)誤，甲基化不能被同一系統(tǒng)限制酶識(shí)別16．稀有酶是指那些識(shí)別序列很長(zhǎng)又不常用的限制性內(nèi)切核酸酶。錯(cuò)誤，指在某種事物基因組DNA中切割頻率很低的酶17．EGTA是鎂離子螯合劑，加入反應(yīng)液后，可以抑制所有需要鎂離子作為輔助因子的酶活性。錯(cuò)誤，是鈣離子螯合劑，可抑制需鈣離子作為輔助因子的酶活性，如Bal31四．問(wèn)答題（一）簡(jiǎn)答1．現(xiàn)分離到ΦX82噬菌體的—個(gè)突變型，它同野生型的噬菌斑相當(dāng)不同，并已分離到這兩種噬菌體的DNA。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，初步鑒定是點(diǎn)突變、插入突變還是缺失突變?提示：用RFLP方法。2．說(shuō)明SangerDNA測(cè)序法的原理。答：SangerDNA測(cè)序法建立在兩個(gè)基本原理之上：①核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合；②可延伸的引物必須能提供游離的3’羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3’羥基末端，因此會(huì)終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。如果分別用四種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會(huì)獲得四組長(zhǎng)度不同的DNA片段。通過(guò)比較所有DNA片段的長(zhǎng)度可以得知核苷酸的序列。3．在酶切反應(yīng)緩沖液中加入BSA的目的是什么？機(jī)制是什么？答：目的是保護(hù)酶的活性，機(jī)制是通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止酶的失活。4．某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因。答：鹽離子濃度不對(duì)，溫度不對(duì)，甘油濃度過(guò)高。5．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一個(gè)6bp的II類(lèi)限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么？答：回文序列是5’-CATATG-3’。6．下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)（哪些）最有可能是II類(lèi)酶的識(shí)別序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？為什么？答：GATATC和AAATTT，因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?．用Klenow酶填補(bǔ)的辦法可使5'黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端。這種方法常使DNA上的某些限制酶的識(shí)別位點(diǎn)消失。請(qǐng)問(wèn)，對(duì)于下列限制酶，用這種方法處理會(huì)不會(huì)使它們的識(shí)別序列都消失？BamHI(G↓GATCC)、TaqI(T↓CGA)、BssHII(G↓CGCGC)。答：BssHII不會(huì)。8．當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?答：注意星號(hào)活性；先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星號(hào)活性，或使用通用緩沖液。9．什么是同裂酶？什么是同尾酶？10．何謂限制性物理圖譜？答：限制性物理圖譜即限制性內(nèi)切核酸酶作圖(restrictionmapping)。簡(jiǎn)單地說(shuō)就是DNA分子中限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的定位，即DNA分子中各種不同限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的線性排列圖。標(biāo)明限制酶在DNA分子上的限制性位點(diǎn)的數(shù)目、限制性片段大小及其線性排列的順序。（二）問(wèn)答1．什么是細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng)(RestrictionModificationSystem，R-Msystem)?答：細(xì)菌中有作用于同一DNA的兩種酶，即分解DNA的限制酶和改變DNA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。而且，這兩種酶作用于同一DNA的相同部位，把這兩種酶所組成的系統(tǒng)稱(chēng)為限制與修飾系統(tǒng)。2．細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng)有什么意義?答：不同種的細(xì)菌或不同的細(xì)菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng)。修飾的本質(zhì)是通過(guò)甲基化酶將DNA中某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，由于宿主自身DNA上的這些位點(diǎn)進(jìn)行了修飾，限制酶就不能進(jìn)行切割。而外來(lái)的DNA在相應(yīng)的堿基上沒(méi)有被甲基化，宿主的限制酶通過(guò)對(duì)該位點(diǎn)的識(shí)別來(lái)分辨敵我，并將入侵的外來(lái)DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修飾作用為細(xì)胞提供了保護(hù)。3．說(shuō)明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答：基本原則：屬名+種名+株名十序號(hào)。①首字母：取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫(xiě)。第二個(gè)字母：取種名的第一個(gè)字母，斜體小寫(xiě)。第三個(gè)字母：取種名的第二個(gè)字母，斜體小寫(xiě)。第四個(gè)字母：若有株名，株名則作為第四個(gè)字母，用正體。②順序號(hào)：若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、II、III等，用正體。③所有的限制酶，前面還應(yīng)帶有系統(tǒng)的名稱(chēng),如限制性核酸內(nèi)切酶R.HindIII。修飾酶則在前面加上甲基轉(zhuǎn)移酶M，如甲基轉(zhuǎn)移酶M.HindIII。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，R可被省去。4．何謂限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率?答：切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA分子中預(yù)測(cè)的切點(diǎn)數(shù)。由于DNA是由四種類(lèi)型的單核苷酸組成，假定DNA的堿基組成是均一的，而限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，那么對(duì)于任何一種限制酶的切割頻率，理論上應(yīng)為1／4n，n表示該限制酶識(shí)別的堿基數(shù)。如識(shí)別4個(gè)堿基的限制酶，其切割頻率應(yīng)為每256個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別序列和切點(diǎn)（1／44=1／256），識(shí)別5個(gè)堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每1024個(gè)堿基有一個(gè)識(shí)別序列和切點(diǎn)，余類(lèi)推。5．什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性？受哪些因素的影響?答：II類(lèi)限制酶雖然識(shí)別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來(lái)的特異性。條件發(fā)生改變，限制酶的特異性就會(huì)松動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變。