DB23T 3873-2024實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30CCSB4423IDB23/T3873—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省科學(xué)技術(shù)廳提出并歸口。本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：陳建飛、馮力、劉懷然、張鑫、郭龍軍、石達(dá)、時(shí)洪艷。1DB23/T3873—2024實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)豬副流感病毒5型RT-PCR檢測的樣品采集、樣品記錄保存、樣品處理、病毒RNA提取、RT-PCR操作程序和結(jié)果判定的要求，描述了相應(yīng)的操作方法。本文件適用于實(shí)驗(yàn)豬糞便、小腸及內(nèi)容物中副流感病毒5型的定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T1948獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則SN/T4835—2017實(shí)驗(yàn)室生物廢棄物管理要求3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。cDNA：互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementaryceoxyribonucleicacid）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）ddH2O：雙蒸水（doubledistilledwater）dNTPs：三磷酸脫氧核糖核苷混合物（deoxyribonucleotidetriphosphatemixture）M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（moloneyMurineLeukemiaVirus）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）PPIV5：豬副流感病毒5型（porcineparainfluenzavirus5）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscription-polymerasechainreaction）5基本要求5.1生物安全2DB23/T3873—2024應(yīng)按照GB19489、NY/T1948、SN/T4835－2017的規(guī)定執(zhí)行。5.2人員5.2.1采樣人員應(yīng)具有一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)，熟練掌握采樣工作程序和采樣操作技術(shù)。采樣時(shí)應(yīng)戴口罩、手套，穿一次性防護(hù)服、鞋套。5.2.2檢測人員進(jìn)行樣品處理、病毒RNA提取和RT-PCR操作時(shí)應(yīng)穿工作服、戴一次性無菌手套。6樣品采集6.1采樣工具6.1.1手術(shù)刀、剪刀和鑷子應(yīng)無菌處理。6.1.2一次性無菌注射器、無菌采樣棉簽和無菌采樣管（2mL、25mL、50mL）。6.2糞便采集用一次性無菌注射器吸取腹瀉豬只的糞便1mL～2mL，或輕輕擠壓腹瀉豬的腹部，用無菌采樣棉簽從肛門處采集糞便5g～10g，放入無菌采樣管中編號(hào)保存?zhèn)溆谩?.3小腸及內(nèi)容物采集用手術(shù)刀剖開病死仔豬腹腔，分別在病變明顯（膨脹、腸壁變薄、充滿淡黃色或灰色液體）的腸管兩端結(jié)扎，用剪刀在結(jié)扎線外端剪斷，放入無菌采樣管中編號(hào)保存?zhèn)溆谩?樣品保存記錄7.1保存樣品應(yīng)及時(shí)采用低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。樣品在2℃~8℃條件下保存不應(yīng)超過24h；在-20℃~-15℃條件下保存不應(yīng)超過1個(gè)月。7.2記錄收到樣品后，應(yīng)做好記錄。8樣品處理8.1糞便在生物安全柜內(nèi)向保存樣品的無菌采樣管中加入等體積含雙抗的0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（A.1），經(jīng)振蕩器2000r/min震蕩3min～5min，經(jīng)離心機(jī)4℃、5000r/min離心20min，取上清液，立即進(jìn)行病毒RNA提取。注：如不能立即試驗(yàn)，可冷凍保存上清液，并在2日內(nèi)提取病毒RNA。8.2小腸及內(nèi)容物3DB23/T3873—2024在生物安全柜內(nèi)取3cm～5cm的小腸及其內(nèi)容物，稱重，用含雙抗的0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（A.1）按重量體積比制成5倍懸液，經(jīng)離心機(jī)4℃、5000r/min離心20min，取上清液，立即進(jìn)行病毒RNA提取。