第八章+酶免疫技術(shù)

第八章酶免疫技術(shù)教學(xué)目的要求：1.掌握酶和酶作用的底物、酶標(biāo)記的抗體或抗原；熟練掌握固相載體。2.熟練掌握酶免疫技術(shù)的分類3.熟練掌握酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法類型及原理4.掌握酶免疫測定的應(yīng)用放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)基本原理抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析

第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)基本原理酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析

第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)底物E酶標(biāo)抗體EE抗原一、酶和酶作用底物（一）標(biāo)記酶的要求：

①活性高，純度高②作用專一性強(qiáng)③性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)④測定方法簡便易行、敏感、精確⑤酶和底物對人體無害⑥酶和底物價廉易得辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比純度數(shù)（RZ）值與酶活性無關(guān)，酶活性單位（U）比RZ值更為重要酶的純度并不代表酶的活力國內(nèi)以辣根過氧化酶最為常用1、辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）

（一）常用的酶DH2+H2O2→→→D+2H2O

供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

HRP催化的反應(yīng)式為：HRP鄰苯二胺OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，有致癌性。四甲基聯(lián)苯胺TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。HRP常用底物（二）堿性磷酸酶

（alkalinephosphatase，AP)

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取

AP的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

敏感性高于HRP,但不易獲得高純度的制品、穩(wěn)定性差，價格貴（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）

源于大腸埃希菌，常用于均相酶免疫測定。β-Gal的底物

4-甲基傘酮基-β-D半乳糖苷（4MUG）酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計測量。二、酶標(biāo)記抗體或抗原酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物酶標(biāo)記物通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

（一）酶標(biāo)記抗體或抗原的制備標(biāo)記方法要求技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不易發(fā)生解離制備方法2.過碘酸鈉氧化法常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原

1.戊二醛交聯(lián)法適合各種酶蛋白的標(biāo)記。（二）酶標(biāo)記物的純化與鑒定

1．酶標(biāo)記物的純化標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)溶液中的游離酶、游離抗體(抗原)、酶聚合物及抗體(抗原)聚合物，避免游離酶增加非特異顯色以及游離抗體(抗原)的競爭作用。常用的純化方法有葡聚糖凝膠層析法和飽和硫酸銨沉淀法等。

2.酶標(biāo)記物的鑒定（1）免疫活性鑒定：常用免疫電泳或雙向免疫擴(kuò)散法，出現(xiàn)沉淀線表示結(jié)合物中的抗體(抗原)具有免疫活性。（2）酶標(biāo)記率測定：用分光光度法分別測定結(jié)合物中酶和抗體(抗原)蛋白的含量，然后按公式計算其標(biāo)記率。三、固相載體

固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法

固相抗體或抗原:就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面

（一）固相載體的要求結(jié)合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進(jìn)行固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟(jì)（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀。主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。

2．微顆粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.微孔慮膜是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、尼龍膜和玻璃纖維素膜等。

微量反應(yīng)板（三）包被與封閉將抗原或抗體固相化結(jié)合在固相載體上的過程稱為包被（coating)。以聚笨乙烯固相載體（如制ELISA板）為例說明免疫吸附的過程：

抗原（抗體）→用PH9.6的碳酸鹽溶液稀釋→4oC過夜→用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相載體表面未吸附的位點(diǎn)，此過程叫做封閉。第二節(jié)酶免疫技術(shù)的分類克隆酶供體免疫測定酶免疫分析技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫測定技術(shù)均相酶免疫測定異相酶免疫測定酶放大免疫測定技術(shù)液相酶免疫測定固相酶免疫測定：酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位分析

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量24一、均相酶免疫測定法酶蛋白與抗原或抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記物。未與抗原（抗體）結(jié)合的標(biāo)記抗體（抗原），稱為游離標(biāo)記物。與抗原（抗體）結(jié)合的標(biāo)記抗體（抗原），稱為結(jié)合標(biāo)記物。Ag+

Ab-EAgAb-E+Ab-E（以標(biāo)記Ab檢測Ag為例）一、均相酶免疫測定法基本原理酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，其中的酶活性將發(fā)生改變。因此，不需對反應(yīng)液中結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離，直接測定反應(yīng)系統(tǒng)中總酶活性的變化即可推算出被測樣品中抗原的含量。Ag+

