基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案

【基因工程復(fù)習(xí)題及參考答案】緒論、基因工程基礎(chǔ)一、填空題1.基因工程是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的遺傳學(xué)的一個分支學(xué)科?；蚬こ碳夹g(shù)的誕生使人們從簡單地利用現(xiàn)存的生物資源進(jìn)行諸如發(fā)酵、釀酒、制醋和醬油等傳統(tǒng)的生物技術(shù)時代，走向按人們的需要定向地改造和創(chuàng)造具有新的遺傳性品種的時代。2．Cohen等在1973年構(gòu)建了第一個有功能的重組DNA分子。3．基因工程的兩個基本特點(diǎn)是：（1）分子水平上的操作，（2）細(xì)胞水平上的表達(dá)。4．基因克隆中三個基本要點(diǎn)是：克隆基因的類型、受體的選擇和載體的選擇。5．克隆基因的主要目的有四個：①擴(kuò)增DNA；②獲得基因產(chǎn)物；③研究基因的表達(dá)調(diào)控；④改造生物的遺傳特性。6．基因工程的基本程序包括DNA制備、體外DNA重組、遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選等方面。7．基因工程又稱重組DNA技術(shù)/基因操作技術(shù)/基因克隆/分子克隆/遺傳修飾/新遺傳學(xué)。8．克隆的進(jìn)行依賴于各種參與DNA新陳代謝的酶的使用，它們主要是從原核細(xì)胞中分離的。限制性內(nèi)切核酸酶能夠?qū)NA切割成特定大小的片段。各種各樣的DNA聚合酶也是克隆所必需的，包括將RNA轉(zhuǎn)錄出單鏈DNA的反轉(zhuǎn)錄酶。DNA連接酶用于連接限制性片段?？寺∫残枰獊碓从谖⑸锏腄NA序列，包括用來運(yùn)載被被克隆DNA的克隆載體。質(zhì)粒載體來源于天然細(xì)菌質(zhì)粒，通常攜帶有抗生素抗性基因。其他載體來源于噬菌體，如λ噬菌體，它們經(jīng)過修飾后可以運(yùn)輸外源DNA。要想克隆一個感興趣的真核生物的基因就必須先制作一個能與該基因雜交的探針。人們已經(jīng)發(fā)展了很多有效而精細(xì)的技術(shù)來分析克隆的DNA。例如，極微量的DNA片段可以通過PCR得到擴(kuò)增。在感興趣基因的啟動子上連接，如CAT或LacZ之類的報告基因能夠定量檢測基因的活性。二、選項題（單選或多選）1．因研究重組DNA技術(shù)而獲得諾貝爾獎的科學(xué)家是（C）。A.KornbergAB.GilbertWC.BergPD.McClintock2．第一個用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是（A）。A.EcoRIB.EcoBC.EcoCD.EcoRII3.靶（目的）基因通常是指（A）。A、擬進(jìn)行研究或利用的基因B、人工合成的基因C、載體DNA分子D、具有編碼序列的DNA分子三、判斷題1．利用噬菌體或動物病毒作為載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)移。錯誤，為轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒DNA為轉(zhuǎn)化2．BergP的創(chuàng)造性的工作是在體外構(gòu)建了重組DNA分子，所用的載體是一種具有復(fù)制能力的細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒。錯誤，用的是動物病毒DNA（猿猴病毒SV40）3．克隆即無性繁殖的意思。通過克隆可以在無性的條件下獲得遺傳結(jié)構(gòu)和表型完全相同的一群個體。錯誤，不嚴(yán)謹(jǐn)，對分子可以，對細(xì)胞或個體不一定4．催生基因工程技術(shù)誕生的關(guān)鍵技術(shù)是DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的突破。錯誤，II型酶的分離純化四、問答題1．為什么說基因工程是在上世紀(jì)70年代初起發(fā)展起來的？答：這是因為：①1967年發(fā)現(xiàn)了連接酶；②大腸桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)于1970年獲得突破；③限制性內(nèi)切核酸酶的分離始于1970年；④Berg在1972年構(gòu)建了第一個重組的DNA分子。2．基因工程操作的基本步驟是什么？①施工材料的準(zhǔn)備，即目的基因、載體、工具酶和受體細(xì)胞（宿主）的準(zhǔn)備。用限制性內(nèi)切酶分別將外源DNA和載體分子切開。（切）②目的基因與載體DNA的體外重組，形成重組DNA分子。（接）③把重組的DNA分子引入受體細(xì)胞，并建立起無性繁殖系。（轉(zhuǎn)和擴(kuò)）④篩選出所需要的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳、正確表達(dá)。（檢）3．如何理解基因工程的兩個特點(diǎn)？答：基因工程的兩個基本特點(diǎn)是分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)。分子水平的操作包括DNA分離、切割和連接（還有其他一些DNA的修飾等）。由于體外重組DNA的最終目的是要改變生物的遺傳性，所以分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)是基因工程的兩個最基本的特點(diǎn)。4．什么是動物乳腺生物反應(yīng)器？答：能夠分泌乳汁的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)其他來源的基因產(chǎn)品，并通過乳腺分泌出來。5．基因克隆是如何使含有單個基因的DNA片段得到純化的？答：大分子質(zhì)量的DNA會含有許多特殊限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點(diǎn)，因此用一種限制酶處理一完整染色體或整個基因組會產(chǎn)生許多不同的DNA片段，每一個片段帶有基因組的一個不同的基因或一個不同的小片段。當(dāng)全部片段與用同種限制酶處理過的載體分子混合時（如圖所示），每個片段將插入一個不同的載體分子(如一個質(zhì)粒)。同樣地，當(dāng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時，每個宿主細(xì)胞將只接收一個質(zhì)粒DNA分子，而篩選出的含重組質(zhì)粒的每個菌落實際上會含有某一特異的供體DNA片段的多個拷貝。一旦帶有待研究的特定基因的克隆被確認(rèn)了，此重組DNA分子可從宿主細(xì)胞中提取出來進(jìn)行純化。6．比較遺傳工程、基因工程和生物技術(shù)。答：遺傳工程是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計思想，在離體條件下，對生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作，以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工程的概念有廣義和狹義之分。狹義的遺傳工程就是指基因工程?；蚬こ蹋╣eneengineering）又稱基因操作（genemanipulation）、重組DNA（recombinantDNA）。基因工程是以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因(DNA分子)，按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué)，生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營和開發(fā)微生物、動植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分，進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來提供商品或社會服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。它包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等。限制內(nèi)切核酸酶一、填空題1．基因工程中把那些具有識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切核酸酶。2．通過比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的限制酶切圖譜。3．II類限制性內(nèi)切核酸酶分子質(zhì)量較小，一般在20～40kDa。這類酶的專一性強(qiáng)，它不僅對酶切點(diǎn)鄰近的兩個堿基有嚴(yán)格要求，而且對更遠(yuǎn)的堿基也有要求，因此，II類酶既具有切割位點(diǎn)的專一性，也具有識別位點(diǎn)的專一性，一般在識別序列內(nèi)切割。切割的方式有平切和交錯切，產(chǎn)生平末端的DNA片段或突出黏性末端的DNA片段。作用時需要Mg2+作輔助因子，但不需要ATP和SAM。4.完全的回文序列具有兩個基本的特點(diǎn)：①能夠在中間劃一個對稱軸，兩側(cè)的序列兩兩對稱互補(bǔ)配對；②兩條互補(bǔ)鏈的5’→3’的序列組成相同，即將一條鏈旋轉(zhuǎn)180°，則兩條鏈重疊。5．II類限制性內(nèi)切核酸酶一般識別4～6個堿基，也有識別多序列的限制性內(nèi)切核酸酶。6．個體之間DNA限制性片段長度的差異叫限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）。7．限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個大寫字母取自屬名的第一個字母，第二、三兩個字母取自種名的前兩個字母，第四個字母則用菌株名表示。8．限制性內(nèi)切核酸酶AcyI識別的序列是5’-GRCGYG-3’，其中R代表A或者T，Y代表G或者C。9．在酶切反應(yīng)管加完各種反應(yīng)物后，需要離心幾秒鐘，其目的是混合均勻和防止部分酶切。10．基因組DNA分子部分酶切消化可采取的措施有：①減少酶量；②縮短反應(yīng)時間；③增大反應(yīng)體積等。11．第一個分離得到的限制性內(nèi)切核酸酶是EcoK，而第一個用于構(gòu)建重組DNA分子的限制性內(nèi)切核酸酶是EcoRI。12．限制性內(nèi)切核酸酶BsuRI和HaeIII的來源不同，但識別的序列都是GGCC,，因此他們屬于同裂酶。13．由于DNA是由四種堿基組成的，所以任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應(yīng)該是4n。