注：如不能立即試驗(yàn)，可冷凍保存上清液，并在2日內(nèi)提取病毒RNA。9病毒RNA提取在生物安全柜內(nèi)提取病毒RNA，提取方法按照附錄B執(zhí)行。注：如不能立即進(jìn)行cDNA合成，可將病毒RNA置-70℃保存，并在2日內(nèi)使用。10RT-PCR操作程序10.1cDNA合成在生物安全柜內(nèi)合成cDNA，合成方法按照附錄C執(zhí)行。注：如不能立即進(jìn)行PCR反應(yīng)，可將cDNA置-20℃保存，并在2日內(nèi)使用。10.2PCR反應(yīng)體系和條件在潔凈臺(tái)內(nèi)配制PCR反應(yīng)體系，配制方法按照附錄D執(zhí)行。10.3PCR產(chǎn)物電泳檢測10.3.1儀器設(shè)備10.3.1.1分析天平：分度值不大于0.1mg。10.3.1.2容量瓶：容積分別為100mL、500mL、1000mL、5000mL。10.3.1.3微波爐：容量不小于18L，功率為500W～900W。10.3.1.4電泳儀：輸出電壓為5V～600V，輸出電流為4mA～400mA，輸出功率為1W～240W。10.3.1.5水平電泳槽：容積不小于300mL。10.3.1.6凝膠成像系統(tǒng)：分辨率不小于130萬像素。10.3.1.7微量移液器：10μL。10.3.1.8量筒：容量200mL。10.3.1.9無菌配套吸頭：10μL。10.3.2試劑10.3.2.150×TAE貯存液，按照A.2配制。10.3.2.21×TAE緩沖液，按照A.3配制。10.3.2.36×電泳加樣緩沖液，按照A.4配制。10.3.2.41%瓊脂糖凝膠，按照A.5配制。10.3.2.5DNAMarker，標(biāo)準(zhǔn)分子量的分子量范圍100bp～2000bp。10.3.3試驗(yàn)步驟4DB23/T3873—2024取3μL～5μL擴(kuò)增產(chǎn)物與0.6μL～1μL6×電泳加樣緩沖液混勻，加到凝膠孔內(nèi)，再加入標(biāo)準(zhǔn)分子量。在150V～180V條件下電泳10min～15min。用凝膠成像儀觀察凝膠，并拍照、記錄檢測結(jié)果。凝膠和剩余PCR產(chǎn)物應(yīng)做無害化處理。11結(jié)果判定11.1試驗(yàn)成立條件陽性對照應(yīng)出現(xiàn)336bp左右的特異性目的條帶，并且陰性對照應(yīng)無特異性目的條帶。11.2判定符合11.1，若待檢樣品泳道有336bp左右的目的條帶，則判為PPIV5核酸陽性；反之，則判為PPIV5核酸陰性。PCR產(chǎn)物電泳圖見附錄E。若進(jìn)一步驗(yàn)證，宜對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。5DB23/T3873—2024（規(guī)范性）溶液配制A.1含雙抗0.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）A.1.10.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）71.64g，加適量ddH2O溶解，定容至1000mL，混勻。A.1.20.2mol/L的磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，加適量ddH2O溶解，定容至1000mL，混勻。A.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液：分別量取0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液360mL、0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液各140mL，稱取氯化鈉38g，用ddH2O溶解，定容至5000mL。4℃保存。A.1.40.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液滅菌后，加入無菌青霉素和鏈霉素，終濃度分別為1000IU/mL和1000μg/mL。A.250×TAE電泳緩沖儲(chǔ)存液稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）242g、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）37.2g溶于800mLddH2O中，加入57.1mL醋酸，充分?jǐn)嚢韬蠹觗dH2O定容至1000mL。室溫保存。A.31×TAE電泳緩沖液用ddH2O將50×TAE電泳緩沖儲(chǔ)存液50倍稀釋。A.46×電泳加樣緩沖液稱取乙二胺四乙酸（EDTA）4.4g、溴酚蘭0.25g、二甲苯藍(lán)FF0.25g溶于200mLddH2O中，加熱攪拌充分溶解。