《肉及肉制品中雞鴨源性成分的鑒定梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法》編制說(shuō)明（征求意見稿）

2肉及肉制品中雞鴨源性成分的鑒定梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法本文件規(guī)定了肉及肉制品中雞鴨源性成分的梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。本文件適用于肉及肉制品中雞鴨源性成分的定性檢測(cè)。本文件所規(guī)定方法的檢出限（LOD）為0.1%（質(zhì)量比）。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T9695.19肉與肉制品取樣方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4方法提要提取樣品DNA，用已知含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA為陽(yáng)性對(duì)照，已知不含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA為陰性對(duì)照，滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照，使用特異性引物和探針，采用梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，根據(jù)熒光信號(hào)和擴(kuò)增現(xiàn)象，判定是否存在雞肉、鴨肉成分。5原理選擇Tm值曲線為梯型（包括人字梯型、半人字梯型和直梯型）的特異性核酸片段為靶序列設(shè)計(jì)巢式引物，將巢式引物的外引物與內(nèi)引物分別連接成一對(duì)引物作為等溫?cái)U(kuò)增用引物，借助外引物與核酸靶序列上對(duì)應(yīng)片段的熔解溫度差異提供單鏈模板，在DNA聚合酶（大片段）催化下通過(guò)合成反應(yīng)與鏈替代反應(yīng)對(duì)梯型Tm值曲線的靶標(biāo)核酸片段進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，進(jìn)行不同肉類成分的定性分析。6試劑或材料3T/HNSPXHXXX—XXXX除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器分裝。6.1動(dòng)物組織DNA提取試劑盒。6.2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)LMTIA試劑盒。Proofman探針?lè)?.3梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)LMTIA的引物和探針。雞肉、鴨肉引物和探針詳見表1。雞肉和鴨肉引物擴(kuò)增的靶標(biāo)序列參見附錄A。6.4梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)混合液（5μL（2X）通用型LMTIA預(yù)混液，0.4μL(100U/μL)(U,Unit，酶學(xué)單位)Bst酶）。表1雞肉、鴨肉成分鑒定用引物和探針序列名稱序列(5’→3’)靶基因雞肉正向引物F:GACGCCCGGCCTCGTTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGTITS反向引物B:GCGTCCGGCCGAGCTTTTGGAAGGGAAGGGAAGGCTG環(huán)引物L(fēng)F:TCCTTCCGCAGGTTCAC環(huán)引物L(fēng)B:ACGAGCGCGCGCGGG探針:BHQ2-TCCTTCCGCAGGTTA-6-FAM鴨肉正向引物F:CAGCCCCGGTAATGATTTTAGTCGTAACAAGGTTTCCGTITS反向引物B:ACCGGGGCTGGGCCTTTTGGGCTCCGTCGCTCAC環(huán)引物L(fēng)F:CTTCCGCAGGTTCACCT環(huán)引物L(fēng)B:GGCTTGGGCGTCGCA探針:BHQ2-GGCTTGGGCGTCT-JOE7儀器設(shè)備7.1等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。7.2恒溫水浴鍋。7.3離心機(jī)：離心力≥12000g。7.5恒溫混勻儀。7.6渦旋震蕩器。7.7pH計(jì)，精度為0.01。7.8天平：感量0.01g。7.9微量紫外-可見分光光度計(jì)。8檢測(cè)步驟8.1DNA提取應(yīng)采用市售的動(dòng)物組織DNA提取試劑盒提取。注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過(guò)小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用雙蒸水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃,以防DNA降解。8.2DNA濃度與純度的檢測(cè)使用核酸蛋白儀或微量紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度與純度。分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)三次，取平均值。當(dāng)A260/A280比值在1.6～2.0時(shí)，可用于LMTIA擴(kuò)增。8.3梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增8.3.1梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系見表2。PCR八聯(lián)管中按表1依次加入反應(yīng)試劑，混勻。放入等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀。表2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系（10μL）試劑體積(μL）梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)混合液5.4正向引物F（100μmol/L）0.16反向引物B（100μmol/L）0.16環(huán)引物L(fēng)F（100μmol/L）0.04環(huán)引物L(fēng)B（100μmol/L）0.04探針（10μmol/L）0.2滅菌雙蒸水2.0DNA模板2.08.3.2梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)程序按照表2配制雞肉、鴨肉基因的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋旱葴責(zé)晒鈹U(kuò)增儀，雞肉、鴨肉的檢測(cè)溫度分別設(shè)置為62℃和66℃,設(shè)置40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)30s。在樣品等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)分別設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。用已知含含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA作陽(yáng)性對(duì)照，用已知不含雞肉、鴨肉成分的樣品DNA作陰性對(duì)照，和空白對(duì)照（滅菌雙蒸水），實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。9結(jié)果判定5T/HNSPXHXXX—XXXX若有FAM熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢(shì)的曲線，則判定樣品含有雞源性成分，表述為“檢出雞肉成分”;S曲線參考附錄B；若有JOE熒光檢出，等溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀中出現(xiàn)S型或S型趨勢(shì)的曲線，則判定樣品含有鴨源性成分，表述為“檢出鴨肉成分”;S曲線參考附錄B；如無(wú)FAM熒光檢出，無(wú)S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含雞源性性成分，表述為“未檢出雞肉成分”;如無(wú)JOE熒光檢出，無(wú)S典型擴(kuò)增曲線，則判定為不含鴨源性成分，表述為“未檢出鴨肉成分”;在樣品梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增陰性對(duì)照、梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照和梯型熔解溫度等溫?cái)U(kuò)增空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。10檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403-2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。附錄A（規(guī)范性）/（材料性）雞肉成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGGGGCCGAGGCCGGGCGTCCGGCCGAGCCGTGGCACGAGCGCGCGCGGGCGCGCAGCCTTCCCTTCCCTTCC注:下劃線標(biāo)記處為引物位置。鴨肉成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列AGTCGTAACAAGG