14．部分酶切是指控制反應(yīng)條件，使得酶在DNA序列上的識別位點(diǎn)只有部分得到切割，它的理論依據(jù)是酶切速度是不均衡的。15．I類限制酶識別DNA的位點(diǎn)和切割的DNA位點(diǎn)是不同的，切割位點(diǎn)的識別結(jié)合有兩種模型，一種是限制酶移動，另一種是DNA彎曲。16．限制性內(nèi)切核酸酶通常保存在50%濃度的甘油溶液中。二、選項題（單選或多選）1．關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有(B)不太恰當(dāng)。A．由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成B．這一系統(tǒng)中的核酸酶都是II類限制性內(nèi)切核酸酶C．這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對DNA進(jìn)行修飾D．不同的宿主系統(tǒng)具有不同的限制--修飾系統(tǒng)2．RFLP產(chǎn)生自(C)。A．使用不同的限制性內(nèi)切核酸酶B．每種類型的染色體有兩條(二倍體)C．DNA序列中堿基的隨機(jī)變化D．Southern印跡E．不同探針的使用3．II類限制性內(nèi)切核酸酶(B)。A．有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識別回文序列B．僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供C．限制性識別非甲基化的核苷酸序列D．有外切核酸酶和甲基化酶活性E．僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供4．III型限制性內(nèi)切核酸酶(C)。A．由兩個亞基組成，僅識別半甲基化位點(diǎn)。甲基化位點(diǎn)相對于限制位點(diǎn)的位置（上游或下游）決定了DNA是被甲基化還是被限制B．不同亞基的識別位點(diǎn)甲基化和限制活性相互排斥：MS亞基促使甲基化，R亞基促使限制C．由兩個亞基組成，在識別位點(diǎn)附近識別并進(jìn)行甲基化或限制D．在錯配修復(fù)中起關(guān)鍵作用，因為酶結(jié)合到DNA上是以結(jié)構(gòu)扭曲為基礎(chǔ)而不是序列錯誤識別5．分析限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA所得到的DNA片段的長度有助于物理作圖，這是因為(C)。A．即使只用一種限制酶，因為DNA是線性的，所以也可以迅速確定限制性片段序列B．內(nèi)切核酸酶在等距離位點(diǎn)切割DNA，同時對于每個生物體的長度是特異的C、DNA的線性意味著單限制酶切片段的長度之和等于DNA的總長，而雙酶切產(chǎn)生的重疊片段則產(chǎn)生模糊的圖譜D．這些內(nèi)切核酸酶的消化活性是物種特異的E．這一技術(shù)同時為核苷酸序列提供了廣泛信息6、通過限制性片段分析，可以對等位基因進(jìn)行精確的分析比較，其原因是(BD)。A．限制性內(nèi)切核酸酶只切割兩個變異等位基因中的一個B．它利用限制性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記C、一個特定細(xì)胞中等位基因的核苷酸序列不會是相同的D．它不依賴于變異等位基因產(chǎn)物的功能E．限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)被限制在DNA的編碼區(qū)域內(nèi)7、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是(C)。A．用于遺傳的“指紋結(jié)構(gòu)”模式分析的技術(shù)B．二倍體細(xì)胞中的兩個等位基因限制性圖譜的差別C．物種中的兩個個體限制性圖譜間的差別D．兩種物種個體間的限制性圖譜差別E．兩種酶在單個染色體上限制性圖譜的差別8.下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的？（BCDE）A.限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶B.限制酶在特異序列（識別位點(diǎn)）對DNA進(jìn)行切割C.同一種限制酶切割DNA時留下的末端序列總是相同的D.一些限制酶在識別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生黏末端E．一些限制酶在識別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端9．因研究噬菌體的限制與修飾現(xiàn)象的本質(zhì)而獲得諾貝爾獎的科學(xué)家是（C）。A.LederbergJB.ArberWC.SmithHD.SangerF10．第一個被分離的II類酶是(C)。A．EcoKB．HindIIIC．HindIID．EcoB11．雙鏈DNA中一段自我互補(bǔ)的序列被稱為回文序列，這種序列一般具有(ABC)特征。A、有對稱軸B．兩條鏈的5’→3’方向的序列相同C．是Ⅱ類酶的識別序列D．可增強(qiáng)基因的表達(dá)12．在下列進(jìn)行DNA部分酶切的條件中，控制哪一項最好?(B)A．反應(yīng)時間B．酶量C．反應(yīng)體積D．酶反應(yīng)的溫度13．在下列試劑中，哪一種可以螯合Ca2+？(D)A．EDTAB．檸檬酸鈉C．SDSD．EGTA14．BstBI(TT↓CGAA)消化可產(chǎn)生怎樣的末端?(C)A．含5'CGAA3'序列的黏末端B．含5'CG3'序列的黏末端C．含5'AAGC3'序列的黏末端D．平末端E．含5'GC3'序列的黏末端15．限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識別(B)。A．雙鏈DNA的特定堿基對B．雙鏈DNA的特定堿基序列C．特定的三聯(lián)密碼D．以上都正確16.下面關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的表示方法中，正確的一項是（D）。A.Sau3AIB.E.coRIC.hindIIID.Sau3AI17．限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性是指(A)。A.在非常規(guī)條件下，識別和切割序列發(fā)生變化的活性B．活性大大提高C．切割速度大大加快D．識別序列與原來的完全不同18．下面哪一種不是產(chǎn)生星號活性的主要原因?(D)A．甘油含量過高B．反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑C．含有非Mg2+的二價陽離子D．酶切反應(yīng)時酶濃度過低19.DNA被某種酶切割后，電泳得到的電泳帶有些擴(kuò)散，下列原因中，哪一項不太可能？(A)A．酶失活B．蛋白質(zhì)(如BSA)同DNA結(jié)合C．酶切條件不合適D．有外切核酸酶污染20．關(guān)于回文序列，下列各項中(ABC)是不正確的。A．是限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列B．是某些蛋白質(zhì)的識別序列C．是基因的旁側(cè)序列D．是高度重復(fù)序列21．為什么使用限制性內(nèi)切核酸酶對基因組DNA進(jìn)行部分酶切？(E)A．為了產(chǎn)生平末端B．為了產(chǎn)生黏末端C．只切割一條鏈上的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生開環(huán)分子D．可得到比完全酶切的片段略短的產(chǎn)物E．可得到比完全酶切的片段略長的產(chǎn)物22.BamHI、XbaI、BglII的識別位點(diǎn)分別是：G↓GATCC、T↓CTAGA、A↓GATCT，哪些酶切結(jié)果可產(chǎn)生互補(bǔ)的末端?(C)A．以上幾種酶切結(jié)果產(chǎn)生的末端都可互補(bǔ)B．產(chǎn)生的末端都不能互補(bǔ)C．僅BamHI與BglII的酶切末端互補(bǔ)D．僅BamHI與XbaI的酶切末端互補(bǔ)E．僅XbaI與BglII的酶切末端互補(bǔ)23．從細(xì)菌中分離基因組DNA，經(jīng)過識別GAATTC序列的6堿基酶長時間消化后，發(fā)現(xiàn)DNA分子未被切動，基因組大小為4Mb，造成該結(jié)果的原因是什么?(C)A．基因組中沒有GB．基因組中沒有AC．該細(xì)菌的DNA已經(jīng)過甲基化修飾D．所有酶切位點(diǎn)都位于基因內(nèi)，而該限制性內(nèi)切核酸酶不作用于基因內(nèi)E．所有酶切位點(diǎn)都位于啟動子及調(diào)控區(qū)內(nèi)，而該限制性內(nèi)切核酸酶只作用于基因內(nèi)24.關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的來源及其天然存在的意義，下列哪種說法是正確的?(D)A．來自噬菌體，用于復(fù)制病毒DNAB．來自噬菌體，具有抗微生物作用C．來自酵母菌，參與DNA復(fù)制D．來自細(xì)菌，有防御病毒侵染的意義E．是細(xì)菌內(nèi)的DNA復(fù)制酶25.識別10堿基序列的限制酶，大約每隔(A)進(jìn)行一次切割。A．4l0B．104C．2l0D．102E．24三、判斷題1．限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護(hù)體系，它是通過對外源DNA的修飾和對自身DNA的限制實現(xiàn)的。錯誤，正相反2．限制性內(nèi)切核酸酶在DNA中的識別／切割位點(diǎn)的二級／三級結(jié)構(gòu)也影響酶切效率。一般來說，完全切割質(zhì)?；虿《綝NA，要比切割線狀DNA需要更多的酶，最高的需要20倍。正確3．如果限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影響切割，如HpaII和MboI要求識別序列之前至少有一個堿基對存在才能切割。正確4．能夠產(chǎn)生防御病毒侵染的限制性內(nèi)切核酸酶的細(xì)菌，其本身的基因組中沒有被該核酸酶識別的序列。正確5．限制性圖譜與限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)圖譜的最顯著的區(qū)別在于前者是一個物理圖譜而后者是一個連鎖圖。正確6．用限制性內(nèi)切核酸酶HaeIII分別切割載體DNA和供體DNA后，可用E．coliDNA連接酶進(jìn)行連接。錯誤，HaeIII產(chǎn)生平末端，此酶不能連接平末端7．已知某一內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA上有三個切點(diǎn)，因此，用此酶切割該環(huán)狀DNA，可得到三個片段。