第二章蛋白質(zhì)化學(xué)2

第四節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結(jié)合而成的生物大分子。蛋白質(zhì)與多肽并無(wú)嚴(yán)格的界線，通常是將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。多肽鏈的氨基酸順序；化學(xué)鍵：肽鍵。一.蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)我國(guó)1965年在世界上第一個(gè)用化學(xué)方法人工合成的蛋白質(zhì)就是這種牛胰島素。肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，不涉及殘基側(cè)鏈?；瘜W(xué)鍵：氫鍵。主要有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲、-螺旋、環(huán)等。二.蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)1.

-螺旋（-helix）多肽鏈中的各個(gè)肽平面圍繞同一軸旋轉(zhuǎn)，形成螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個(gè)氨基酸殘基；兩個(gè)氨基酸之間的距離為0.15nm;肽鏈內(nèi)形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個(gè)氨基酸殘基的酰胺基團(tuán)的-CO基與第四個(gè)氨基酸殘基酰胺基團(tuán)的-NH基形成氫鍵。氨基酸殘基R-側(cè)鏈分布在螺旋外側(cè)。多為右手

-螺旋。2.

-折疊

-折疊

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過(guò)鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長(zhǎng)軸接近垂直；肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象；在

-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團(tuán)處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個(gè)氨基酸殘基之間的軸心距為0.35nm；

-pleatedsheet

-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。3.

-轉(zhuǎn)角

-turn在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈出現(xiàn)1800回折。在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個(gè)氨基酸殘基組成;彎曲處的第一個(gè)氨基酸殘基的-C=O和第四個(gè)殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個(gè)不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。三.超二級(jí)結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu)：若干相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元按照一定規(guī)律有規(guī)則組合在一起，相互作用，形成在空間構(gòu)象上可彼此區(qū)別的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合單位。介于二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間。、

、結(jié)構(gòu)域：是存在于球狀蛋白質(zhì)分子中的兩個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、在空間上能辨認(rèn)的三維實(shí)體,每個(gè)由二級(jí)結(jié)構(gòu)組合而成,充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件,其間由單肽鏈連接。四.蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)(TertiaryStructure)是指多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上非幾何狀地進(jìn)一步折疊或卷曲成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。包括肽鏈中所有原子的空間排布方式。維系這種特定結(jié)構(gòu)的力主要是次級(jí)鍵。尤其是疏水作用力，在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起著重要作用。三級(jí)結(jié)構(gòu)中包含的共價(jià)鍵是二硫鍵、配位鍵。（一）蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵1.共價(jià)鍵蛋白質(zhì)分子中的共價(jià)鍵有肽鍵、二硫鍵和配位鍵，是生物大分子分子之間最強(qiáng)的作用力。二硫鍵：由含硫氨基酸形成。在蛋白質(zhì)分子中，起著穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用。二硫鍵被破壞，蛋白質(zhì)的生物活性喪失。配位鍵：兩個(gè)原子之間形成的共價(jià)鍵，共用電子對(duì)由其中的一個(gè)原子提供。金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合往往是配位鍵，例如：血紅蛋白、細(xì)胞色素C等。

二硫鍵二硫鍵半胱氨酸半胱氨酸胱氨酸-SH巰（讀“qiu”,音同球)基價(jià)鍵牢固，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)H22.非共價(jià)鍵

共價(jià)鍵存在于一個(gè)分子或多個(gè)分子的原子之間，決定分子的基本結(jié)構(gòu)。非共價(jià)鍵（又稱為次級(jí)鍵或分子間力）決定生物大分子和分子復(fù)合物的高級(jí)結(jié)構(gòu)。（1）酯鍵(esterbond)在蛋白質(zhì)分子中，絲氨酸和蘇氨酸的羥基與氨基酸的羧基縮合成酯，形成酯鍵。磷酸與含羥基氨基酸縮合形成磷酸酯鍵。（2）離子鍵

又稱鹽鍵，一種具有相反電荷的兩個(gè)基團(tuán)之間的庫(kù)侖作用。這種鍵可以解離。（3）氫鍵

氫鍵是由兩個(gè)負(fù)電性原子對(duì)氫原子的靜電引力所形成。X—H…Y它是質(zhì)子給予體X-H和質(zhì)子接受體Y之間的一種特殊類型的相互作用。氫鍵具有方向性，氫鍵的方向用鍵角表示，是指X—H與H…Y之間的夾角，一般為180

～250

。（4）范德華力

這是一種普遍存在的作用力，是原子、基團(tuán)或分子之間比較弱的、非特異性的作用力。這種作用力分：極性基團(tuán)之間的相互吸引（取向力）；極性基團(tuán)與非極性基團(tuán)之間的相互吸引（誘導(dǎo)力）；非極性基團(tuán)之間的相互吸引（色散力）。（5）疏水作用

非極性側(cè)鏈在極性溶劑水中為了避開(kāi)水相而彼此靠近所產(chǎn)生的一種作用力。主要存在蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)和酶的表面通常具有極性鏈或區(qū)域，這是由構(gòu)成它們的氨基酸側(cè)鏈上的烷基鏈或苯環(huán)在空間上相互接近時(shí)形成的。

