紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程編制說明

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)編制說明《紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程》團(tuán)標(biāo)制定組二〇二四年八月

目次一、任務(wù)來源及標(biāo)準(zhǔn)制定背景 31、任務(wù)來源 32、標(biāo)準(zhǔn)制定背景 3二、主要工作過程 3三、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù) 41、標(biāo)準(zhǔn)編制原則 42、主要技術(shù)內(nèi)容確定的論據(jù) 53主要技術(shù)內(nèi)容 6四、采用的國際標(biāo)準(zhǔn) 9五、與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系 9六、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 9七、標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的意見 9八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議 9九、廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議 10十、其他應(yīng)予說明的事項(xiàng) 10

一、任務(wù)來源及標(biāo)準(zhǔn)制定背景1、任務(wù)來源本規(guī)程由中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與修復(fù)研究所、華智生物技術(shù)有限公司、內(nèi)蒙古草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司、內(nèi)蒙古大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所聯(lián)合申報，在科技創(chuàng)新2030—農(nóng)業(yè)生物育種重大專項(xiàng)“林草基因型鑒定體系開發(fā)應(yīng)用”和2023年國家草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（籌）重大創(chuàng)新平臺建設(shè)專項(xiàng)“重要草種質(zhì)資源表型和基因型鑒定”的共同資助和支持下完成。2、標(biāo)準(zhǔn)制定背景紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是世界上最重要的多年生豆科牧草之一，也是栽培最早、分布最廣、利用效益最高的優(yōu)良豆科牧草，其產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值豐富、適口性好，而且抗旱、耐鹽堿，同時具有很強(qiáng)的生物固氮、改土培肥的特性，被譽(yù)為“牧草之王”，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、高效優(yōu)質(zhì)畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)治理修復(fù)方面有著不可替代的作用。目前，紫花苜蓿育種尚處于1.0-2.0階段，種質(zhì)資源鑒定效率低、準(zhǔn)確性不高，優(yōu)異種質(zhì)資源開發(fā)利用嚴(yán)重不足，缺乏高通量基因型鑒定與分析技術(shù)體系，以及具有重要育種價值的分子標(biāo)記，全基因組選擇育種尚未深入開展，造成紫花苜蓿品種研發(fā)效率低下，性狀突出的優(yōu)異紫花苜蓿品種較少，嚴(yán)重制約苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，建立紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)體系和標(biāo)準(zhǔn)，能有效實(shí)現(xiàn)對大規(guī)模種質(zhì)資源群體進(jìn)行高通量、精準(zhǔn)、低成本地基因型分型檢測，突破紫花苜蓿種質(zhì)資源評價與品種培育存在的瓶頸問題，提高育種效率，助力紫花苜蓿由常規(guī)育種進(jìn)入智能化分子設(shè)計育種。二、主要工作過程1、2024年7月：根據(jù)《草聯(lián)盟關(guān)于征集2024年第二批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目的通知》中相關(guān)要求，由中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與修復(fù)研究所牽頭，組織華智生物技術(shù)有限公司、內(nèi)蒙古草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司、內(nèi)蒙古大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所相關(guān)科研人員認(rèn)真學(xué)習(xí)標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則及相關(guān)文件，討論標(biāo)準(zhǔn)編寫事宜。2、2024年8月初：中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與修復(fù)研究所，草原研究中心的相關(guān)起草人認(rèn)真總結(jié)草遺傳育種團(tuán)隊(duì)在紫花苜蓿基因型鑒定分析方面已取得的成果，討論決定并提交“紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程”的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制訂項(xiàng)目建議書至北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟秘書處，申請立項(xiàng)。3、2024年8月末：通過立項(xiàng)后，標(biāo)準(zhǔn)編制組對團(tuán)隊(duì)已完成的800多個紫花苜蓿材料的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析整理，開始“紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程”團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)初稿的編制。