正確8．迄今所發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶既能作用于雙鏈DNA，又能作用于單鏈DNA。錯誤9．基因工程中使用的II類限制性內(nèi)切核酸酶不僅有內(nèi)切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。錯誤，II型無甲基化活性10．DNA多態(tài)性就是限制性片段長度多態(tài)性。錯誤，RFLP只是DNA多態(tài)性一部分11．甘油會使許多限制性內(nèi)切核酸酶的特異性發(fā)生改變，這是導(dǎo)致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的辦法是在酶切反應(yīng)體系中，將甘油的濃度控制在5％以下。正確12．具有EcoRII末端的外源片段只能以一個方向插入到EcoRII末端的載體中。正確，↓CCWGG，W=A或T？13．從EscherichiacoliK中分離的限制性內(nèi)切核酸酶命名為E．coK。錯誤，EcoK14．同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割靶DNA,得到的片段的兩個末端都是相同的。錯誤，如果識別的不是完整的回文序列，末端不同15．在限制與修飾系統(tǒng)中，修飾主要是甲基化作用，一旦位點(diǎn)被甲基化了，其他的限制酶就不能切割了。錯誤，甲基化不能被同一系統(tǒng)限制酶識別16．稀有酶是指那些識別序列很長又不常用的限制性內(nèi)切核酸酶。錯誤，指在某種事物基因組DNA中切割頻率很低的酶17．EGTA是鎂離子螯合劑，加入反應(yīng)液后，可以抑制所有需要鎂離子作為輔助因子的酶活性。錯誤，是鈣離子螯合劑，可抑制需鈣離子作為輔助因子的酶活性，如Bal31四．問答題（一）簡答1．現(xiàn)分離到ΦX82噬菌體的—個突變型，它同野生型的噬菌斑相當(dāng)不同，并已分離到這兩種噬菌體的DNA。請設(shè)計一個實驗，初步鑒定是點(diǎn)突變、插入突變還是缺失突變?提示：用RFLP方法。2．說明SangerDNA測序法的原理。答：SangerDNA測序法建立在兩個基本原理之上：①核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由5’端向3’端聚合；②可延伸的引物必須能提供游離的3’羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的3’羥基末端，因此會終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。如果分別用四種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會獲得四組長度不同的DNA片段。通過比較所有DNA片段的長度可以得知核苷酸的序列。3．在酶切反應(yīng)緩沖液中加入BSA的目的是什么？機(jī)制是什么？答：目的是保護(hù)酶的活性，機(jī)制是通過提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止酶的失活。4．某學(xué)生在用EcoRI切割外源DNA片段時，出現(xiàn)了星號活性，請分析可能的原因。答：鹽離子濃度不對，溫度不對，甘油濃度過高。5．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一個6bp的II類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么？答：回文序列是5’-CATATG-3’。6．下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個（哪些）最有可能是II類酶的識別序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？為什么？答：GATATC和AAATTT，因為它們是回文序列。7．用Klenow酶填補(bǔ)的辦法可使5'黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端。這種方法常使DNA上的某些限制酶的識別位點(diǎn)消失。請問，對于下列限制酶，用這種方法處理會不會使它們的識別序列都消失？BamHI(G↓GATCC)、TaqI(T↓CGA)、BssHII(G↓CGCGC)。答：BssHII不會。8．當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?為什么?答：注意星號活性；先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星號活性，或使用通用緩沖液。9．什么是同裂酶？什么是同尾酶？10．何謂限制性物理圖譜？答：限制性物理圖譜即限制性內(nèi)切核酸酶作圖(restrictionmapping)。簡單地說就是DNA分子中限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的定位，即DNA分子中各種不同限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的線性排列圖。標(biāo)明限制酶在DNA分子上的限制性位點(diǎn)的數(shù)目、限制性片段大小及其線性排列的順序。（二）問答1．什么是細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng)(RestrictionModificationSystem，R-Msystem)?答：細(xì)菌中有作用于同一DNA的兩種酶，即分解DNA的限制酶和改變DNA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。而且，這兩種酶作用于同一DNA的相同部位，把這兩種酶所組成的系統(tǒng)稱為限制與修飾系統(tǒng)。2．細(xì)菌的限制—修飾系統(tǒng)有什么意義?答：不同種的細(xì)菌或不同的細(xì)菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng)。修飾的本質(zhì)是通過甲基化酶將DNA中某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，由于宿主自身DNA上的這些位點(diǎn)進(jìn)行了修飾，限制酶就不能進(jìn)行切割。而外來的DNA在相應(yīng)的堿基上沒有被甲基化，宿主的限制酶通過對該位點(diǎn)的識別來分辨敵我，并將入侵的外來DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修飾作用為細(xì)胞提供了保護(hù)。3．說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答：基本原則：屬名+種名+株名十序號。①首字母：取屬名的第一個字母，且斜體大寫。第二個字母：取種名的第一個字母，斜體小寫。第三個字母：取種名的第二個字母，斜體小寫。第四個字母：若有株名，株名則作為第四個字母，用正體。②順序號：若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、II、III等，用正體。③所有的限制酶，前面還應(yīng)帶有系統(tǒng)的名稱,如限制性核酸內(nèi)切酶R.HindIII。修飾酶則在前面加上甲基轉(zhuǎn)移酶M，如甲基轉(zhuǎn)移酶M.HindIII。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，R可被省去。4．何謂限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率?答：切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA分子中預(yù)測的切點(diǎn)數(shù)。由于DNA是由四種類型的單核苷酸組成，假定DNA的堿基組成是均一的，而限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，那么對于任何一種限制酶的切割頻率，理論上應(yīng)為1／4n，n表示該限制酶識別的堿基數(shù)。如識別4個堿基的限制酶，其切割頻率應(yīng)為每256個堿基有一個識別序列和切點(diǎn)（1／44=1／256），識別5個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切割頻率應(yīng)為每1024個堿基有一個識別序列和切點(diǎn)，余類推。5．什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性？受哪些因素的影響?答：II類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件發(fā)生改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變。改變后的活性通常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星號活性。誘發(fā)星號活性的因素有如下幾種：①高甘油含量(＞5％，v／v)；②限制性內(nèi)切核酸酶用量過高(＞100U／gDNA)；③低離子強(qiáng)度(＜25mmol／L)；④高pH(8．0以上)；⑤含有有機(jī)溶劑，如DMSO、乙醇等；⑥有非Mg2+的二價陽離子存在（如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等）。6．雙酶消化法（doubledigest）繪制限制性內(nèi)切核酸酶酶譜的原理是什么?答：雙酶消化法是繪制DNA中兩個或兩個以上限制性內(nèi)切核酸酶圖譜所采用的方法。做法是在兩個限制性內(nèi)切核酸酶分別單獨(dú)消化DNA分子的基礎(chǔ)上，再用這兩個酶同時或先后消化DNA，根據(jù)它們的結(jié)果構(gòu)建物理圖譜。7．什么是DNA多態(tài)性(DNApolymorphism)?答：在正常人群中，各個體DNA分子的某些位點(diǎn)可以發(fā)生中性改變，這些改變雖然會使DNA一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化，但不影響基因的表達(dá)，如果這種中性突變在人群中的頻率不低于1％，這一現(xiàn)象被稱為多態(tài)性。DNA多態(tài)性本質(zhì)上是染色體DNA中核苷酸數(shù)目或排列順序的個體差異，這些差異多數(shù)為中性突變，不引起表型改變。8．什么是限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)？