《肉及肉制品中雞鴨源性成分的鑒定梯型熔解溫度等溫擴增檢測方法》編制說明（征求意見稿）

2肉及肉制品中雞鴨源性成分的鑒定梯型熔解溫度等溫擴增檢測方法本文件規(guī)定了肉及肉制品中雞鴨源性成分的梯型熔解溫度等溫擴增檢測方法。本文件適用于肉及肉制品中雞鴨源性成分的定性檢測。本文件所規(guī)定方法的檢出限（LOD）為0.1%（質(zhì)量比）。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T9695.19肉與肉制品取樣方法GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4方法提要提取樣品DNA，用已知含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA為陽性對照，已知不含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA為陰性對照，滅菌雙蒸水作為空白對照，使用特異性引物和探針，采用梯型熔解溫度等溫擴增技術(shù)，根據(jù)熒光信號和擴增現(xiàn)象，判定是否存在雞肉、鴨肉成分。5原理選擇Tm值曲線為梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特異性核酸片段為靶序列設(shè)計巢式引物，將巢式引物的外引物與內(nèi)引物分別連接成一對引物作為等溫擴增用引物，借助外引物與核酸靶序列上對應(yīng)片段的熔解溫度差異提供單鏈模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通過合成反應(yīng)與鏈替代反應(yīng)對梯型Tm值曲線的靶標核酸片段進行等溫擴增，進行不同肉類成分的定性分析。6試劑或材料3T/HNSPXHXXX—XXXX除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682中一級水的規(guī)格。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。6.1動物組織DNA提取試劑盒。6.2梯型熔解溫度等溫擴增檢測LMTIA試劑盒。Proofman探針法6.3梯型熔解溫度等溫擴增檢測LMTIA的引物和探針。雞肉、鴨肉引物和探針詳見表1。雞肉和鴨肉引物擴增的靶標序列參見附錄A。6.4梯型熔解溫度等溫擴增檢測反應(yīng)混合液（5μL（2X）通用型LMTIA預混液，0.4μL(100U/μL)(U,Unit，酶學單位)Bst酶）。表1雞肉、鴨肉成分鑒定用引物和探針序列名稱序列(5’→3’)靶基因雞肉正向引物F:GACGCCCGGCCTCGTTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGTITS反向引物B:GCGTCCGGCCGAGCTTTTGGAAGGGAAGGGAAGGCTG環(huán)引物LF:TCCTTCCGCAGGTTCAC環(huán)引物LB:ACGAGCGCGCGCGGG探針:BHQ2-TCCTTCCGCAGGTTA-6-FAM鴨肉正向引物F:CAGCCCCGGTAATGATTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGTITS反向引物B:ACCGGGGCTGGGCCTTTTGGGCTCCGTCGCTCAC環(huán)引物LF:CTTCCGCAGGTTCACCT環(huán)引物LB:GGCTTGGGCGTCGCA探針:BHQ2-GGCTTGGGCGTCT-JOE7儀器設(shè)備7.1等溫熒光擴增儀。7.2恒溫水浴鍋。7.3離心機：離心力≥12000g。7.5恒溫混勻儀。7.6渦旋震蕩器。7.7pH計，精度為0.01。7.8天平：感量0.01g。7.9微量紫外-可見分光光度計。8檢測步驟8.1DNA提取應(yīng)采用市售的動物組織DNA提取試劑盒提取。注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用雙蒸水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,以防DNA降解。8.2DNA濃度與純度的檢測使用核酸蛋白儀或微量紫外-可見分光光度計檢測提取DNA的濃度與純度。分別檢測260nm和280nm處的吸光值，每個樣品重復測三次，取平均值。當A260/A280比值在1.6～2.0時，可用于LMTIA擴增。8.3梯型熔解溫度等溫擴增8.3.1梯型熔解溫度等溫擴增反應(yīng)體系梯型熔解溫度等溫擴增反應(yīng)體系見表2。PCR八聯(lián)管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。放入等溫熒光擴增儀。表2梯型熔解溫度等溫擴增反應(yīng)體系（10μL）試劑體積(μL）梯型熔解溫度等溫擴增反應(yīng)混合液5.4正向引物F（100μmol/L）0.16反向引物B（100μmol/L）0.16環(huán)引物LF（100μmol/L）0.04環(huán)引物LB（100μmol/L）0.04探針（10μmol/L）0.2滅菌雙蒸水2.0DNA模板2.08.3.2梯型熔解溫度等溫擴增反應(yīng)程序按照表2配制雞肉、鴨肉基因的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序為：等溫熒光擴增儀，雞肉、鴨肉的檢測溫度分別設(shè)置為62℃和66℃,設(shè)置40個循環(huán)，每個循環(huán)30s。在樣品等溫擴增的同時，檢測過程中應(yīng)分別設(shè)立陽性對照和陰性對照。用已知含含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA作陽性對照，用已知不含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA作陰性對照，和空白對照（滅菌雙蒸水），實驗重復三次。9結(jié)果判定5T/HNSPXHXXX—XXXX若有FAM熒光檢出，等溫熒光擴增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢的曲線，則判定樣品含有雞源性成分，表述為“檢出雞肉成分”;S曲線參考附錄B；若有JOE熒光檢出，等溫熒光擴增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢的曲線，則判定樣品含有鴨源性成分，表述為“檢出鴨肉成分”;S曲線參考附錄B；如無FAM熒光檢出，無S典型擴增曲線，則判定為不含雞源性性成分，表述為“未檢出雞肉成分”;如無JOE熒光檢出，無S典型擴增曲線，則判定為不含鴨源性成分，表述為“未檢出鴨肉成分”;在樣品梯型熔解溫度等溫擴增的同時，應(yīng)設(shè)置梯型熔解溫度等溫擴增陰性對照、梯型熔解溫度等溫擴增陽性對照和梯型熔解溫度等溫擴增空白對照，實驗重復三次。10檢測過程中防止交叉污染的措施檢測過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403-2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。附錄A（規(guī)范性）/（材料性）雞肉成分的基因擴增靶標參考序列AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGGGGCCGAGGCCGGGCGTCCGGCCGAGCCGTGGCACGAGCGCGCGCGGGCGCGCAGCCTTCCCTTCCCTTCC注:下劃線標記處為引物位置。鴨肉成分的基因擴增靶標參考序列AGTCGTAACAAGG