體外診斷試劑注冊申報資料模板-主要生產(chǎn)工藝和反應(yīng)體系研究

主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究XXXXX檢測試劑盒（XXXXX法）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料XXXXX有限公司2- 目錄 TOC\o"1-3"\h\u一、 主要生產(chǎn)工藝的優(yōu)化 主要生產(chǎn)工藝的優(yōu)化（一）文庫接頭的配制研究反應(yīng)體系的研究（一）樣本的采集及處理本試劑盒的檢測對象為福爾馬林固定的石蠟包埋（FFPE）的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織樣本，必須按照標(biāo)準(zhǔn)的病理學(xué)方法進(jìn)行處理和保存，以確保樣本的質(zhì)量，且采樣不超過？年。用于提取的總核酸的組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞含量應(yīng)達(dá)20%以上。所有樣本均視為有潛在感染性的物品，操作時按國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。-70℃冷凍樣本，解凍后石蠟包埋：手術(shù)后直接石蠟包埋后常溫保存：（二）核酸片段化和補平反應(yīng)體系研究試驗?zāi)康谋容^核酸片段化試劑和補平加尾試劑分開加入和同時加入的差異。檢測對象片段化緩沖液、片段化酶、連接緩沖液、連接酶1。主要儀器PCR儀、2100生物分析儀、熒光PCR儀、磁力架、移液器。樣本及來源（細(xì)胞系或者臨床樣本均可）研究方法使用核酸提取試劑對樣本核酸進(jìn)行提取，以其為模板分別進(jìn)行片段化處理和補平加尾處理。其中，片段化處理分別設(shè)5分鐘和10分鐘反應(yīng)時間，另外設(shè)片段化和補平、加尾步驟合并和分開加兩類，兩個變量兩兩組合。產(chǎn)物經(jīng)Agilent2100生物分析儀分析。分段化處理設(shè)三個反應(yīng)時間：5分鐘、10分鐘、15分鐘，另外設(shè)片段化和補平、加尾步驟合并和分開加兩類，兩個變量兩兩組合。產(chǎn)物建庫，考察文庫產(chǎn)量，以不作FC處理作為對照。試驗結(jié)果6.12100分析結(jié)果Agilent2100分析結(jié)果如圖06-2-1至06-2-4所示。四組產(chǎn)物2100分析結(jié)果顯示，。6.2文庫定量結(jié)果六組處理的的文庫定量結(jié)果如表6-2-1所示。表6-2-1不同F(xiàn)B、FC處理條件的文庫定量結(jié)果反應(yīng)過程文庫濃度（nM）37℃/0m+72℃/15m37℃/5m+72℃/15m37℃/10m+72℃/15m37℃/15m+72℃/15mFB、FC分開FB、FC合并文庫定量結(jié)果顯示。實驗結(jié)論由以上兩組試驗結(jié)果可知。為確保各類核酸樣本都能得到較好的片段化，選擇。（三）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的研究試驗?zāi)康脑O(shè)置不同的逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑的加入量，篩選出經(jīng)濟、高效的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件。主要儀器PCR儀（Veriti96-wellThermalCycler）、熒光PCR儀（QuantStudio3Real-TimePCRSystem）、磁力架、移液器。試劑40U/μLRNA抑制劑(Enzymatics)，200U/μL逆轉(zhuǎn)錄酶(EnzScript,Enzymatics)。實驗樣本（細(xì)胞系或者臨床樣本均可）研究方法以9份核酸為模板建庫，在19uL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中分別設(shè)置3種逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑加入量，具體加入量如下表：逆轉(zhuǎn)錄酶RNA抑制劑實驗組1100U20U實驗組2200U40U實驗組3400U80U分析文庫產(chǎn)量及測序后RNA質(zhì)控結(jié)果。