答：當(dāng)DNA序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)時，或當(dāng)DNA片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶解后，其片段長度的改變可以經(jīng)凝膠電泳區(qū)分時，DNA多態(tài)性就可應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行分析，這種多態(tài)性稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。9．計算下列三種酶各自在某染色體DNA序列上識別位點(diǎn)間的平均距離：AluI：5’AGCT3，EcoRI:5’GAATTC3’3’TCGA5，3’CTTAGG5’AcyI：5’GPuCGPyC3’3’CPyGCPuG5’(注：Py=任何一種嘧啶；Pu=任何一種嘌呤)答：AluI：(1／4)4=1／256EcoRI：(1／4)6=1／4096AcyI：(1／4)4(1／2)2=1／102410．何為回文序列？答：回文序列（palindromicsequence）是一段自我互補(bǔ)的序列，即同其互補(bǔ)鏈一樣的序列（兩者的閱讀方向都是從5’→3，)。根據(jù)回文序列的結(jié)構(gòu)可分為：完全的回文序列、不完全的回文序列和間斷的回文序列。完全回文序列（如GAATTC），通常是限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列；不完全的回文序列（如TACCTCCAT,CGTGATA），常是其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)(如阻抑蛋白)，在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用；間斷的回文序列（如GGTTXXXAACC，有一段是顛倒的重復(fù)），它可使單鏈的核苷酸有可能在tRNA中所見到的一樣，形成發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)。聚合酶與修飾酶一、填空題1、連接酶（ligase）是一類用于核酸分子連接形成磷酸二酯鍵的核酸合成酶。2．原核生物主要有兩種類型的DNA連接酶：E．coliDNA連接酶和T4DNA連接酶?；蚬こ讨惺褂玫闹饕荰4DNA連接酶，它是從T4噬菌體感染的E．coli中分離的一種單鏈多肽酶，分子質(zhì)量為68kDa，由T4噬菌體基因30編碼。E．coliDNA連接酶是由大腸桿菌基因51編碼，也是一條多肽鏈的單體，分子質(zhì)量為74kDa。這兩種DNA連接酶有兩個重要的差異：①它們在催化反應(yīng)中所用的能量來源不同，T4DNA連接酶用ATP，而E．coliDNA連接酶則用NAD+作為能源；②它們催化平末端連接的能力不同，在正常情況下只有T4DNA連接酶能夠連接平末端，E．coliDNA連接酶則不能。即使是調(diào)整反應(yīng)條件，E．coliDNA連接酶催化平末端的連接效率也只有T4DNA連接酶的1/10。3.從小牛胸腺中分離純化的末端轉(zhuǎn)移酶催化的基本反應(yīng)是將脫氧單核苷酸加到DNA的3’-ON端，同時釋放出游離的無機(jī)磷。催化反應(yīng)時不需要模版，但需要引物，單鏈DNA是最好的引物，單鏈DNA受體的長度最短需有3個dNTP。具有3’突出末端的雙鏈DNA也是較好的反應(yīng)底物。二價離子和DNA末端狀態(tài)對催化反應(yīng)影響較大，但是用Co2+作為輔助離子，可以催化任何形式的末端（突出的、隱含的、平齊的）加接單核苷酸，但突出的3’端效率較高。以Mn2+／Mg2+作為輔助因子，只能在單鏈DNA或雙鏈DNA的3’突出端加尾。4．DNA聚合酶I的Klenow片段是用枯草桿菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子質(zhì)量為76kDa的大片段，具有兩種酶活性：①5’→3’聚合酶活性；②3’→5’外切核酸酶的活性。5．反轉(zhuǎn)錄酶除具有以DNA和RNA為模板合成DNA的5’→3’合成酶的活性外，還具有四種酶的活性：①5’→3’外切核酸酶活性；②3’→5’外切核酸酶活性；③DNA內(nèi)切酶的活性（Mn2+，切割SCDNA）；④解旋酶的活性。__________6．為了防止DNA的自身環(huán)化，可用堿性磷酸酶脫去雙鏈DNA5’端得磷酸基團(tuán)。7．切口移位(NickTranslation)法標(biāo)記DNA的基本原理在于利用DNA聚合酶I的5’→3’外切核酸酶和5’→3’聚合酶活性的作用。8．欲將某一具有突出單鏈末端的雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)變成平末端的雙鏈形式，通常可采用S1核酸酶切割或DNA聚合酶補(bǔ)平。9．反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA的合成外，還具有核酸水解酶H的作用，可以將DNA-RNA雜種雙鏈中的RNA水解掉。10．DNA連接酶是基因克隆的分子黏合劑，而限制性內(nèi)切核酸酶被譽(yù)為分子克隆的剪刀。二、選項題（單選或多選）1．T4DNA連接酶是從T4噬菌體感染的E．coli中分離的，這種連接酶（B）。A．催化連接反應(yīng)時既能以ATP又能以NAD作為能量來源B．既能催化平末端連接又能催化黏性末端連接C.是一種單肽酶，分子質(zhì)量為74kDaD．既能催化單鏈DNA連接又能催化雙鏈DNA連接2．DNA連接酶在體內(nèi)的主要作用是在DNA復(fù)制、修復(fù)中封閉缺口，（A）。A．將雙鏈DNA分子中的5’磷酸基團(tuán)同3'-OH末端重新形成磷酸二酯鍵B．作用時不消耗能量C．需要Mn2+等二價輔助離子D．也可以連接RNA分子3．在長模板鏈的指導(dǎo)下引物延伸合成長的DNA互補(bǔ)鏈時應(yīng)選用（D）。A.T4DNA聚合酶B．Klenow酶C．大腸桿菌DNA聚合酶ID．T7DNA聚合酶4．末端轉(zhuǎn)移酶是合成酶類，（C）。A．作用時不需要模板B．在Co2+的存在下，可以在突出的3’端延長DNA鏈C．在Co2+的存在下，可以在隱蔽的3’端延長DNA鏈D．上述說法有兩種是正確的5．在基因工程中，可用堿性磷酸酶(AB)。A．防止DNA的自身環(huán)化B．同多核苷酸激酶一起進(jìn)行DNA的5’端標(biāo)記C．制備突出的3’端D．上述說法都正確6．從E．coli中分離的連接酶(B)。A．需要ATP作輔助因子B．需要NAD作輔助因子C．可以進(jìn)行平末端和黏性末端連接D．作用時不需要模板7．下列哪一種酶作用時需要引物?(C)A．限制酶B．末端轉(zhuǎn)移酶C．反轉(zhuǎn)錄酶D．DNA連接酶8．S1核酸酶的功能是(BCD)。A．切割雙鏈的DNAB．切割單鏈的RNAC．切割發(fā)夾環(huán)D．以上有兩項是正確的9．K1enow酶與DNA聚合酶相比，前者喪失了(C)的活性。A．5’→3’合成酶B．3’→5’外切酶C．5’→3’外切酶D．轉(zhuǎn)移酶10．只能從DNA分子的末端水解磷酸二酯鍵使核苷酸解離下來的酶是(A)。A．核酸外切酶B．核酸內(nèi)切酶C.DNA連接酶D．末端轉(zhuǎn)移酶11．T4噬菌體DNA聚合酶具有兩種活性：聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（作用于3’突出端），因此可使黏末端變成平末端。如DNA片段用一定的限制性內(nèi)切核酸酶處理后，再置于含T4聚合酶及四種三磷酸核苷酸的反應(yīng)體系中，則下面哪種情況可能發(fā)生？(C)A．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，BglII(A↓GATCT)切出的末端被切平B．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，BglII及PvuI(CGAT↓CG)切出的末端被切平C．在T4聚合酶的外切酶活性作用下，SacII(CCGC↓GG)及PvuI切出的末端被切平D．在聚合酶活性作用下，BglII及PvuI切出的末端被補(bǔ)平E．在聚合酶活性作用下，SacII及PvuI切出的末端被切平12．逆轉(zhuǎn)錄酶也稱反轉(zhuǎn)錄酶，是一種(B)。A.依賴于DNA的DNA聚合酶B．依賴于RNA的DNA聚合酶C.依賴于DNA的RNA聚合酶D．DNA聚合酶或RNA聚合酶13．可以在切口部位起作用的酶是(A)。A．S1核酸酶B．外切酶IIIC．λ外切核酸酶D．Bal31核酸酶三、判斷題1．T4DNA連接酶和E．coli連接酶都能催化平末端和黏性末端的連接。錯誤，平末端不能2．T4DNA連接酶和E．coli連接酶都能催化雙鏈DNA和單鏈DNA的連接。錯誤，都不能催化單鏈連接3．反轉(zhuǎn)錄酶能夠以單鏈RNA或單鏈DNA為模板，在引物的引發(fā)下合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。以RNA為模板合成的DNA是互補(bǔ)DNA(ComplementaryDNA，cDNA)。若是以DNA模板合成DNA，dNTP的摻入速度很低（每秒約5個核苷酸），是T7DNA聚合酶合成速度的1％。正確4．以RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶可同時產(chǎn)生單鏈和雙鏈的cDNA，雙鏈DNA是由自身引物引導(dǎo)合成。但這種自身引物引導(dǎo)的合成效率遠(yuǎn)低于外加寡核苷酸引物引導(dǎo)的合成。正確5．Bal31核酸酶是Ca2+依賴性的，在反應(yīng)混合物中加入EDTA便可抑制它的活性。錯誤，EGTA抑制Ca2+6．當(dāng)一個DNA結(jié)合蛋白同它識別的核苷酸序列結(jié)合以后，就保護(hù)了它們的磷酸二酯鍵免遭切割，其結(jié)果，電泳膠上就有明顯可見的空缺帶（與對照相比），這就是DNA足跡法。正確7．T4DNA連接酶和E．coli連接酶作用時都需要ATP和NAD+作為輔助因子。錯誤，T4連接酶需要ATP，E．coli需NAD+8．多核苷酸激酶之所以能夠用于DNA片段的標(biāo)記，是因為它能夠?qū)蝹€的32P標(biāo)記的單核苷酸加到每一DNA鏈的5’端。錯誤，將ATP上的32P加到9．用同一種酶切割載體和外源DNA得到黏性末端后，為防止它們自身環(huán)化，要用CIP將它們脫磷酸。錯誤，不能同時脫磷酸，一般只將載體脫磷酸10．Nick和Gap的含義是不同的，前者指DNA的單鏈中有較小的缺失，后者僅是斷開了一個磷酸二酯鍵。錯誤，正相反四、問答題1．DNA連接酶的連接機(jī)理是什么？答：DNA連接酶是利用ATP或NAD+[煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵。在連接反應(yīng)中，首先ATP(NAD+)與DNA連接酶反應(yīng)，同連接酶生成一種共價結(jié)合的酶-AMP復(fù)合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通過一種磷酸酰胺鍵同DNA連接酶的賴氨酸殘基的ε-氨基相連。同時釋放出焦磷酸或煙酰胺單核苷酸（NMN）。AMP激活DNA一條鏈的5’-末端磷酸基團(tuán),并轉(zhuǎn)移到磷酸基團(tuán)上，形成DNA-腺苷一磷酸復(fù)合物。最后，3’-OH對激活的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，同時釋放出AMP。連接反應(yīng)是由在形成酶-腺苷酸復(fù)合體時，焦磷酸水解和釋放提供的能量驅(qū)動下進(jìn)行的。在以ATP作為能源的連接酶中，一個磷酸二酯鍵的形成消耗掉兩個高能磷酸鍵。2．DNA連接酶的作用特點(diǎn)有哪些？①連接反應(yīng)需要在一條DNA鏈的3’末端具有一個游離的-OH,而另一條DNA鏈的5’末端具有一個磷酸基團(tuán)(-P)的情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用，而在末端帶有5’-羥基和3’-羥基；5’-磷酸和3’-二脫氧核苷基團(tuán)的兩個DNA片段之間不起連接作用。②連接反應(yīng)中需要ATP或NAD+和Mg2+為輔助因子和激活因子；③DNA連接酶不能夠連接兩條單鏈的DNA分子，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋的一部分。④DNA連接酶只封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(Nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的裂口（Gap）。3．影響DNA連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些？答：1)反應(yīng)溫度：最佳反應(yīng)溫度37℃，但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，連接黏性末端的最佳溫度，一般認(rèn)為4～20℃比較合適。2)DNA片段末端：不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個DNA分子的末端有較高的幾率與另一DNA分子連接，減少同一個分子兩個末端之間的自身連接。載體與插入片段3：1~1：3。3)連接酶濃度：平末端DNA分子的連接反應(yīng)，最適酶量大約是1～2單位；而黏末端DNA片段間的連接，在同樣的條件下，僅為0.1單位時，便能得到最佳連接效率。4．什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到的兩個片段。其中大片段的分子質(zhì)量為75kDa，它具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切核酸酶的活性，小片段具有5’→3’外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會降解5’引物的5’→3’外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修復(fù)反應(yīng)，制備平末端?？捎肒lenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5’或3’突出端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的DNA片段通過平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備3’端標(biāo)記的探針。用Klenow酶修復(fù)5’突出端的反應(yīng)主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填補(bǔ)反應(yīng)；而修復(fù)3’突出端則是用Klenow酶的3’→5’外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。用Klenow酶的切割反應(yīng)來修復(fù)3’突出端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。(2)標(biāo)記DNA3’突出端(protrudingend)。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用3’→5’的外切核酸酶活性除去3’突出端，產(chǎn)生3’隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物(32P-dNTP)存在下，使降解3’→5’)作用與聚合(5’→3’)作用達(dá)到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng)(exchange／replacementreaction)。不過這一反應(yīng)用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3’→5’的外切核酸酶活性較強(qiáng)。(3)其他的一些用途。包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法(primerextension)制備單鏈DNA探針等。5．堿性磷酸酯酶主要有兩種，細(xì)菌堿性磷酸酯酶（BIP）和小牛腸堿性磷酸酯酶（CIP），二者有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差別是CIP在68℃時失活，而BAP在68℃穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用：①dsDNA的5’端脫磷酸，防止DNA的自身連接。但是用CIP處理后，最好將CIP除去，再進(jìn)行連接反應(yīng)。②DNA和RNA脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。6．切口平移法制備DNA探針的原理是什么？答：在Mg離子存在時，用低濃度的DNA酶I（DNaseI）處理雙鏈DNA，使之隨機(jī)產(chǎn)生單鏈斷裂。然后用DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性可以從斷裂處的5'端除去一個核苷酸，而其聚合酶活性則將一個單核苷酸添加到斷裂處的3'端。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，即5'端核苷酸不斷去除，而3'端核苷酸同時摻入，導(dǎo)致斷裂形成的切口沿著DNA鏈按合成的方向移動，這種現(xiàn)象稱為切口平移。如果在反應(yīng)體系中加入放射性同位素標(biāo)記的核苷酸，則這些標(biāo)記的核苷酸將取代原來的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA分子，用作DNA分子雜交探針。質(zhì)粒及質(zhì)粒載體一、填空題1、基因工程中有三種主要類型的載體：質(zhì)粒DNA、病毒DNA、質(zhì)粒和病毒DNA雜合體。2．由于不同構(gòu)型的DNA插入EB的量不同，它們在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率也不同。SCDNA的泳動速度最快，OCDNA泳動速度最慢，LDNA居中，通過凝膠電泳和EB染色的方法可將不同構(gòu)型的DNA分別開來。3．就克隆一個基因(DNA片段)來說，最簡單的質(zhì)粒載體也必須包括三個部分：復(fù)制子（含有復(fù)制起點(diǎn)）、選擇標(biāo)記（主要是抗性基因）、克隆位點(diǎn)（便于外源DNA插入）。另外，一個理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子質(zhì)量。4．如果兩個質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于一個寄主細(xì)胞中，則屬于同一個不親和群，這是因為它們的復(fù)制機(jī)制相同所致。5．質(zhì)?？截悢?shù)是指細(xì)胞中質(zhì)粒的份數(shù)同染色體的比值，即質(zhì)粒／染色體。6．一個帶有質(zhì)粒的細(xì)菌在有EB的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，一部分細(xì)胞中已測不出質(zhì)粒，這種現(xiàn)象叫質(zhì)粒消除（或治愈）。7．pBR322是一種改造型的質(zhì)粒，它的復(fù)制子來源于pMB1，它的四環(huán)素抗性基因來自于pSC101，它的氨芐青霉素抗性基因來自于pSE2124(R質(zhì)粒)。8．YAC的最大容載能力是1000~2000kb，BAC載體的最大容載能力是300kb。9．把那些沒有可檢測表型的質(zhì)粒稱為隱蔽性質(zhì)粒。10．pUCl8質(zhì)粒是目前使用較為廣泛的載體。pUC系列的載體是通過pBR322和M13兩種質(zhì)粒改造而來。它的復(fù)制子來自pMB1，Amp抗性基因則是來自轉(zhuǎn)座子。11．Ti質(zhì)粒是自然界存在的植物基因工程的天然載體。12．既能在E．coli又能在S．cerevisiae中自我復(fù)制的載體DNA稱為穿梭載體。二、選項題（單選或多選）1．下面關(guān)于松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)性質(zhì)的描述中，(C)是不正確的。A．質(zhì)粒的復(fù)制只受本身的遺傳結(jié)構(gòu)的控制，而不受染色體復(fù)制機(jī)制的制約，因而有較多的拷貝數(shù)B．可以在氯霉素作用下進(jìn)行擴(kuò)增C.通常具有較少的拷貝數(shù)D．同嚴(yán)緊型質(zhì)粒整合后，雜合質(zhì)粒優(yōu)先使用松弛型質(zhì)粒的復(fù)制子2．基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載體中只有(B)被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體。A．pBR322B．pSC101C．pUB110D．pUC183．下列哪種克隆載體對外源DNA的容載量最大？(C)A．質(zhì)粒B．黏粒C．酵母人工染色體(YAC)D．λ噬菌體E．cDNA表達(dá)載體4．松弛型質(zhì)粒（D）。A．在寄主細(xì)胞中拷貝數(shù)較多B．可用氯霉素擴(kuò)增C．一般沒有選擇標(biāo)記D．上述A、B兩項正確5．