Ab-EAgAb-E+Ab-E（以標(biāo)記Ab檢測Ag為例）二、異相液相酶免疫測定法基本原理：抗原抗體反應(yīng)平衡后，需采用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ蛛x游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物，然后對經(jīng)酶催化的底物顯色程度進(jìn)行測定，再推算待測樣品中抗原（或抗體）的含量。依據(jù)測定方法又可分為液相和固相酶免疫測定。目前臨床上多用固相酶免疫測定法。Ag+

Ab-EAgAb-E+Ab-E（以標(biāo)記Ab檢測Ag為例）第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）一、基本原理底物顯色定性或定量的分析包被將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234二、方法類型及反應(yīng)原理（一）檢測抗原的方法將己知抗體包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗原與固相表面的抗體結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合成分。然后再與抗原特異的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗原的含量。1.雙抗體夾心法E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原適用于檢測含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原（1）將已知抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）加待檢標(biāo)本,溫育，洗滌。（3）加酶標(biāo)抗體，洗滌。（4）加底物，根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。2．技術(shù)要點(diǎn)E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物（+）1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的2、加待檢抗原4、加酶作用的洗滌洗滌洗滌洗滌1、已知抗體包2、加待檢物3、加酶標(biāo)抗體（-）YYYYYYEYEYEYYYYYYYYYYEYEYEYYYYYYYEYEYEYYYY洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原2.雙位點(diǎn)一步法檢測抗原

即在雙抗體夾心法基礎(chǔ)上使用針對抗原分子上兩個不同表位的單克隆抗體，分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。測定時將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體同時加入進(jìn)行反應(yīng)，兩種抗體互不干擾，經(jīng)一次溫育和洗滌后，即可加入底物進(jìn)行顯色測定。EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體雙位點(diǎn)一步法檢測抗原在包被時使用一種單抗，酶標(biāo)記時使用一種單抗3.加酶作用的底物2.加待檢抗原洗滌1.已知抗體包YYYYEYYEYYYEYYEYY（+）3.加酶作用的底物2.加待檢物（無抗洗滌1.已知抗體包YYYYEYYEYY（-）YYY洗滌洗滌雙位點(diǎn)一步法測抗原

如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。注意事項EE底物固相抗體標(biāo)本（抗原濃度高）酶標(biāo)抗體E3.競爭法檢測抗原

酶標(biāo)抗原和待檢抗原對固相特異性抗體具有相同的結(jié)合力，二者競爭結(jié)合固相特異性抗體。免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與標(biāo)本中待檢抗原含量呈反比。待檢抗原量越多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合越少，底物顯色反應(yīng)越淺；反之則顯色越深，即底物顯色與待檢標(biāo)本中抗原含量呈反比。

酶標(biāo)抗原EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法檢測抗原（1）將特異性抗體包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。（2）待測管中加待檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，待檢標(biāo)本中如果含有抗原，則與酶標(biāo)抗原競爭固結(jié)合相抗體，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。對照管中只加酶標(biāo)抗原，溫育，洗滌。（3）加底物顯色。對照管中顏色深，待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。技術(shù)要點(diǎn)3.加酶作用的底物2.加待檢抗原洗滌1.已知抗體包YYYYYY（+）EYYYE3.加酶作用的底物2.加待檢物（無抗洗滌1.已知抗體包YYYYYY（-）EYYYEEEEEEE洗滌洗滌競爭法測抗原（二）檢測抗體的方法將已知抗原吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體與之結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。1.間接法

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE間接法檢測抗體酶標(biāo)二抗是針對一類免疫球蛋白(如抗人IgG），因此該法只需要變換固相抗原，即可用一種酶標(biāo)二抗測各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣的通用性4.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包（+）YYY3.加酶標(biāo)二抗洗滌YYYYEYEYEYYYYEYEYE4.加酶作用的底物2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包（-）3.加酶標(biāo)二抗洗滌YEYEYE洗滌洗滌間接法測抗體2.雙抗原夾心法