改變后的活性通常稱(chēng)第二活性，而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因此第二活性又稱(chēng)為星號(hào)活性。誘發(fā)星號(hào)活性的因素有如下幾種：①高甘油含量(＞5％，v／v)；②限制性內(nèi)切核酸酶用量過(guò)高(＞100U／gDNA)；③低離子強(qiáng)度(＜25mmol／L)；④高pH(8．0以上)；⑤含有有機(jī)溶劑，如DMSO、乙醇等；⑥有非Mg2+的二價(jià)陽(yáng)離子存在（如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等）。6．雙酶消化法（doubledigest）繪制限制性內(nèi)切核酸酶酶譜的原理是什么?答：雙酶消化法是繪制DNA中兩個(gè)或兩個(gè)以上限制性內(nèi)切核酸酶圖譜所采用的方法。做法是在兩個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶分別單獨(dú)消化DNA分子的基礎(chǔ)上，再用這兩個(gè)酶同時(shí)或先后消化DNA，根據(jù)它們的結(jié)果構(gòu)建物理圖譜。7．什么是DNA多態(tài)性(DNApolymorphism)?答：在正常人群中，各個(gè)體DNA分子的某些位點(diǎn)可以發(fā)生中性改變，這些改變雖然會(huì)使DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化，但不影響基因的表達(dá)，如果這種中性突變?cè)谌巳褐械念l率不低于1％，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為多態(tài)性。DNA多態(tài)性本質(zhì)上是染色體DNA中核苷酸數(shù)目或排列順序的個(gè)體差異，這些差異多數(shù)為中性突變，不引起表型改變。8．什么是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)？答：當(dāng)DNA序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，或當(dāng)DNA片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶解后，其片段長(zhǎng)度的改變可以經(jīng)凝膠電泳區(qū)分時(shí)，DNA多態(tài)性就可應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行分析，這種多態(tài)性稱(chēng)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)。9．計(jì)算下列三種酶各自在某染色體DNA序列上識(shí)別位點(diǎn)間的平均距離：AluI：5’AGCT3，EcoRI:5’GAATTC3’3’TCGA5，3’CTTAGG5’AcyI：5’GPuCGPyC3’3’CPyGCPuG5’(注：Py=任何一種嘧啶；Pu=任何一種嘌呤)答：AluI：(1／4)4=1／256EcoRI：(1／4)6=1／4096AcyI：(1／4)4(1／2)2=1／102410．何為回文序列？答：回文序列（palindromicsequence）是一段自我互補(bǔ)的序列，即同其互補(bǔ)鏈一樣的序列（兩者的閱讀方向都是從5’→3，)。根據(jù)回文序列的結(jié)構(gòu)可分為：完全的回文序列、不完全的回文序列和間斷的回文序列。完全回文序列（如GAATTC），通常是限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列；不完全的回文序列（如TACCTCCAT,CGTGATA），常是其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)(如阻抑蛋白)，在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用；間斷的回文序列（如GGTTXXXAACC，有一段是顛倒的重復(fù)），它可使單鏈的核苷酸有可能在tRNA中所見(jiàn)到的一樣，形成發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)。聚合酶與修飾酶一、填空題1、連接酶（ligase）是一類(lèi)用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵的核酸合成酶。2．原核生物主要有兩種類(lèi)型的DNA連接酶：E．coliDNA連接酶和T4DNA連接酶?；蚬こ讨惺褂玫闹饕荰4DNA連接酶，它是從T4噬菌體感染的E．coli中分離的一種單鏈多肽酶，分子質(zhì)量為68kDa，由T4噬菌體基因30編碼。E．coliDNA連接酶是由大腸桿菌基因51編碼，也是一條多肽鏈的單體，分子質(zhì)量為74kDa。這兩種DNA連接酶有兩個(gè)重要的差異：①它們?cè)诖呋磻?yīng)中所用的能量來(lái)源不同，T4DNA連接酶用ATP，而E．coliDNA連接酶則用NAD+作為能源；②它們催化平末端連接的能力不同，在正常情況下只有T4DNA連接酶能夠連接平末端，E．coliDNA連接酶則不能。即使是調(diào)整反應(yīng)條件，E．coliDNA連接酶催化平末端的連接效率也只有T4DNA連接酶的1/10。3.從小牛胸腺中分離純化的末端轉(zhuǎn)移酶催化的基本反應(yīng)是將脫氧單核苷酸加到DNA的3’-ON端，同時(shí)釋放出游離的無(wú)機(jī)磷。催化反應(yīng)時(shí)不需要模版，但需要引物，單鏈DNA是最好的引物，單鏈DNA受體的長(zhǎng)度最短需有3個(gè)dNTP。具有3’突出末端的雙鏈DNA也是較好的反應(yīng)底物。二價(jià)離子和DNA末端狀態(tài)對(duì)催化反應(yīng)影響較大，但是用Co2+作為輔助離子，可以催化任何形式的末端（突出的、隱含的、平齊的）加接單核苷酸，但突出的3’端效率較高。以Mn2+／Mg2+作為輔助因子，只能在單鏈DNA或雙鏈DNA的3’突出端加尾。4．DNA聚合酶I的Klenow片段是用枯草桿菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子質(zhì)量為76kDa的大片段，具有兩種酶活性：①5’→3’聚合酶活性；②3’→5’外切核酸酶的活性。5．反轉(zhuǎn)錄酶除具有以DNA和RNA為模板合成DNA的5’→3’合成酶的活性外，還具有四種酶的活性：①5’→3’外切核酸酶活性；②3’→5’外切核酸酶活性；③DNA內(nèi)切酶的活性（Mn2+，切割SCDNA）；④解旋酶的活性。__________6．為了防止DNA的自身環(huán)化，可用堿性磷酸酶脫去雙鏈DNA5’端得磷酸基團(tuán)。7．切口移位(NickTranslation)法標(biāo)記DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶I的5’→3’外切核酸酶和5’→3’聚合酶活性的作用。8．欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)變成平末端的雙鏈形式，通?？刹捎肧1核酸酶切割或DNA聚合酶補(bǔ)平。9．反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA的合成外，還具有核酸水解酶H的作用，可以將DNA-RNA雜種雙鏈中的RNA水解掉。10．DNA連接酶是基因克隆的分子黏合劑，而限制性內(nèi)切核酸酶被譽(yù)為分子克隆的剪刀。二、選項(xiàng)題（單選或多選）1．T4DNA連接酶是從T4噬菌體感染的E．coli中分離的，這種連接酶（B）。A．催化連接反應(yīng)時(shí)既能以ATP又能以NAD作為能量來(lái)源B．既能催化平末端連接又能催化黏性末端連接C.是一種單肽酶，分子質(zhì)量為74kDaD．既能催化單鏈DNA連接又能催化雙鏈DNA連接2．DNA連接酶在體內(nèi)的主要作用是在DNA復(fù)制、修復(fù)中封閉缺口，（A）。A．將雙鏈DNA分子中的5’磷酸基團(tuán)同3'-OH末端重新形成磷酸二酯鍵B．作用時(shí)不消耗能量C．需要Mn2+等二價(jià)輔助離子D．也可以連接RNA分子3．在長(zhǎng)模板鏈的指導(dǎo)下引物延伸合成長(zhǎng)的DNA互補(bǔ)鏈時(shí)應(yīng)選用（D）。A.T4DNA聚合酶B．Klenow酶C．大腸桿菌DNA聚合酶ID．T7DNA聚合酶4．末端轉(zhuǎn)移酶是合成酶類(lèi)，（C）。A．作用時(shí)不需要模板B．在Co2+的存在下，可以在突出的3’端延長(zhǎng)DNA鏈C．在Co2+的存在下，可以在隱蔽的3’端延長(zhǎng)DNA鏈D．上述說(shuō)法有兩種是正確的5．在基因工程中，可用堿性磷酸酶(AB)。A．防止DNA的自身環(huán)化B．同多核苷酸激酶一起進(jìn)行DNA的5’端標(biāo)記C．制備突出的3’端D．上述說(shuō)法都正確6．