4、2024年9月初：標(biāo)準(zhǔn)編制組在分析總結(jié)了大規(guī)模紫花苜蓿群體基因型數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合收集整理、梳理歸納和總結(jié)分析相關(guān)作物領(lǐng)域分子標(biāo)記、基因型鑒定技術(shù)方面的文獻(xiàn)資料，完成《紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程》征求意見稿及編制說明的撰寫，提交至北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟秘書處。5、2024年10月：根據(jù)征得的意見或建議，完善標(biāo)準(zhǔn)《送審稿》。6、2024年11月：形成《報批稿》及編制說明，提交至北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟，報批。三、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)編制遵循農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂原則，即技術(shù)上先進(jìn)、經(jīng)濟(jì)上合理、實(shí)施中可行。本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定要求確定編寫章節(jié)；根據(jù)中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與修復(fù)研究所、華智生物技術(shù)有限公司、內(nèi)蒙古草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司、內(nèi)蒙古大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所五家單位在紫花苜蓿種質(zhì)資源收集利用、種質(zhì)材料評價篩選、品種選育以及基因型鑒定分析的一系列科研成果數(shù)據(jù)，并總結(jié)大量實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定相應(yīng)的技術(shù)規(guī)程，保證標(biāo)準(zhǔn)編制的科學(xué)性和適用性。制定過程中除了認(rèn)真總結(jié)多年來的試驗(yàn)研究結(jié)果外，還參閱和汲取了國內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)和條款，符合紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析的生產(chǎn)實(shí)際，達(dá)到內(nèi)容全面、技術(shù)含量高、操作性強(qiáng)的要求。該標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行法律法規(guī)無沖突，并保證了對該標(biāo)準(zhǔn)最新版本的引用。2、主要技術(shù)內(nèi)容確定的論據(jù)（1）適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紫花苜蓿（MedicagosativaL.）高通量基因型鑒定的主要技術(shù)內(nèi)容，包括紫花苜蓿gDNA提取與檢測、cGPS測序文庫構(gòu)建、生物信息分析流程等。紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析基于紫花苜蓿60K液相芯片開展靶向捕獲測序，能夠?qū)Υ笠?guī)模紫花苜蓿群體開展高效、精準(zhǔn)、低成本地基因型分型檢測，基于分型結(jié)果，可在紫花苜蓿育種或輔助育種中開展應(yīng)用，主要包括群體遺傳主效基因選擇、分子標(biāo)記輔助育種定向改良、全基因組選擇育種、紫花苜蓿品種真實(shí)性鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和種質(zhì)資源遺傳多樣性評價等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫花苜蓿高通量基因型的鑒定分析。（2）規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)制定時，參照了2個國家標(biāo)準(zhǔn)，即高通量基因測序技術(shù)規(guī)程（GB/T30989—2014）和磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測通則（GB/T40171—2021），1個地方標(biāo)準(zhǔn)，玉米品種及純度鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法（DB32/T3860—2020）以及1個團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，美洲黑楊性別苗期鑒定技術(shù)規(guī)程—SSR分子標(biāo)記法（T/JSFT/JSF001—2024）。（3）術(shù)語與定義《紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析技術(shù)規(guī)程》中的術(shù)語是根據(jù)《高通量基因測序技術(shù)規(guī)程（GB/T30989—2014)》標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范要求進(jìn)行引用。其中的“SNP標(biāo)記”、“液相基因芯片”、“cGPS”是參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料確定的。（4）主要技術(shù)指標(biāo)確定的依據(jù)本技術(shù)規(guī)程主要起草單位中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與修復(fù)研究所2022年起開展紫花苜蓿液相芯片研發(fā)并構(gòu)建高通量基因型鑒定分析技術(shù)體系，先后承擔(dān)科技創(chuàng)新2030—農(nóng)業(yè)生物育種重大專項(xiàng)“林草基因型鑒定體系開發(fā)應(yīng)用”和2023年國家草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（籌）重大創(chuàng)新平臺建設(shè)專項(xiàng)“重要草種質(zhì)資源表型和基因型鑒定”等項(xiàng)目。3主要技術(shù)內(nèi)容為保證測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，在樣品提取、文庫構(gòu)建、雜交捕獲和測序各環(huán)節(jié)均設(shè)置了質(zhì)控點(diǎn)，對每一個步驟都進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，從根本上確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。3.1樣品DNA提取與質(zhì)控采用磁珠法進(jìn)行樣品DNA提取。用Qubit熒光定量儀檢測DNA樣品的濃度；用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性，質(zhì)控合格的樣品用于文庫制備。3.2