ColEl是惟一用作基因工程載體的自然質(zhì)粒，這種質(zhì)粒(ACD)。A．是松弛復(fù)制型B．具有四環(huán)素抗性C．能被氯霉素擴(kuò)增D．能產(chǎn)生腸桿菌素6．同一種質(zhì)粒DNA，以三種不同的形式存在，電泳時它們的遷移速率是(B)。A．OCDNA>SCDNA>LDNAB．SCDNA>LDNA>OCDNAC．LDNA>OCDNA>SCDNAD．SCDNA>OCDNA>LDNA7．關(guān)于穿梭質(zhì)粒載體，下面哪一種說法最正確?(B)A．在不同的宿主中具有不同的復(fù)制機(jī)制B．在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制起點(diǎn)C．在不同的宿主細(xì)胞中使用不同的復(fù)制酶D．在不同的宿主細(xì)胞中具有不同的復(fù)制速率8．Ti質(zhì)粒(ACDE)。A．可從農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)到植物細(xì)胞中B．作為雙鏈DNA被轉(zhuǎn)移C．在植物中導(dǎo)致腫瘤D．介導(dǎo)冠癭堿的合成，作為細(xì)菌的營養(yǎng)物和植物的生長激素E．需要細(xì)菌的vir基因幫助轉(zhuǎn)移F．在植物細(xì)胞中作為染色體外質(zhì)粒9．下列哪些屬于重組DNA分子?(C)A．PCR擴(kuò)增的DNA片段B．單鏈RNA與單鏈DNA雜交得到的產(chǎn)物C．人基因組片段與質(zhì)粒載體連接的產(chǎn)物D．存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的λ噬菌體染色體E．質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶切后的產(chǎn)物10．LacZ基因通常用于構(gòu)建質(zhì)粒載體的目的是什么?(E)A．編碼一種限制性內(nèi)切核酸酶，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞時用于切割載體B．編碼藍(lán)色色素產(chǎn)物，可用于示蹤轉(zhuǎn)化的細(xì)胞C．編碼一種酶，將RNA轉(zhuǎn)化為DNAD．編碼一種抗生素抗性的酶E．編碼一種可檢測的酶,當(dāng)基因內(nèi)部的位點(diǎn)插入任何外源片段，ORF遭到破壞時，產(chǎn)物即不能表達(dá)11．一個質(zhì)粒含有四環(huán)素抗性基因(tetr)和LacZ基因，tetr內(nèi)有一HindIII位點(diǎn)，LacZ中有一EcoRI位點(diǎn)。如用這兩種切割載體一并連接入相應(yīng)的外源片段，則帶有該重組質(zhì)粒的細(xì)胞將(D)。A．有四環(huán)素抗性，在X-gal平板上呈現(xiàn)藍(lán)色B．對四環(huán)素敏感，在X-gal平板上呈現(xiàn)藍(lán)色C．有四環(huán)素抗陛，在X-gal平板上呈現(xiàn)白色D．對四環(huán)素敏感，在X-gal平板上呈現(xiàn)白色12．質(zhì)粒具備下列特征，因此適合作為克隆載體，除了(E)。A．賦予宿主細(xì)胞某種可檢測的特性B．可通過一定的純化步驟與宿主細(xì)胞基因組分離C．獨(dú)立復(fù)制的能力D．可復(fù)制自身DNA以及插入的外源DNAE．甲基化防止宿主的限制性內(nèi)切核酸酶對其降解13．下列對質(zhì)粒特性描述中，不正確的是(AC)。A．既能以單鏈環(huán)狀又能以雙鏈環(huán)狀的形式存在。B．是獨(dú)立于細(xì)菌染色體DNA以外的復(fù)制子C.沒有線性的質(zhì)粒DNAD．能夠自我復(fù)制三、判斷題1．迄今發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒DNA都是環(huán)狀的。錯誤。鏈霉菌屬質(zhì)粒為線狀2．一個帶有反向重復(fù)序列的雙鏈DNA經(jīng)變性后，復(fù)性時其單鏈可形成發(fā)夾環(huán)。正確3．能夠在不同的宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒叫穿梭質(zhì)粒。正確4．任何一種質(zhì)粒都可以用氯霉素擴(kuò)增的方法，增加它的拷貝數(shù)。錯誤，對氯霉素抗性質(zhì)粒不能5．只有完整的復(fù)制子才能進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制，一個失去了復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制子不能進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制。正確6．CsCl-EB密度梯度離心法純化SCDNA的原理是根據(jù)EB可以較多地插入到SCDNA中，因而沉降速度較快。錯誤，EB插入SCDNA量少，密度改變較小，離心后停留在較高部位密度小的地方7．質(zhì)粒ColE1同pSC101共整合后，得到的重組質(zhì)粒pSC134，具有兩個復(fù)制起始點(diǎn)，這兩個起始點(diǎn)在任何細(xì)胞中都是可以使用的。錯誤，一般使用ColE1的復(fù)制起始點(diǎn)8．所謂穿梭質(zhì)粒載體是能夠在兩種以上的不同宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒，所用的復(fù)制起點(diǎn)不同。正確9．一般情況下，質(zhì)粒既可以整合到染色體上，也可以獨(dú)立存在。錯誤，主要是獨(dú)立存在10．ColE1是惟一用作基因工程的自然質(zhì)粒載體，它具有四環(huán)素抗性標(biāo)記，因而很容易選擇。錯誤，其無四環(huán)素抗性基因11．某一染色體DNA經(jīng)內(nèi)切酶SalI切割后，產(chǎn)生了若干個具有黏性末端的DNA片段，將這些片段分別在T4DNA連接酶的作用下自身連接成環(huán)，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，這些片段都可以進(jìn)行獨(dú)立地復(fù)制。錯誤，無復(fù)制子12．基因克隆中，低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體是沒有用的。錯誤，對有劑量限制的基因克隆需用低拷貝質(zhì)粒載體四、問答題1．YAC載體具有什么樣的？為什么在克隆大片段時，YAC具有優(yōu)越性？答：（1）功能性DNA序列:①來自于酵母的125bpDNA片段的著絲點(diǎn)序列(CEN4)。②來自酵母的自主復(fù)制序列(ARS1)，起始在酵母中的DNA復(fù)制。③來自酵母的端粒序列，它是(5-TGTGGGTGTGGTG-3)的多拷貝重復(fù)，它對染色體的復(fù)制和維持是必需的。④在酵母中進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是這些基因的營養(yǎng)缺陷性，只有帶有這些基因的轉(zhuǎn)化體才能在選擇培養(yǎng)基上生活⑤具有細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。YAC載體通常含有ColE1的ori和氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因，可以在大腸桿菌中復(fù)制和繁殖，所以它也是一種穿梭載體。（2）優(yōu)越性：YAC能夠容納長達(dá)上千kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。2．列舉質(zhì)粒載體必須具有的基本條件。答：(1)能獨(dú)立復(fù)制；(2)具有選擇標(biāo)記；(3)有獨(dú)特的酶切位點(diǎn)；(4)能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散。3．舉例說明什么是穿梭載體？答：穿梭載體是含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒，有兩個復(fù)制起點(diǎn)和能在兩種不同細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個宿主(來回穿梭)。4．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全。進(jìn)行嚴(yán)格地監(jiān)控對質(zhì)粒載體的安全是十分重要的。請問質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾個方面?答：(1)非傳遞性和不被帶動轉(zhuǎn)移。對于多數(shù)基因克隆操作來說，都不希望載體能夠進(jìn)行自主傳遞，也不希望被帶動轉(zhuǎn)移。(2)具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pJC307(ColE1的衍生質(zhì)粒)在哺乳動物正常體溫下就喪失復(fù)制能力，可防止克隆基因擴(kuò)散，只存在于限定的宿主細(xì)胞中。(3)一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因為重組后有可能給宿主帶來突變。(4)有較小的宿主范圍。5.什么是YAC？YAC克隆載體常出現(xiàn)哪些問題？答：YAC即酵母人工染色體（YeastArtificialChromosome）的縮寫，是人工構(gòu)建的染色體樣大容量克隆載體，基本組成有著絲點(diǎn)、能在細(xì)菌和酵母中進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記及端粒。最大DNA克隆片段可達(dá)到2000kb。問題有：(1)YAC有嵌合現(xiàn)象，一個YAC中克隆的DNA片段可能來自兩個或多個不同的染色體。在基因組文庫中，嵌合體占克隆總數(shù)的10％～60％。(2)YAC內(nèi)部有重組現(xiàn)象，插入的DNA較大，序列發(fā)生重排，導(dǎo)致和原來染色體的序列不一致，重組很難檢出。(3)YAC還有缺失現(xiàn)象，影響YAC文庫的代表性。(4)YAC結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似，使用常規(guī)方法不易將YAC和酵母天然染色體分開。(5)構(gòu)建好的YAC轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。(6)建好庫后保存方便，但要篩選某個基因時工作量大6．什么是BAC？BAC載體的組成與優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？