從E．coli中分離的連接酶(B)。A．需要ATP作輔助因子B．需要NAD作輔助因子C．可以進(jìn)行平末端和黏性末端連接D．作用時(shí)不需要模板7．下列哪一種酶作用時(shí)需要引物?(C)A．限制酶B．末端轉(zhuǎn)移酶C．反轉(zhuǎn)錄酶D．DNA連接酶8．S1核酸酶的功能是(BCD)。A．切割雙鏈的DNAB．切割單鏈的RNAC．切割發(fā)夾環(huán)D．以上有兩項(xiàng)是正確的9．K1enow酶與DNA聚合酶相比，前者喪失了(C)的活性。A．5’→3’合成酶B．3’→5’外切酶C．5’→3’外切酶D．轉(zhuǎn)移酶10．只能從DNA分子的末端水解磷酸二酯鍵使核苷酸解離下來(lái)的酶是(A)。A．核酸外切酶B．核酸內(nèi)切酶C.DNA連接酶D．末端轉(zhuǎn)移酶11．T4噬菌體DNA聚合酶具有兩種活性：聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（作用于3’突出端），因此可使黏末端變成平末端。如DNA片段用一定的限制性內(nèi)切核酸酶處理后，再置于含T4聚合酶及四種三磷酸核苷酸的反應(yīng)體系中，則下面哪種情況可能發(fā)生？(C)A．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，BglII(A↓GATCT)切出的末端被切平B．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，BglII及PvuI(CGAT↓CG)切出的末端被切平C．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，SacII(CCGC↓GG)及PvuI切出的末端被切平D．在聚合酶活性作用下，BglII及PvuI切出的末端被補(bǔ)平E．在聚合酶活性作用下，SacII及PvuI切出的末端被切平12．逆轉(zhuǎn)錄酶也稱(chēng)反轉(zhuǎn)錄酶，是一種(B)。A.依賴于DNA的DNA聚合酶B．依賴于RNA的DNA聚合酶C.依賴于DNA的RNA聚合酶D．DNA聚合酶或RNA聚合酶13．可以在切口部位起作用的酶是(A)。A．S1核酸酶B．外切酶IIIC．λ外切核酸酶D．Bal31核酸酶三、判斷題1．T4DNA連接酶和E．coli連接酶都能催化平末端和黏性末端的連接。錯(cuò)誤，平末端不能2．T4DNA連接酶和E．coli連接酶都能催化雙鏈DNA和單鏈DNA的連接。錯(cuò)誤，都不能催化單鏈連接3．反轉(zhuǎn)錄酶能夠以單鏈RNA或單鏈DNA為模板，在引物的引發(fā)下合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。以RNA為模板合成的DNA是互補(bǔ)DNA(ComplementaryDNA，cDNA)。若是以DNA模板合成DNA，dNTP的摻入速度很低（每秒約5個(gè)核苷酸），是T7DNA聚合酶合成速度的1％。正確4．以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶可同時(shí)產(chǎn)生單鏈和雙鏈的cDNA，雙鏈DNA是由自身引物引導(dǎo)合成。但這種自身引物引導(dǎo)的合成效率遠(yuǎn)低于外加寡核苷酸引物引導(dǎo)的合成。正確5．Bal31核酸酶是Ca2+依賴性的，在反應(yīng)混合物中加入EDTA便可抑制它的活性。錯(cuò)誤，EGTA抑制Ca2+6．當(dāng)一個(gè)DNA結(jié)合蛋白同它識(shí)別的核苷酸序列結(jié)合以后，就保護(hù)了它們的磷酸二酯鍵免遭切割，其結(jié)果，電泳膠上就有明顯可見(jiàn)的空缺帶（與對(duì)照相比），這就是DNA足跡法。正確7．T4DNA連接酶和E．coli連接酶作用時(shí)都需要ATP和NAD+作為輔助因子。錯(cuò)誤，T4連接酶需要ATP，E．coli需NAD+8．多核苷酸激酶之所以能夠用于DNA片段的標(biāo)記，是因?yàn)樗軌驅(qū)蝹€(gè)的32P標(biāo)記的單核苷酸加到每一DNA鏈的5’端。錯(cuò)誤，將ATP上的32P加到9．用同一種酶切割載體和外源DNA得到黏性末端后，為防止它們自身環(huán)化，要用CIP將它們脫磷酸。錯(cuò)誤，不能同時(shí)脫磷酸，一般只將載體脫磷酸10．Nick和Gap的含義是不同的，前者指DNA的單鏈中有較小的缺失，后者僅是斷開(kāi)了一個(gè)磷酸二酯鍵。錯(cuò)誤，正相反四、問(wèn)答題1．DNA連接酶的連接機(jī)理是什么？答：DNA連接酶是利用ATP或NAD+[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵。在連接反應(yīng)中，首先ATP(NAD+)與DNA連接酶反應(yīng)，同連接酶生成一種共價(jià)結(jié)合的酶-AMP復(fù)合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通過(guò)一種磷酸酰胺鍵同DNA連接酶的賴氨酸殘基的ε-氨基相連。同時(shí)釋放出焦磷酸或煙酰胺單核苷酸（NMN）。AMP激活DNA一條鏈的5’-末端磷酸基團(tuán),并轉(zhuǎn)移到磷酸基團(tuán)上，形成DNA-腺苷一磷酸復(fù)合物。最后，3’-OH對(duì)激活的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出AMP。連接反應(yīng)是由在形成酶-腺苷酸復(fù)合體時(shí)，焦磷酸水解和釋放提供的能量驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行的。在以ATP作為能源的連接酶中，一個(gè)磷酸二酯鍵的形成消耗掉兩個(gè)高能磷酸鍵。2．DNA連接酶的作用特點(diǎn)有哪些？①連接反應(yīng)需要在一條DNA鏈的3’末端具有一個(gè)游離的-OH,而另一條DNA鏈的5’末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(-P)的情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用，而在末端帶有5’-羥基和3’-羥基；5’-磷酸和3’-二脫氧核苷基團(tuán)的兩個(gè)DNA片段之間不起連接作用。②連接反應(yīng)中需要ATP或NAD+和Mg2+為輔助因子和激活因子；③DNA連接酶不能夠連接兩條單鏈的DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。④DNA連接酶只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(Nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的裂口（Gap）。3．影響DNA連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些？答：1)反應(yīng)溫度：最佳反應(yīng)溫度37℃，但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，連接黏性末端的最佳溫度，一般認(rèn)為4～20℃比較合適。2)DNA片段末端：不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個(gè)DNA分子的末端有較高的幾率與另一DNA分子連接，減少同一個(gè)分子兩個(gè)末端之間的自身連接。載體與插入片段3：1~1：3。3)連接酶濃度：平末端DNA分子的連接反應(yīng)，最適酶量大約是1～2單位；而黏末端DNA片段間的連接，在同樣的條件下，僅為0.1單位時(shí)，便能得到最佳連接效率。4．什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到的兩個(gè)片段。其中大片段的分子質(zhì)量為75kDa，它具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切核酸酶的活性，小片段具有5’→3’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會(huì)降解5’引物的5’→3’外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修復(fù)反應(yīng)，制備平末端。可用Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5’或3’突出端，制備平末端，這樣可以使原來(lái)具有不相容的黏性末端的DNA片段通過(guò)平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備3’端標(biāo)記的探針。