cGPS文庫構(gòu)建與質(zhì)控a.利用片段化酶對DNA樣品進(jìn)行酶切，修復(fù)酶切末端，并在3’端加上A堿基，用瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。b.使用T4連接酶連接測序接頭與DNA片段，利用磁珠對連接產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物用Qubit熒光定量儀檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。c.對純化后的連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用磁珠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段篩選。片段篩選后的產(chǎn)物用Qubit熒光定量儀檢測濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小。d.取200ng完成構(gòu)建的文庫，加入探針與雜交試劑后，50℃孵育16-24小時完成雜交反應(yīng)。利用磁珠進(jìn)行目標(biāo)區(qū)段捕獲，使用清洗液清洗捕獲產(chǎn)物，去除非特異性結(jié)合片段，再進(jìn)行一輪PCR擴(kuò)增，即完成cGPS測序文庫構(gòu)建。3.3上機(jī)測序文庫構(gòu)建完成后，利用Qubit熒光定量儀檢測文庫濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，濃度及片段大小測定合格后，按照測序平臺的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行上樣和測序。3.4生物信息分析基于紫花苜蓿液相芯片捕獲技術(shù)的基因型鑒定分析流程主要分為以下四部分：（1）測序數(shù)據(jù)質(zhì)控：將原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并評估測序質(zhì)量，并進(jìn)行污染檢測；（2）比對及質(zhì)控：將過濾后的測序數(shù)據(jù)比對到紫花苜蓿參考基因組，并計算相應(yīng)質(zhì)控指標(biāo)；（3）變異檢測及注釋：檢測單核苷酸變異（SNP）、小片段插入缺失變異（InDel）及注釋；（4）檢測指標(biāo)計算：根據(jù)變異檢測結(jié)果，統(tǒng)計樣本水平及位點(diǎn)水平的質(zhì)控指標(biāo)。3.4.1參考基因組比對利用比對軟件BWA，將過濾后的CleanReads與紫花苜蓿參考基因組（“新疆大葉”或“中苜4號”基因組）進(jìn)行比對，定位CleanReads在參考基因組上的位置，統(tǒng)計比對結(jié)果。對于紫花苜蓿60K液相基因芯片而言，比對率能反映樣本、建庫及測序、紫花苜蓿60K液相基因芯片標(biāo)記序列的質(zhì)量以及測序數(shù)據(jù)與物種參考基因組的相似程度，圖1為10個樣本的測序數(shù)據(jù)與紫花苜蓿參考基因組的MappingRate（%）。圖1.10個樣本Mapping結(jié)果統(tǒng)計3.4.2目標(biāo)位點(diǎn)變異分析基因組變異是指在基因組水平上核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括SNP、InDel等?；贑leanReads參考基因組序列比對結(jié)果，通過突變分析軟件GATK的工具HaplotypeCaller進(jìn)行靶向位點(diǎn)的基因型檢測。為了清晰的展示芯片位點(diǎn)在各染色體上的分布情況，繪制染色體上的SNP、InDel密度分布熱圖；目標(biāo)位點(diǎn)在基因組上的分布情況（見圖2）。圖2.紫花苜蓿SNP位點(diǎn)分布利用ANNOVAR軟件，對檢測出的基因變異進(jìn)行功能注釋，可以得到變異位點(diǎn)在基因組發(fā)生的區(qū)域（內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)、編碼區(qū)、5’端UTR區(qū)、3’端UTR區(qū)等），以及變異產(chǎn)生的影響（同義、非同義突變等）（見圖3、圖4）。圖3.位點(diǎn)注釋圖4.位點(diǎn)突變類型統(tǒng)計四、采用的國際標(biāo)準(zhǔn)無。五、與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)沒有沖突。六、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無。七、標(biāo)準(zhǔn)作為強(qiáng)制性或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的意見建議將本標(biāo)準(zhǔn)作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施，并加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)的宣貫。八、貫徹標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議1、本標(biāo)準(zhǔn)屬于北京華夏草業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，為成功實(shí)施紫花苜蓿高通量基因型鑒定分析，應(yīng)認(rèn)真執(zhí)行本標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)技術(shù)要求。2、應(yīng)加強(qiáng)對