①細(xì)菌人工染色體（BAC）是從大腸桿菌F因子改造構(gòu)建而來的，能夠攜帶大約300kb的DNA插入片段。②載體具有F因子的復(fù)制起始點(diǎn)（oriS），可使載體維持每個細(xì)胞一個拷貝的水平。③載體包括有4個維持DNA復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因，repE,parA,parBandparC。④具有一個抗生素選擇標(biāo)記基因，和lacZ’基因。在lacZ’基因中組裝有一多克隆位點(diǎn)，便于外源片段的插入和藍(lán)白反應(yīng)篩選克隆子。⑤插入的DNA片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)百代，而且不易發(fā)生重組和從寄主細(xì)胞中丟失。⑥主要缺點(diǎn)是每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)少（1~2個），使得分離和篩選較為困難。7．利用pBR322質(zhì)粒插入失活分離帶有外源DNA片段的重組克隆的原理是什么？①外源DNA片段插入在pBR322質(zhì)粒tetr基因的編碼序列內(nèi)（BamHI）位點(diǎn)，使該基因失活；②體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ampstets菌株，并涂布在amp瓊脂平板上，凡獲得了pBR322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒(AmprTets)的寄主細(xì)胞都可長成菌落；③將amp瓊脂上的菌落原位影印在tet瓊脂平板上生長，對比這兩個平板的菌落生長情況，凡在amp平板上能夠生長而在tet平板上不能生長的菌落，便是屬于帶有重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克??；挑出這樣的陽性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA插入片段的重組體質(zhì)粒。8.pUC質(zhì)粒利用α-互補(bǔ)作用篩選重組子原理是什么？答：pUC系列質(zhì)粒載體是在pBR322質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來的，它用lacZ’基因取代了pBR322質(zhì)粒載體上的tetr基因。lacZ’基因編碼β-半乳糖苷酶的N末端1-63個氨基酸(α-肽鏈)的DNA片段,在lacZ’基因內(nèi)組入了一個多克隆位點(diǎn)（MCS），但不影響lacZ’基因的功能。pUC載體的宿主（E.coli）攜帶一個編碼β-半乳糖苷酶C端序列的基因片段,它們本身用這個基因片段產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶片段是無活性的,但它們可以通過α-互補(bǔ)作用在體內(nèi)相互彌補(bǔ),即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的β-半乳糖苷酶。當(dāng)pUC質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含有指示劑X-gal和IPTG的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，菌落成藍(lán)色。如果在MCS插入外源DNA片段（基因），破壞了lacZ’基因的功能（插入失活），不再產(chǎn)生α-肽鏈，不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是無(白)色的。因此，根據(jù)這種β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測出含有外源DNA插入序列的重組體克隆。9．自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多，即使是ColE1和pSCl01這兩個自然質(zhì)粒也不盡如人意，通常需要進(jìn)行改造。請問質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容?答：基本內(nèi)容包括：(1)刪除一些非必要的區(qū)段及對宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載體具有更大的容納外源片段的能力。(2)加上易于選擇或檢測的標(biāo)記。(3)限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的改造，便于外源基因插入到載體中的特定位置。(4)加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達(dá)。(5)安全性改造，限定載體的宿主范圍。10．質(zhì)粒制備的基本原理？答：帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞在SDS作用下裂解，并在堿性條件下使DNA變性。調(diào)節(jié)pH值至中性時，質(zhì)粒DNA首先復(fù)性，而細(xì)菌基因組DNA不能復(fù)性而與SDS-蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，可以被離心沉淀除去。上清液中的質(zhì)粒DNA分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀純化出來。噬菌體載體一、填空題1．噬菌體之所以被選為基因工程載體，主要有兩方面的原因：①它在細(xì)菌中能夠大量繁殖，這樣有利于外源DNA的擴(kuò)增；②對某些噬菌體（如λ噬菌體）的遺傳結(jié)構(gòu)和功能研究的比較清楚，其大腸桿菌宿主系統(tǒng)的遺傳研究的比較詳盡。2．λ噬菌體基因組DNA為48.5kb，根據(jù)λ噬菌體的包裝能力，其包裝DNA限度為37～51kb，為其本身基因組的75～105%。將野生型λ噬菌體的基因組DNA改造成插入型載體，如λZAPII，該載體的最小分子大小約為48.2kb，插入的外源片段最大不超過10.2kb。構(gòu)建的λ取代型載體λEMBL4，基因組大小為42.36kb，填充DNA片段為14kb，可容納的外源DNA分子最大為23kb。3．野生型的M13不適合用作基因工程載體，主要原因是沒有合適的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點(diǎn)和選擇標(biāo)記。4．黏粒(cosmid)是質(zhì)?！删w雜合載體，它的復(fù)制子來自質(zhì)粒，COS位點(diǎn)序列來自λ噬菌體，最大的克隆片段達(dá)到45kb。8．野生型的λ噬菌體DNA不宜作為基因工程載體，原因是：①分子質(zhì)量大；②酶的多切點(diǎn)；③無選擇標(biāo)記。9．M13單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制分為三個階段：①SS→RF；②RF→RF；③RF→SS。二、選擇題(單選或多選)1．限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI在野生型的入噬菌體DNA中有5個切點(diǎn)，HindIII有7個切點(diǎn)，BamHI也有5個切點(diǎn)。調(diào)整這些酶切位點(diǎn)的數(shù)量，主要通過(A)。A．體內(nèi)突變B．完全酶切后連接C.部分酶切D．先用甲基化酶修飾后再酶切2．pBluescriptM13載體在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)引入了T7和T3兩個噬菌體的啟動子，這樣增加了該載體的功能，下述四種功能中哪一種是不正確的?(D)A．可以對插入到多克隆位點(diǎn)的外源片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析B．利用這兩個啟動子的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增C．利用通用引物進(jìn)行序列分析D．利用這兩個啟動子進(jìn)行定點(diǎn)突變3．下面關(guān)于細(xì)菌人工染色體(BAC)的特征描述，除了(C)外都是正確的。A．通過電激法將大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌比酵母的轉(zhuǎn)化率提高了10~100倍B．BAC載體在細(xì)菌中以環(huán)形超螺旋狀態(tài)存在，使分離操作起來相對容易C．BAC載體在大腸桿菌宿主保持高拷貝D．克隆到BAC載體上的外源片段可以直接進(jìn)行測序以獲得末端序列4．以黏粒為載體轉(zhuǎn)染受體菌后，平板上生長的菌落會出現(xiàn)大小不一、生長速度不一的現(xiàn)象，其原因是(D)。A．營養(yǎng)成分不足B．重組后的質(zhì)粒復(fù)制不穩(wěn)定C.重組后的黏粒整合到宿主染色體上D．重組體中插入片段的大小不同5．黏粒（Cosmid）是一種人工構(gòu)建的載體，(AB)。A．它具有cos位點(diǎn)，因而可進(jìn)行體外包裝B．它具有質(zhì)粒DNA的復(fù)制特性C．進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起裂解反應(yīng)D．進(jìn)入受體細(xì)胞后，可引起溶原化反應(yīng)6．黏粒(cosmid)質(zhì)粒中，COS位點(diǎn)的功能是(C)。A．復(fù)制起點(diǎn)B．限制酶切位點(diǎn)C．參與包裝進(jìn)入病毒外殼D．選擇標(biāo)記E．用于篩選重組子7．關(guān)于λ噬菌體，下列描述有誤的是(C)。A．既能高效感染大腸桿菌，又能高效感染枯草桿菌B．在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其DNA呈雙鏈環(huán)狀分子C.改造成載體后，可攜帶23kb以上的外源DNA片段D．重組的噬菌體易于篩選和儲存8．下列關(guān)于黏粒載體的描述不正確的是(D)。A．是由λ噬菌體與質(zhì)粒DNA重組的載體B．既有質(zhì)粒的特性，又有噬菌體DNA的特性(如可體外包裝)C．可插入大片段的外源DNA片段D．可像YAC載體那樣構(gòu)建大片段的基因組文庫三、判斷題1．取代型載體(replacementvector)是指同一種限制性內(nèi)切核酸酶在λDNA中具有兩個切點(diǎn)。外源DNA通__________過取代這兩個切點(diǎn)間的片段被克隆。錯誤，不一定是同一種酶，取決于填充片段兩端酶切位點(diǎn)2．現(xiàn)在最常用的pUC載體是pUC18，它的分子質(zhì)量小，具有多克隆位點(diǎn)和易于選擇的分子標(biāo)記，并且是松弛型復(fù)制。