用Klenow酶修復(fù)5’突出端的反應(yīng)主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補(bǔ)反應(yīng)；而修復(fù)3’突出端則是用Klenow酶的3’→5’外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。用Klenow酶的切割反應(yīng)來(lái)修復(fù)3’突出端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。(2)標(biāo)記DNA3’突出端(protrudingend)。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用3’→5’的外切核酸酶活性除去3’突出端，產(chǎn)生3’隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物(32P-dNTP)存在下，使降解3’→5’)作用與聚合(5’→3’)作用達(dá)到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng)(exchange／replacementreaction)。不過(guò)這一反應(yīng)用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3’→5’的外切核酸酶活性較強(qiáng)。(3)其他的一些用途。包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primerextension)制備單鏈DNA探針等。5．堿性磷酸酯酶主要有兩種，細(xì)菌堿性磷酸酯酶（BIP）和小牛腸堿性磷酸酯酶（CIP），二者有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差別是CIP在68℃時(shí)失活，而B(niǎo)AP在68℃穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用：①dsDNA的5’端脫磷酸，防止DNA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去，再進(jìn)行連接反應(yīng)。②DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。6．切口平移法制備DNA探針的原理是什么？答：在Mg離子存在時(shí)，用低濃度的DNA酶I（DNaseI）處理雙鏈DNA，使之隨機(jī)產(chǎn)生單鏈斷裂。然后用DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性可以從斷裂處的5'端除去一個(gè)核苷酸，而其聚合酶活性則將一個(gè)單核苷酸添加到斷裂處的3'端。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，即5'端核苷酸不斷去除，而3'端核苷酸同時(shí)摻入，導(dǎo)致斷裂形成的切口沿著DNA鏈按合成的方向移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為切口平移。如果在反應(yīng)體系中加入放射性同位素標(biāo)記的核苷酸，則這些標(biāo)記的核苷酸將取代原來(lái)的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA分子，用作DNA分子雜交探針。質(zhì)粒及質(zhì)粒載體一、填空題1、基因工程中有三種主要類(lèi)型的載體：質(zhì)粒DNA、病毒DNA、質(zhì)粒和病毒DNA雜合體。2．由于不同構(gòu)型的DNA插入EB的量不同，它們?cè)诃傊悄z電泳中的遷移率也不同。SCDNA的泳動(dòng)速度最快，OCDNA泳動(dòng)速度最慢，LDNA居中，通過(guò)凝膠電泳和EB染色的方法可將不同構(gòu)型的DNA分別開(kāi)來(lái)。3．就克隆一個(gè)基因(DNA片段)來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體也必須包括三個(gè)部分：復(fù)制子（含有復(fù)制起點(diǎn)）、選擇標(biāo)記（主要是抗性基因）、克隆位點(diǎn)（便于外源DNA插入）。另外，一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子質(zhì)量。4．如果兩個(gè)質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于一個(gè)寄主細(xì)胞中，則屬于同一個(gè)不親和群，這是因?yàn)樗鼈兊膹?fù)制機(jī)制相同所致。5．質(zhì)?？截悢?shù)是指細(xì)胞中質(zhì)粒的份數(shù)同染色體的比值，即質(zhì)粒／染色體。6．一個(gè)帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在有EB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，一部分細(xì)胞中已測(cè)不出質(zhì)粒，這種現(xiàn)象叫質(zhì)粒消除（或治愈）。7．pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復(fù)制子來(lái)源于pMB1，它的四環(huán)素抗性基因來(lái)自于pSC101，它的氨芐青霉素抗性基因來(lái)自于pSE2124(R質(zhì)粒)。8．YAC的最大容載能力是1000~2000kb，BAC載體的最大容載能力是300kb。9．把那些沒(méi)有可檢測(cè)表型的質(zhì)粒稱(chēng)為隱蔽性質(zhì)粒。10．pUCl8質(zhì)粒是目前使用較為廣泛的載體。pUC系列的載體是通過(guò)pBR322和M13兩種質(zhì)粒改造而來(lái)。它的復(fù)制子來(lái)自pMB1，Amp抗性基因則是來(lái)自轉(zhuǎn)座子。11．Ti質(zhì)粒是自然界存在的植物基因工程的天然載體。12．既能在E．coli又能在S．cerevisiae中自我復(fù)制的載體DNA稱(chēng)為穿梭載體。二、選項(xiàng)題（單選或多選）1．下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)性質(zhì)的描述中，(C)是不正確的。A．質(zhì)粒的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約，因而有較多的拷貝數(shù)B．可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增C.通常具有較少的拷貝數(shù)D．同嚴(yán)緊型質(zhì)粒整合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復(fù)制子2．基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過(guò)的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載體中只有(B)被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體。A．pBR322B．pSC101C．pUB110D．pUC183．下列哪種克隆載體對(duì)外源DNA的容載量最大？(C)A．質(zhì)粒B．黏粒C．酵母人工染色體(YAC)D．λ噬菌體E．cDNA表達(dá)載體4．松弛型質(zhì)粒（D）。A．在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多B．可用氯霉素?cái)U(kuò)增C．一般沒(méi)有選擇標(biāo)記D．上述A、B兩項(xiàng)正確5．ColEl是惟一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒，這種質(zhì)粒(ACD)。A．是松弛復(fù)制型B．具有四環(huán)素抗性C．能被氯霉素?cái)U(kuò)增D．能產(chǎn)生腸桿菌素6．同一種質(zhì)粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時(shí)它們的遷移速率是(B)。A．OCDNA>SCDNA>LDNAB．SCDNA>LDNA>OCDNAC．LDNA>OCDNA>SCDNAD．SCDNA>OCDNA>LDNA7．關(guān)于穿梭質(zhì)粒載體，下面哪一種說(shuō)法最正確?(B)A．在不同的宿主中具有不同的復(fù)制機(jī)制B．在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制起點(diǎn)C．在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制酶D．在不同的宿主細(xì)胞中具有不同的復(fù)制速率8．