研究結(jié)果6.1三組試驗的文庫產(chǎn)量如表1所示。表1.文庫產(chǎn)量比較序號樣本100倍稀釋的文庫濃度（pM）實驗組1實驗組2實驗組3123456789從表1所示，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑的加入量為100U和20U時，有兩個樣本文庫產(chǎn)量較低（100倍稀釋液濃度＜1pM）。另外兩組試驗結(jié)果均符合要求。6.2三組試驗的文庫測序分析質(zhì)控分析如表2所示。表2.文庫測序分析質(zhì)控結(jié)果序號樣本RNA/DNA值實驗組1實驗組2實驗組3123456789從表2所示，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑用量為100U和20U時，有3個樣本文庫RNA質(zhì)控結(jié)果不合格（RNAreads/DNAreads值＜0.3）。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑用量為200U和40U、400U和80U時，9個樣本文庫RNA質(zhì)控均合格（RNAreads/DNAreads值≥0.3）。實驗結(jié)論由以上研究結(jié)果可知，。（四）接頭融化方式研究試驗?zāi)康脑O(shè)置不同的接頭融化條件，篩選出適合接頭融化條件。主要儀器PCR儀（Veriti96-wellThermalCycler）、熒光PCR儀（QuantStudio3Real-TimePCRSystem）、磁力架、移液器。實驗樣本（細(xì)胞系或者臨床樣本均可）研究方法以SW480核酸（DNA50ng）為模板建庫，設(shè)置3種不同的接頭融化方式：a.冰上融化；b.手捂熱融化；c.37℃融化。分析文庫產(chǎn)量。研究結(jié)果接頭不同融化方式對產(chǎn)量的影響測試結(jié)果如表1，接頭不同融化方式所構(gòu)文庫產(chǎn)量均符合建庫要求(100倍稀釋液濃度≥1pM)。表表1接頭不同融化方式對產(chǎn)量的影響測試結(jié)果接頭文庫濃度（pM,100倍稀釋液）冰上融化手捂熱融化37℃融化實驗結(jié)論三種不同接頭融化方式對文庫產(chǎn)量影響不大，考慮到核酸在低溫條件下穩(wěn)定性較好，建議冰上融化接頭。（五）連接酶的研究試驗?zāi)康脑谶B接過程中設(shè)置不同的連接酶使用量，選出經(jīng)濟、高效的連接反應(yīng)條件。主要儀器PCR儀、熒光PCR儀、磁力架、移液器。試劑T4DNALigase。。。。實驗樣本（細(xì)胞系或者臨床樣本均可）研究方法以8份核酸為模板建庫，21ul連接反應(yīng)體系中設(shè)置3種核酸連接酶加入量：①連接體系中加入60U連接酶；②連接體系中加入120U連接酶；③連接體系中加入240U連接酶。分析文庫產(chǎn)量。研究結(jié)果3組試驗的文庫產(chǎn)量如表1所示。當(dāng)連接過程中加入60U、120U和240U核酸連接酶時，三組試驗結(jié)果均符合要求。表1表13種不同用量核酸連接酶文庫產(chǎn)量比較序號樣本100倍稀釋的文庫濃度（pM）DNA核酸連接酶60U120U240U12345678實驗結(jié)論由以上研究結(jié)果可知，。（六）擴增反應(yīng)體系的研究試驗?zāi)康脑O(shè)置不同的PCR1延伸溫度、延伸時間和PCR2循環(huán)數(shù)，篩選出快速、高特異性的PCRs反應(yīng)條件。主要儀器PCR儀（Veriti96-wellThermalCycler）、熒光PCR儀（QuantStudio3Real-TimePCRSystem）、磁力架、移液器。實驗樣本（細(xì)胞系或者臨床樣本均可）研究方法試驗一：PCR2循環(huán)次數(shù)研究，以SW480核酸為模板建庫，分別設(shè)置15cycles、18cycles、21cycles、24cycles四組試驗，每組重復(fù)兩次。分析文庫產(chǎn)量。