另外，這種載體可在輔助質(zhì)粒的幫助下合成單鏈DNA。錯誤，不能形成單鏈3．λ噬菌體DNA和M13單鏈?zhǔn)删wDNA在成熟前的DNA復(fù)制都是用滾環(huán)模型。正確4．M13噬菌體每個世代裂解宿主后，可釋放100個子代噬菌體。錯誤，不裂解5．以黏粒（Cosmid）為載體的重組體雖然在平板上生長的速度不同，但是轉(zhuǎn)化子中插入片段的擴(kuò)增量是相同的。錯誤，由于重組體在平板上生長速度不同，轉(zhuǎn)化子中插入片段擴(kuò)增量不同四、問答題1．λ噬菌體DNA被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件？為什么？答：①兩個cos位點(diǎn)；②線性DNA；③分子大小在λ噬菌體基因組的75%～105%。2．為什么野生型的λ噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?答：(1)噬菌體DNA沒有容載能力，因為噬菌體的頭部對DNA包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將λ噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大小；(2)野生型的λDNA對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點(diǎn)，不便于克??；(3)沒有可供選擇的標(biāo)記；(4)野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。3．什么是藍(lán)白斑篩選法?4．λ噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足?答：優(yōu)點(diǎn)：(1)λ基因組中有1／3的非必需區(qū)可以被置換。改造成載體后，克隆的片段較大(可達(dá)20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個kb；(2)用噬菌體λDNA作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；(3)λ可通過溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時，可讓它以溶原性存在，若要表達(dá)，可通過誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA的拷貝數(shù)就會很多。缺點(diǎn)：(1)包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費(fèi)用高；(2)沒有質(zhì)粒的用途廣泛。5．以置換型λ噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組體?答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過入基因組的105％，不能小于又基因組的75％。以置換型λ噬菌體DNA作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源DNA重組。如果沒有外源片段，僅是兩臂連接，長度短于久基因組的75％，不能被包λ噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長度超過λ基因組105％后，也不能包入噬菌體顆粒，自然也不能形成噬菌斑。6．M13系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?答：M13克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：(1)克隆的片段大：M13噬菌體的DNA在包裝時不受體積的限制，所以容載能力大。有報道，有些噬菌體顆粒可以包裝比野生型絲狀噬菌體DNA長6～7倍的DNA(插入片段可達(dá)40kb)。(2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對于DNA測序、DNA誘變、制備特異的單鏈DNA探針都是十分有用的。(3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。M13克隆系列的不足：(1)較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過程中往往不夠穩(wěn)定。一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的概率越大。(2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。7．黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?答：主要特點(diǎn)有：①柯斯質(zhì)粒是含有λ噬菌體COS位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。柯斯質(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素擴(kuò)增。②具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。③插入片段的消化、連接及后來重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。④具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞不同，重組體像λ載體一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)菌。⑤包裝后形成的λ顆粒用來感染大腸桿菌，重組DNA像λDNA一樣注入細(xì)菌細(xì)胞，并以COS位點(diǎn)環(huán)化。由于缺乏λ的其他DNA序列，環(huán)化DNA在細(xì)菌體內(nèi)以質(zhì)粒一樣維持。⑥簡化了篩選。載體體積小，承載外源DNA片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因為要被成功包裝，至少要7個分子的載體自連。盡管如此，也是不能被包裝的，因為COS位點(diǎn)太多了。重組體只有達(dá)到32-45kb才能有效包裝體外包裝，這就提供了對重組體的正向選擇。⑦對轉(zhuǎn)化體的選擇是基于載體上的抗生素標(biāo)記。⑧感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒載體也有如下不足：①如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發(fā)生重組，結(jié)果會使被克隆的片段重排或丟失。②含不同重組DNA片段的菌落生長速度不同，會造成同一個平板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段對宿主細(xì)胞的作用不同，會造成文庫擴(kuò)增量的比例失調(diào)。③包裝過程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價高。核酸分離、純化與測序、PCR技術(shù)一、填空題1．SDS是分離DNA時常用的一種陰離子除垢劑，它有四個作用：①溶解膜蛋白及脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；②溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；③對RNase、DNase有一定的抑制作用；④SDS能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合形成R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀。2．酚是蛋白質(zhì)變性劑，用酚抽提細(xì)胞DNA時，具有兩方面的作用：①是蛋白質(zhì)變性；②由于它能使蛋白質(zhì)變性，故也能使核小體和核糖體解聚，釋放出DNA和RNA,提高DNA的得率。3．用酚—氯仿抽提DNA時，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少許異戊醇。這是因為，異戊醇是一種有機(jī)溶劑，可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。4．同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有兩個顯著的優(yōu)點(diǎn)：①水解能力強(qiáng)，作用范圍廣；②在SDS和EDTA中仍保持高活性，可以同SDS和EDTA同時使用。5．在分離DNA時要使用金屬離子螯合劑，如EDTA和檸檬酸鈉等，其目的是螯合Mg2+抑制核酸酶的活性。6．用乙醇沉淀DNA時，通常要在DNA溶液中加入單價的陽離子，如NaCl和NaAc，其目的是中和DNA分子的負(fù)電荷，增加DNA分子間的凝聚力。7．通常可在三種溫度下保存DNA：4~5℃、-20℃、-70℃，其中以-70℃最好。8．引物在基因工程中至少有四個方面的用途：①合成探針；②合成cDNA；③用于PCR反應(yīng)；④進(jìn)行序列分析。9．Clark發(fā)現(xiàn)用TaqDNA聚合酶得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物不是平末端，而是有一個突出堿基末端的雙鏈DNA分子。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計了克隆PCR產(chǎn)物的T載體。10．在用SDS分離DNA時，要注意SDS的濃度，0．1％和1％的SDS的作用效果是不同的，前者只將RNA分離出來，后者可將DNA和RNA一同分離出來。11．在DNA分離過程中，通常要進(jìn)行透析，其目的是除去小分子的無機(jī)離子。12．在分離質(zhì)粒DNA的菌體培養(yǎng)過程中，加入氯霉素有兩個好處：①可以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA；②抑制菌體數(shù)量，有利于裂解。13．在DNA分離過程中造成DNA分__________子斷裂的因素很多，主要有：①核酸酶降解；②化學(xué)降解；③物理剪切。14．在DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起抑制真菌污染的作用。15．按照人們的意愿，改變基因中堿基的組成，以達(dá)到基因突變的技術(shù)稱為定點(diǎn)突變。16．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在第二鏈