Ti質(zhì)粒(ACDE)。A．可從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞中B．作為雙鏈DNA被轉(zhuǎn)移C．在植物中導(dǎo)致腫瘤D．介導(dǎo)冠癭堿的合成，作為細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物和植物的生長(zhǎng)激素E．需要細(xì)菌的vir基因幫助轉(zhuǎn)移F．在植物細(xì)胞中作為染色體外質(zhì)粒9．下列哪些屬于重組DNA分子?(C)A．PCR擴(kuò)增的DNA片段B．單鏈RNA與單鏈DNA雜交得到的產(chǎn)物C．人基因組片段與質(zhì)粒載體連接的產(chǎn)物D．存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的λ噬菌體染色體E．質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶切后的產(chǎn)物10．LacZ基因通常用于構(gòu)建質(zhì)粒載體的目的是什么?(E)A．編碼一種限制性內(nèi)切核酸酶，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞時(shí)用于切割載體B．編碼藍(lán)色色素產(chǎn)物，可用于示蹤轉(zhuǎn)化的細(xì)胞C．編碼一種酶，將RNA轉(zhuǎn)化為DNAD．編碼一種抗生素抗性的酶E．編碼一種可檢測(cè)的酶,當(dāng)基因內(nèi)部的位點(diǎn)插入任何外源片段，ORF遭到破壞時(shí)，產(chǎn)物即不能表達(dá)11．一個(gè)質(zhì)粒含有四環(huán)素抗性基因(tetr)和LacZ基因，tetr內(nèi)有一HindIII位點(diǎn)，LacZ中有一EcoRI位點(diǎn)。如用這兩種切割載體一并連接入相應(yīng)的外源片段，則帶有該重組質(zhì)粒的細(xì)胞將(D)。A．有四環(huán)素抗性，在X-gal平板上呈現(xiàn)藍(lán)色B．對(duì)四環(huán)素敏感，在X-gal平板上呈現(xiàn)藍(lán)色C．有四環(huán)素抗陛，在X-gal平板上呈現(xiàn)白色D．對(duì)四環(huán)素敏感，在X-gal平板上呈現(xiàn)白色12．質(zhì)粒具備下列特征，因此適合作為克隆載體，除了(E)。A．賦予宿主細(xì)胞某種可檢測(cè)的特性B．可通過(guò)一定的純化步驟與宿主細(xì)胞基因組分離C．獨(dú)立復(fù)制的能力D．可復(fù)制自身DNA以及插入的外源DNAE．甲基化防止宿主的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)其降解13．下列對(duì)質(zhì)粒特性描述中，不正確的是(AC)。A．既能以單鏈環(huán)狀又能以雙鏈環(huán)狀的形式存在。B．是獨(dú)立于細(xì)菌染色體DNA以外的復(fù)制子C.沒(méi)有線性的質(zhì)粒DNAD．能夠自我復(fù)制三、判斷題1．迄今發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒DNA都是環(huán)狀的。錯(cuò)誤。鏈霉菌屬質(zhì)粒為線狀2．一個(gè)帶有反向重復(fù)序列的雙鏈DNA經(jīng)變性后，復(fù)性時(shí)其單鏈可形成發(fā)夾環(huán)。正確3．能夠在不同的宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒叫穿梭質(zhì)粒。正確4．任何一種質(zhì)粒都可以用氯霉素?cái)U(kuò)增的方法，增加它的拷貝數(shù)。錯(cuò)誤，對(duì)氯霉素抗性質(zhì)粒不能5．只有完整的復(fù)制子才能進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，一個(gè)失去了復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制子不能進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制。正確6．CsCl-EB密度梯度離心法純化SCDNA的原理是根據(jù)EB可以較多地插入到SCDNA中，因而沉降速度較快。錯(cuò)誤，EB插入SCDNA量少，密度改變較小，離心后停留在較高部位密度小的地方7．質(zhì)粒ColE1同pSC101共整合后，得到的重組質(zhì)粒pSC134，具有兩個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，這兩個(gè)起始點(diǎn)在任何細(xì)胞中都是可以使用的。錯(cuò)誤，一般使用ColE1的復(fù)制起始點(diǎn)8．所謂穿梭質(zhì)粒載體是能夠在兩種以上的不同宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒，所用的復(fù)制起點(diǎn)不同。正確9．一般情況下，質(zhì)粒既可以整合到染色體上，也可以獨(dú)立存在。錯(cuò)誤，主要是獨(dú)立存在10．ColE1是惟一用作基因工程的自然質(zhì)粒載體，它具有四環(huán)素抗性標(biāo)記，因而很容易選擇。錯(cuò)誤，其無(wú)四環(huán)素抗性基因11．某一染色體DNA經(jīng)內(nèi)切酶SalI切割后，產(chǎn)生了若干個(gè)具有黏性末端的DNA片段，將這些片段分別在T4DNA連接酶的作用下自身連接成環(huán)，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，這些片段都可以進(jìn)行獨(dú)立地復(fù)制。錯(cuò)誤，無(wú)復(fù)制子12．基因克隆中，低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體是沒(méi)有用的。錯(cuò)誤，對(duì)有劑量限制的基因克隆需用低拷貝質(zhì)粒載體四、問(wèn)答題1．YAC載體具有什么樣的？為什么在克隆大片段時(shí)，YAC具有優(yōu)越性？答：（1）功能性DNA序列:①來(lái)自于酵母的125bpDNA片段的著絲點(diǎn)序列(CEN4)。②來(lái)自酵母的自主復(fù)制序列(ARS1)，起始在酵母中的DNA復(fù)制。③來(lái)自酵母的端粒序列，它是(5-TGTGGGTGTGGTG-3)的多拷貝重復(fù)，它對(duì)染色體的復(fù)制和維持是必需的。④在酵母中進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是這些基因的營(yíng)養(yǎng)缺陷性，只有帶有這些基因的轉(zhuǎn)化體才能在選擇培養(yǎng)基上生活⑤具有細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。YAC載體通常含有ColE1的ori和氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因，可以在大腸桿菌中復(fù)制和繁殖，所以它也是一種穿梭載體。（2）優(yōu)越性：YAC能夠容納長(zhǎng)達(dá)上千kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)能夠減少完整基因組文庫(kù)所需的克隆數(shù)目。2．列舉質(zhì)粒載體必須具有的基本條件。答：(1)能獨(dú)立復(fù)制；(2)具有選擇標(biāo)記；(3)有獨(dú)特的酶切位點(diǎn)；(4)能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散。3．舉例說(shuō)明什么是穿梭載體？答：穿梭載體是含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒，有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和能在兩種不同細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主(來(lái)回穿梭)。4．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全。進(jìn)行嚴(yán)格地監(jiān)控對(duì)質(zhì)粒載體的安全是十分重要的。請(qǐng)問(wèn)質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾個(gè)方面?答：(1)非傳遞性和不被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。