試驗二：PCR1延伸溫度研究，以SW480核酸為模板建庫，分別設(shè)置60℃、63℃、65℃、67℃四組延伸溫度，每組重復(fù)三次。分析文庫產(chǎn)量。試驗三：PCR1延伸時間研究，以SW480核酸為模板建庫，在試驗一得到的PCR1延伸溫度基礎(chǔ)上，設(shè)置PCR13min、5min、7min、10min四組延伸時間，每組重復(fù)三次。分析文庫產(chǎn)量及測序后OnTarget值。研究結(jié)果PCR2循環(huán)數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如表6-3-1，表表6-3-1PCR2循環(huán)次數(shù)優(yōu)化結(jié)果序號文庫AdaptorPCR1P7標(biāo)簽PCR2PCR2循環(huán)數(shù)100倍稀釋文庫的濃度pM12345678四組試驗的文庫產(chǎn)量隨PCR2循環(huán)數(shù)的增加而增加，當(dāng)PCR2達(dá)到15cycles時，文庫產(chǎn)量已滿足測序要求。結(jié)合以往的實驗結(jié)果，設(shè)置PCR2循環(huán)數(shù)≥16cycles作為反應(yīng)條件。PCR1延伸溫度優(yōu)化結(jié)果如表6-3-2所示。表6-3-2PCR1延伸溫度優(yōu)化結(jié)果序號文庫編號AdapterIndexPCR1PCR2100倍稀釋文庫的濃度pM123456789101112四組不同PCR1延伸溫度實驗所建文庫產(chǎn)量有較大差異，隨溫度降低，產(chǎn)量明顯增加。暫選產(chǎn)量最高60℃作為PCR1備選溫度。在此基礎(chǔ)上，對PCR1延伸溫度作進(jìn)一步研究。PCR1延伸時間優(yōu)化的結(jié)果如表6-3-3。表6-3-3PCR1延伸時間優(yōu)化結(jié)果序號文庫編號AdapterIndexPCR1PCR2100倍稀釋文庫濃度pMOnTarget值%123456789101112四組不同PCR1延伸時間所建的文庫的OnTarget值無明顯差異，但文庫產(chǎn)量有較大變動，隨延伸時間的延長，產(chǎn)量呈明顯增加趨勢。以產(chǎn)量最高的條件，即延伸時長10min作為PCR1反應(yīng)條件。實驗結(jié)論由以上研究結(jié)果，確定延伸溫度？？℃，延伸時間？？min，轉(zhuǎn)速？？C/s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)≥？？cycles作為PCR1反應(yīng)條件。質(zhì)控方法（一）陰陽性對照品（每次檢測質(zhì)控方法）為評價每次試驗結(jié)果的有效性和一致性建立了陰陽對照品，每次試驗均需檢測。每次試驗應(yīng)同時滿足陰性對照品檢出為陰性和陽性對照品檢出為陽性，否則試驗結(jié)果視為無效。（二）企業(yè)參考品盤（試劑盒質(zhì)量質(zhì)控方法）建立企業(yè)參考品盤用以評價成品性能和保證質(zhì)量。該企業(yè)參考品盤包括n份企業(yè)陽性參考品，1份企業(yè)陰性參考品，n份企業(yè)最低檢測限參考品。需滿足以下條件：檢測企業(yè)陽性參考品P1-Pn，結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)的基因突變型。檢測企業(yè)陰性參考品N，結(jié)果應(yīng)為未檢出相應(yīng)的基因突變型.檢測企業(yè)檢測限參考品L1-Ln，結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)的基因突變型。使用經(jīng)標(biāo)化的企業(yè)陽性參考品P1，重復(fù)檢測10次，結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)的基因突變型。使用經(jīng)標(biāo)化的企業(yè)陰性參考品N，重復(fù)檢測10次，結(jié)果應(yīng)為未檢出相應(yīng)的基因突變型。生產(chǎn)工藝性能考核按照優(yōu)化好的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系，檢測企業(yè)參考品盤，考核