將已知抗原包被固相載體，待檢標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相表面的抗原、酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢抗體含量。同雙抗體夾心法。技術(shù)要點(diǎn)E固相抗體標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE雙抗原夾心法檢測抗體4.加酶作用的底物（+）（-）4.加酶作用的底物2.加待檢抗體洗滌1.已知抗原包3.加酶標(biāo)抗原洗滌YEYYYYEYEYEYEYE2.加待檢物（無抗體）洗滌1.已知抗原包3.加酶標(biāo)抗原洗滌EEE洗滌洗滌雙抗原夾心法測抗體3.競爭法檢測抗體同競爭法結(jié)合抗原。HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。1．原理（1）競爭法檢測HBcAb：①將HBcAg包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)特異性抗體，溫育，洗滌。③加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。2．技術(shù)要點(diǎn)固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb3.加酶作用的底物3.加酶作用的底物2.加待檢抗體和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包（+）YYYEYYYE2.加待檢物（無抗體）和酶標(biāo)抗體洗滌1.已知HBcAg包（-）YYYEYYYEEEEEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBcAb（2）競爭法檢測HBeAb：①將HBeAb包被于固相反應(yīng)板上，洗滌。②加入待檢標(biāo)本和HBeAg，溫育，洗滌。③加入酶標(biāo)HBeAb，溫育，洗滌。④加入底物，溫育，形成有色產(chǎn)物，用酶標(biāo)比色儀測定結(jié)果。顯色深淺與待檢標(biāo)本中相應(yīng)抗體含量成反比。固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體底物EEE競爭法檢測HBeAb（+）（-）4.加酶作用的底物2.加待檢抗體和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包YYYYYYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYYYE4.加酶作用的底物2.加待檢物（無抗體）和HBeAg洗滌1.已知HBeAb包YYYYYYYYY3.加酶標(biāo)HBeAb洗滌YEYEYYYYEYEYEYE洗滌洗滌競爭法檢測HBeAb4.捕獲法將抗人IgM抗體吸附于固相載體上，待檢標(biāo)本中的IgM類抗體多被固相抗體捕獲。加入特異抗原與固相抗體捕獲的IgM類抗體結(jié)合，再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，形成固相抗人IgM-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。最后根據(jù)加底物后的顯色程度確定待檢IgM抗體的含量。固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EEE固相捕獲法檢測lgM抗體5.加酶作用的底物5.加酶作用的底物2.加待檢抗體（IgM）洗滌1.已知抗人IgMYYYYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYYEYYYYYYEYY2.加待檢物（無特異性IgM）洗滌1.已知抗人IgMYYYYYYYYYY4.加酶標(biāo)抗體洗滌EYE3.加入特異性抗原洗滌YYYYYYYYYY（+）（-）洗滌洗滌捕獲法方法評價ELISA具有操作簡便、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、實驗設(shè)備要求簡單、應(yīng)用范圍廣泛、無反射性同位素污染等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)展最快、應(yīng)用最廣，普及。

試劑盒（圖為瑞士HAMILTONFAME24/20全自動酶免分析儀）

1．病原體及其抗體測定廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷。2．蛋白質(zhì)測定各種免疫球蛋白、補(bǔ)體組分、腫瘤標(biāo)志物各種血漿蛋白質(zhì)、同工酶等。3．非肽類激素測定如T3、T4、雌激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素等。4．藥物和毒品測定如地高辛、苯巴比妥、慶大霉素、嗎啡等。

第四節(jié)酶免疫測定的應(yīng)用小結(jié)

酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗原或抗體作為主要試劑的免疫檢測方法，在抗原與抗體的特異性反應(yīng)完成后，通過酶對底物的催化作用提高反應(yīng)的敏感性。酶免疫分析技術(shù)可分為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)和酶免疫測定兩大類,后者根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合與游離的酶標(biāo)記物而分為均相和非均相兩種類型。

展望

酶免疫技術(shù)是三大經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。隨著相關(guān)新技術(shù)的不斷問世，如雜交瘤單克隆抗體、生物素一親和素放大系統(tǒng)的應(yīng)用以及與化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的偶聯(lián)等，明顯地提高了分析和測定方法的特異性、靈敏度及其自動化程度，使酶免疫分析技術(shù)不斷更新，應(yīng)用范圍不斷拓寬。練習(xí)1.用于標(biāo)記的HRP的RZ值應(yīng)該大于A.2.4B.3.0C.1.5D.3.5E.5.01.用于標(biāo)記的HRP的RZ值應(yīng)該大于BA.2.4B.3.0C.1.5D.3.5E.5.02.RZ表示A酶活性B.催化效率C.標(biāo)記率D.酶純度E效價2.RZ表示DA.酶活性B.催化效率C.標(biāo)記率D.酶純度E.效價3.HRP與底物TMB反應(yīng)后的測定波長為A.278mmB.450mmC.403mmD.495mmE.492mm3.HRP與底物TMB反應(yīng)后的測定波長為BA.278mmB.460mmC.403mmD.495mmE.492mm5.HRP與TMB反應(yīng)后，加H2SO4終止反應(yīng)前呈A.藍(lán)色B.橙黃色C.棕黃色D.黃色E.紫色5.HRP與TMB反應(yīng)后，加H2SO4終止反應(yīng)前呈DA.藍(lán)色