對(duì)于多數(shù)基因克隆操作來(lái)說(shuō)，都不希望載體能夠進(jìn)行自主傳遞，也不希望被帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。(2)具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pJC307(ColE1的衍生質(zhì)粒)在哺乳動(dòng)物正常體溫下就喪失復(fù)制能力，可防止克隆基因擴(kuò)散，只存在于限定的宿主細(xì)胞中。(3)一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因?yàn)橹亟M后有可能給宿主帶來(lái)突變。(4)有較小的宿主范圍。5.什么是YAC？YAC克隆載體常出現(xiàn)哪些問(wèn)題？答：YAC即酵母人工染色體（YeastArtificialChromosome）的縮寫(xiě)，是人工構(gòu)建的染色體樣大容量克隆載體，基本組成有著絲點(diǎn)、能在細(xì)菌和酵母中進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記及端粒。最大DNA克隆片段可達(dá)到2000kb。問(wèn)題有：(1)YAC有嵌合現(xiàn)象，一個(gè)YAC中克隆的DNA片段可能來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)不同的染色體。在基因組文庫(kù)中，嵌合體占克隆總數(shù)的10％～60％。(2)YAC內(nèi)部有重組現(xiàn)象，插入的DNA較大，序列發(fā)生重排，導(dǎo)致和原來(lái)染色體的序列不一致，重組很難檢出。(3)YAC還有缺失現(xiàn)象，影響YAC文庫(kù)的代表性。(4)YAC結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似，使用常規(guī)方法不易將YAC和酵母天然染色體分開(kāi)。(5)構(gòu)建好的YAC轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。(6)建好庫(kù)后保存方便，但要篩選某個(gè)基因時(shí)工作量大6．什么是BAC？BAC載體的組成與優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？①細(xì)菌人工染色體（BAC）是從大腸桿菌F因子改造構(gòu)建而來(lái)的，能夠攜帶大約300kb的DNA插入片段。②載體具有F因子的復(fù)制起始點(diǎn)（oriS），可使載體維持每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝的水平。③載體包括有4個(gè)維持DNA復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因，repE,parA,parBandparC。④具有一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記基因，和lacZ’基因。在lacZ’基因中組裝有一多克隆位點(diǎn)，便于外源片段的插入和藍(lán)白反應(yīng)篩選克隆子。⑤插入的DNA片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)百代，而且不易發(fā)生重組和從寄主細(xì)胞中丟失。⑥主要缺點(diǎn)是每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)少（1~2個(gè)），使得分離和篩選較為困難。7．利用pBR322質(zhì)粒插入失活分離帶有外源DNA片段的重組克隆的原理是什么？①外源DNA片段插入在pBR322質(zhì)粒tetr基因的編碼序列內(nèi)（BamHI）位點(diǎn)，使該基因失活；②體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ampstets菌株，并涂布在amp瓊脂平板上，凡獲得了pBR322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒(AmprTets)的寄主細(xì)胞都可長(zhǎng)成菌落；③將amp瓊脂上的菌落原位影印在tet瓊脂平板上生長(zhǎng)，對(duì)比這兩個(gè)平板的菌落生長(zhǎng)情況，凡在amp平板上能夠生長(zhǎng)而在tet平板上不能生長(zhǎng)的菌落，便是屬于帶有重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克隆；挑出這樣的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA插入片段的重組體質(zhì)粒。8.pUC質(zhì)粒利用α-互補(bǔ)作用篩選重組子原理是什么？答：pUC系列質(zhì)粒載體是在pBR322質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來(lái)的，它用lacZ’基因取代了pBR322質(zhì)粒載體上的tetr基因。lacZ’基因編碼β-半乳糖苷酶的N末端1-63個(gè)氨基酸(α-肽鏈)的DNA片段,在lacZ’基因內(nèi)組入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），但不影響lacZ’基因的功能。pUC載體的宿主（E.coli）攜帶一個(gè)編碼β-半乳糖苷酶C端序列的基因片段,它們本身用這個(gè)基因片段產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶片段是無(wú)活性的,但它們可以通過(guò)α-互補(bǔ)作用在體內(nèi)相互彌補(bǔ),即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的β-半乳糖苷酶。當(dāng)pUC質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含有指示劑X-gal和IPTG的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落成藍(lán)色。如果在MCS插入外源DNA片段（基因），破壞了lacZ’基因的功能（插入失活），不再產(chǎn)生α-肽鏈，不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是無(wú)(白)色的。因此，根據(jù)這種β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測(cè)出含有外源DNA插入序列的重組體克隆。9．自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多，即使是ColE1和pSCl01這兩個(gè)自然質(zhì)粒也不盡如人意，通常需要進(jìn)行改造。請(qǐng)問(wèn)質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容?答：基本內(nèi)容包括：(1)刪除一些非必要的區(qū)段及對(duì)宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載體具有更大的容納外源片段的能力。(2)加上易于選擇或檢測(cè)的標(biāo)記。(3)限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的改造，便于外源基因插入到載體中的特定位置。(4)加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達(dá)。(5)安全性改造，限定載體的宿主范圍。10．質(zhì)粒制備的基本原理？答：帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞在SDS作用下裂解，并在堿性條件下使DNA變性。調(diào)節(jié)pH值至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA首先復(fù)性，而細(xì)菌基因組DNA不能復(fù)性而與SDS-蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，可以被離心沉淀除去。上清液中的質(zhì)粒DNA分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀純化出來(lái)。噬菌體載體一、填空題1．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：①它在細(xì)菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴(kuò)增；②對(duì)某些噬菌體（如λ噬菌體）的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究的比較清楚，其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳研究的比較詳盡。