冷卻至室溫，加入180mL甘油，以2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，用ddH2O定容至500mL。室溫保存。A.51%瓊脂糖凝膠稱取1g瓊脂糖，加入100mL1×TAE電泳緩沖液，微波爐加熱融化，搖勻。待溫度降至40℃左右時(shí)，加入10mg/mL溴化乙錠（EB）或EB替代物5μL，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。6DB23/T3873—2024病毒RNA提取B.1儀器設(shè)備B.1.1臺(tái)式低溫離心機(jī)：溫度范圍為2℃~8℃,轉(zhuǎn)速不小于12000r/min。B.1.2高壓滅菌鍋：壓力不小于0.1MPa，溫度范圍為105℃~135℃。B.1.3渦旋振蕩器：不小于100r/min。B.1.4冰箱：-70℃~-65℃。B.1.5生物安全柜：空氣流速范圍為100～400ft/min，噪音水平不超過65dB，振動(dòng)水平不超過0.0254mm，過濾器效率在99.99%以上。B.1.6微量移液器：2.5μL、10μL、200μL、1000μL。B.1.7無RNA酶的無菌配套吸頭：10μL、200μL、1000μL。B.1.8無RNA酶的滅菌離心管：1.5mL。B.2試劑B.2.1異丙醇，分析純。B.2.2無水乙醇，分析純。B.2.3Trizol試劑。B.2.4酚氯仿抽提液：苯酚、三氯甲烷、異戊醇體積比為25:24:1。B.2.5DEPC水：ddH2O按0.1%含量加入焦磷酸二乙酯配制而成。B.2.675%乙醇：無水乙醇與DEPC水按3:1配制而成。B.2.7陽性對照：已知病毒材料，如PPIV5感染的細(xì)胞。B.3方法B.3.1在生物安全柜內(nèi)，取待檢樣品上清液和陽性對照各300μL分別置于1.5mL無RNA酶的滅菌離心管中，加500μLTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置10min。B.3.2加入500μL酚氯仿抽提液，充分混勻，室溫靜置10min。B.3.3在4℃條件下12000r/min離心10min，取上清液500μL于新的無RNA酶的滅菌離心管中，加入1.0mL異丙醇，充分混勻，在-20℃條件下靜置30min。B.3.4在4℃條件下12000r/min離心10min，小心棄去上清液；加1.0mL75%乙醇，在4℃條件下12000r/min離心10min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，室溫自然風(fēng)干。B.3.5向離心管中加入20μLDEPC水溶解RNA沉淀，瞬時(shí)離心使殘留管壁的液滴聚集于管底，獲得含RNA溶液，立即使用。7DB23/T3873—2024cDNA合成C.1儀器設(shè)備C.1.1臺(tái)式低溫離心機(jī)：溫度范圍為2℃~8℃,轉(zhuǎn)速不小于10000r/min。C.1.2制冰機(jī)：功率為0.5kW～20kW。C.1.3冰箱：-20℃~-15℃。C.1.4電熱恒溫水槽：溫度范圍為5℃~95℃。C.1.5生物安全柜：空氣流速范圍為100～400ft/min，噪音水平不超過65dB，振動(dòng)水平不超過0.0254mm，過濾器效率在99.99%以上。C.1.6微量移液器：2.5μL、10μL、200μL、1000μL。C.1.7無菌配套吸頭：10μL、200μL、1000μL。C.1.8無RNA酶的滅菌離心管：1.5mL。C.2試劑C.2.15×M-MLV緩沖液。C.2.2dNTPs，各10mmol/L。C.2.3RNase抑制劑，40U/μL。C.2.4M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，200U/μL）。C.2.5隨機(jī)六聚體，Random6mers，10μmol/L。C.2.6樣品病毒RNA。C.2.7陽性對照RNA。C.3方法C.3.1在生物安全柜內(nèi)取制備的病毒RNA各12.5μL分別置于無RNA酶的滅菌離心管中，加入1μL隨機(jī)6聚體、混勻，70℃水浴10min、冰浴2min。C.3.2瞬時(shí)離心，依次加入4μL5×M-MLV緩沖液、1μLdNTPs混合物、0.5μLRNase抑制劑、1.0μLM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻。C.3.342℃水浴1h。C.3.470℃水浴15min、冰浴3min，得到cDNA溶液，立即使用或置-20℃保存、備用。8DB23/T3873—2024PCR反應(yīng)體系和條件引物名稱、序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。用滅菌ddH2O配制成10mmol/L，分裝、冷凍保存?zhèn)溆?。表D.1PCR引物和擴(kuò)增產(chǎn)物大小D.2儀器設(shè)備D.2.1PCR擴(kuò)增儀：96孔或3×32孔或3×21孔，溫度范圍為0℃~100℃,升降溫速率為4℃/秒～6℃/秒。D.2.2微量移液器：10μL、200μL。D.2.3無菌配套吸頭：10μL，200