2．λ噬菌體基因組DNA為48.5kb，根據(jù)λ噬菌體的包裝能力，其包裝DNA限度為37～51kb，為其本身基因組的75～105%。將野生型λ噬菌體的基因組DNA改造成插入型載體，如λZAPII，該載體的最小分子大小約為48.2kb，插入的外源片段最大不超過(guò)10.2kb。構(gòu)建的λ取代型載體λEMBL4，基因組大小為42.36kb，填充DNA片段為14kb，可容納的外源DNA分子最大為23kb。3．野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因是沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)和選擇標(biāo)記。4．黏粒(cosmid)是質(zhì)?！删w雜合載體，它的復(fù)制子來(lái)自質(zhì)粒，COS位點(diǎn)序列來(lái)自λ噬菌體，最大的克隆片段達(dá)到45kb。8．野生型的λ噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是：①分子質(zhì)量大；②酶的多切點(diǎn)；③無(wú)選擇標(biāo)記。9．M13單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制分為三個(gè)階段：①SS→RF；②RF→RF；③RF→SS。二、選擇題(單選或多選)1．限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI在野生型的入噬菌體DNA中有5個(gè)切點(diǎn)，HindIII有7個(gè)切點(diǎn)，BamHI也有5個(gè)切點(diǎn)。調(diào)整這些酶切位點(diǎn)的數(shù)量，主要通過(guò)(A)。A．體內(nèi)突變B．完全酶切后連接C.部分酶切D．先用甲基化酶修飾后再酶切2．pBluescriptM13載體在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)引入了T7和T3兩個(gè)噬菌體的啟動(dòng)子，這樣增加了該載體的功能，下述四種功能中哪一種是不正確的?(D)A．可以對(duì)插入到多克隆位點(diǎn)的外源片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析B．利用這兩個(gè)啟動(dòng)子的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增C．利用通用引物進(jìn)行序列分析D．利用這兩個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行定點(diǎn)突變3．下面關(guān)于細(xì)菌人工染色體(BAC)的特征描述，除了(C)外都是正確的。A．通過(guò)電激法將大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌比酵母的轉(zhuǎn)化率提高了10~100倍B．BAC載體在細(xì)菌中以環(huán)形超螺旋狀態(tài)存在，使分離操作起來(lái)相對(duì)容易C．BAC載體在大腸桿菌宿主保持高拷貝D．克隆到BAC載體上的外源片段可以直接進(jìn)行測(cè)序以獲得末端序列4．以黏粒為載體轉(zhuǎn)染受體菌后，平板上生長(zhǎng)的菌落會(huì)出現(xiàn)大小不一、生長(zhǎng)速度不一的現(xiàn)象，其原因是(D)。A．營(yíng)養(yǎng)成分不足B．重組后的質(zhì)粒復(fù)制不穩(wěn)定C.重組后的黏粒整合到宿主染色體上D．重組體中插入片段的大小不同5．黏粒（Cosmid）是一種人工構(gòu)建的載體，(AB)。A．它具有cos位點(diǎn)，因而可進(jìn)行體外包裝B．它具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制特性C．進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起裂解反應(yīng)D．進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起溶原化反應(yīng)6．黏粒(cosmid)質(zhì)粒中，COS位點(diǎn)的功能是(C)。A．復(fù)制起點(diǎn)B．限制酶切位點(diǎn)C．參與包裝進(jìn)入病毒外殼D．選擇標(biāo)記E．用于篩選重組子7．關(guān)于λ噬菌體，下列描述有誤的是(C)。A．既能高效感染大腸桿菌，又能高效感染枯草桿菌B．在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其DNA呈雙鏈環(huán)狀分子C.改造成載體后，可攜帶23kb以上的外源DNA片段D．重組的噬菌體易于篩選和儲(chǔ)存8．下列關(guān)于黏粒載體的描述不正確的是(D)。A．是由λ噬菌體與質(zhì)粒DNA重組的載體B．既有質(zhì)粒的特性，又有噬菌體DNA的特性(如可體外包裝)C．可插入大片段的外源DNA片段D．可像YAC載體那樣構(gòu)建大片段的基因組文庫(kù)三、判斷題1．取代型載體(replacementvector)是指同一種限制性內(nèi)切核酸酶在λDNA中具有兩個(gè)切點(diǎn)。外源DNA通__________過(guò)取代這兩個(gè)切點(diǎn)間的片段被克隆。錯(cuò)誤，不一定是同一種酶，取決于填充片段兩端酶切位點(diǎn)2．現(xiàn)在最常用的pUC載體是pUC18，它的分子質(zhì)量小，具有多克隆位點(diǎn)和易于選擇的分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制。另外，這種載體可在輔助質(zhì)粒的幫助下合成單鏈DNA。錯(cuò)誤，不能形成單鏈3．λ噬菌體DNA和M13單鏈?zhǔn)删wDNA在成熟前的DNA復(fù)制都是用滾環(huán)模型。正確4．M13噬菌體每個(gè)世代裂解宿主后，可釋放100個(gè)子代噬菌體。錯(cuò)誤，不裂解5．以黏粒（Cosmid）為載體的重組體雖然在平板上生長(zhǎng)的速度不同，但是轉(zhuǎn)化子中插入片段的擴(kuò)增量是相同的。錯(cuò)誤，由于重組體在平板上生長(zhǎng)速度不同，轉(zhuǎn)化子中插入片段擴(kuò)增量不同四、問(wèn)答題1．λ噬菌體DNA被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件？為什么？答：①兩個(gè)cos位點(diǎn)；②線性DNA；③分子大小在λ噬菌體基因組的75%～105%。2．為什么野生型的λ噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?答：(1)噬菌體DNA沒(méi)有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對(duì)DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將λ噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大小；(2)野生型的λDNA對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)，不便于克??；(3)沒(méi)有可供選擇的標(biāo)記；(4)野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。3．什么是藍(lán)白斑篩選法?4．λ噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足?答：優(yōu)點(diǎn)：(1)λ基因組中有1／3的非必需區(qū)可以被置換。改造成載體后，克隆的片段較大(可達(dá)20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個(gè)kb；(2)用噬菌體λDNA作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；(3)λ可通過(guò)溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，可讓它以溶原性存在，若要表達(dá)，可通過(guò)誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA的拷貝數(shù)就會(huì)很多。缺點(diǎn)：(1)包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購(gòu)買(mǎi)包裝蛋白的費(fèi)用高；(2)沒(méi)有質(zhì)粒的用途廣泛。5．以置換型λ噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說(shuō)能夠形成噬菌斑的就一定是重組體?答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過(guò)入基因組的105％，不能小于又基因組的75％。以置換型λ噬菌體DNA作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源DNA重組。如果沒(méi)有外源片段，僅是兩臂連接，長(zhǎng)度短于久基因組的75％，不能被包λ噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長(zhǎng)度超過(guò)λ基因組105％后，也不能包入噬菌體顆粒，自然也不能形成噬菌斑。6．M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?答：M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：(1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大。有報(bào)道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA長(zhǎng)6～7倍的DNA(插入片段可達(dá)40kb)。(2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對(duì)于DNA測(cè)序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。(3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。M13克隆系列的不足：(1)較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過(guò)程中往往不夠穩(wěn)定。一般說(shuō)，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的概率越大。(2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。7．黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?答：主要特點(diǎn)有：①柯斯質(zhì)粒是含有λ噬菌體COS位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。②具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。③插入片段的消化、連接及后來(lái)重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。④具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞不同，重組體像λ載體一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)菌。⑤包裝后形成的λ顆粒用來(lái)感染大腸桿菌，重組DNA像λDNA一樣注入細(xì)菌細(xì)胞，并以COS位點(diǎn)環(huán)化。由于缺乏λ的其他DNA序列，環(huán)化DNA在細(xì)菌體內(nèi)以質(zhì)粒一樣維持。⑥簡(jiǎn)化了篩選。載體體積小，承載外源DNA片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因?yàn)橐怀晒Πb，至少要7個(gè)分子的載體自連。盡管如此，也是不能被包裝的，因?yàn)镃OS位點(diǎn)太多了。重組體只有達(dá)到32-45kb才能有效包裝體外包裝，這就提供了對(duì)重組體的正向選擇。⑦對(duì)轉(zhuǎn)化體的選擇是基于載體上的抗生素標(biāo)記。⑧感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒載體也有如下不足：①如果兩個(gè)黏粒之間有同源序列，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果會(huì)使被克隆的片段重排或丟失。②含不同重組DNA片段的菌落生長(zhǎng)速度不同，會(huì)造成同一個(gè)平板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞的作用不同，會(huì)造成文庫(kù)擴(kuò)增量的比例失調(diào)。③包裝過(guò)程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價(jià)高。核酸分離、純化與測(cè)序、PCR技術(shù)一、填空題1．SDS是分離DNA時(shí)常用的一種陰離子除垢劑，它有四個(gè)作用：①溶解膜蛋白及脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；②溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；③對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用；④SDS能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合形成R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀。2．酚是蛋白質(zhì)變性劑，用酚抽提細(xì)胞DNA時(shí)，具有兩方面的作用：①是蛋白質(zhì)變性；②由于它能使蛋白質(zhì)變性，故也能使核小體和核糖體解聚，釋放出DNA和RNA,提高DNA的得率。3．用酚—氯仿抽提DNA時(shí)，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少許異戊醇。這是因?yàn)?，異戊醇是一種有機(jī)溶劑，可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。4．同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有兩個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：①水解能力強(qiáng)，作用范圍廣；②在SDS和EDTA中仍保持高活性，可以同SDS和EDTA同時(shí)使用。5．在分離DNA時(shí)要使用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸鈉等，其目的是螯合Mg2+抑制核酸酶的活性。6．用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在DNA溶液中加入單價(jià)的陽(yáng)離子，如NaCl和NaAc，其目的是中和DNA分子的負(fù)電荷，增加DNA分子間的凝聚力。7．通?？稍谌N溫度下保存DNA：4~5℃、-20℃、-70℃，其中以-70℃最好。8．引物在基因工程中至少有四個(gè)方面的用途：①合成探針；②合成cDNA；③用于PCR反應(yīng)；④進(jìn)行序列分析。9．Clark發(fā)現(xiàn)用TaqDNA聚合酶得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物不是平末端，而是有一個(gè)突出堿基末端的雙鏈DNA分子。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)了克隆PCR產(chǎn)物的T載體。10．在用SDS分離DNA時(shí)，要注意SDS的濃度，0．1％和1％的SDS的作用效果是不同的，前者只將RNA分離出來(lái)，后者可將DNA和RNA一同分離出來(lái)。11．在DNA分離過(guò)程中，通常要進(jìn)行透析，其目的是除去小分子的無(wú)機(jī)離子。12．在分離質(zhì)粒DNA的菌體培養(yǎng)過(guò)程中，加入氯霉素有兩個(gè)好處：①可以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA；②抑制菌體數(shù)量，有利于裂解。13．在DNA分離過(guò)程中造成DNA分__________子斷裂的因素很多，主要有：①核酸酶降解；②化學(xué)降解；③物理剪切。14．在DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起抑制真菌污染的作用。15．按照人們的意愿，改變基因中堿基的組成，以達(dá)到基因突變的技術(shù)稱(chēng)為定點(diǎn)突變。16．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在第二鏈