鍵能肽鍵

二硫鍵離子鍵

氫鍵疏水鍵

范德華力

90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol這四種鍵能遠(yuǎn)小于共價(jià)鍵，稱次級(jí)鍵提問(wèn)：次級(jí)鍵微弱但卻是維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中主要的作用力,原因何在?數(shù)量巨大（二）肌紅蛋白已知某分子量為240000的蛋白質(zhì)多肽鏈的一些節(jié)段是

-螺旋,而另一些節(jié)段是-折疊,其分子長(zhǎng)度為5.06x10-5cm,求分子-螺旋和-折疊的百分率？解:AA殘基的平均分子量是120

設(shè):

-螺旋含有X個(gè)殘基-折疊含有2000-X0.15x+0.35(2000-x)=5.06*10^^(-5)*10^^(7)五.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)(QuaternaryStructure)是指由多條各自具有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的肽鏈通過(guò)非共價(jià)鍵連接起來(lái)的結(jié)構(gòu)形式；各個(gè)亞基在這些蛋白質(zhì)中的空間排列方式及亞基之間的相互作用關(guān)系。這種蛋白質(zhì)分子中，最小的單位通常稱為亞基或亞單位Subunit，它一般由一條肽鏈構(gòu)成，無(wú)生理活性；維持亞基之間的化學(xué)鍵主要是疏水作用力。由數(shù)條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)通過(guò)次級(jí)鍵疊合而成亞基單獨(dú)沒(méi)有生物功能亞基具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單位

亞基血紅蛋白血紅蛋白四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2；蝦紅素第五節(jié)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系

（研究熱點(diǎn)）蛋白質(zhì)的分子具有多種多樣的生物功能是以其龐大的分子組成和極為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的，充分認(rèn)識(shí)這其間的關(guān)系是人工合成功能蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。一.一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系血紅蛋白例如鐮刀形貧血病的分子機(jī)理鐮刀狀貧血病—血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細(xì)胞，患者因此缺氧窒息正常細(xì)胞鐮刀形細(xì)胞它是最早認(rèn)識(shí)的一種分子病。流行于非洲，死亡率極高，大部分患者童年時(shí)就夭折，活過(guò)童年的壽命也不長(zhǎng)，它是由于遺傳基因突變導(dǎo)致血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)的突變。正常型

Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lysβ鏈

谷氨酸鐮刀型

Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lysβ鏈

纈氨酸谷A（極性）纈A（非極性）(了解)由于纈氨酸上的非極性基團(tuán)與相鄰非極性基團(tuán)間在疏水力作用下相互靠攏，并引發(fā)所在鏈扭曲為束狀，整個(gè)蛋白質(zhì)由球狀變?yōu)殓牭缎?，與氧結(jié)合功能喪失，導(dǎo)致病人窒息甚至死亡。胰蛋白酶的激活纈天天天天賴異纈甘組SS絲SS腸激酶（激活作用）纈天天天天賴異甘組SS絲纈SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶提問(wèn)：為什么不直接以酶形式存在呢？答案：保護(hù)正常組織不受傷害。活性部位46183二.高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系變構(gòu)蛋白:一些蛋白質(zhì)可通過(guò)改變其構(gòu)象來(lái)改變其生物活性.肌紅蛋白

血紅蛋白α

血紅蛋白β氨基酸序列大不相同，功能相似（載氧），結(jié)構(gòu)相似結(jié)構(gòu)決定功能1.氧合血紅蛋白2.氧飽和曲線——S形3.變構(gòu)作用:當(dāng)血紅蛋白的一個(gè)亞基結(jié)合氧后,使整個(gè)分子的構(gòu)象發(fā)生變化,對(duì)氧的親和力增加.(R)relaxedstate(T)tensestate

血中氧分子的運(yùn)送：Lung氧分子HemoglobinMyoglobinMuscle靜脈動(dòng)脈環(huán)境氧高時(shí)Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧低時(shí)Hb迅速釋放氧分子釋放氧分子后Hb變回

Tstate任何一個(gè)亞基接受氧分子后，會(huì)增進(jìn)其它亞基吸附氧分子的能力第六節(jié)、

蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)與氨基酸一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同。在大于等電點(diǎn)的pH溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在小于等電點(diǎn)的pH溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)。一.蛋白質(zhì)的兩性離解和電泳蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn)提問(wèn)：為什么蛋白質(zhì)具有兩性（酸、堿性）？含有酸堿氨基酸殘基堿/酸越大pI

？

越大pI通常在6.0左右電泳蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。二.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)提問(wèn)：什么樣的分子是膠體性質(zhì)？答案：分子直徑≤膠體顆粒大?。?∽100nm)且不易聚集沉淀。大多數(shù)球狀蛋白溶于水，能形成穩(wěn)定的膠體溶液。提問(wèn)：蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定的原因是什么？答案：1.同種蛋白質(zhì)帶有同種電荷，相互排斥；2.水膜彈性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入低濃度NaCl后沉淀溶解—鹽溶提問(wèn)：原因？鹽溶—鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出提問(wèn)：原因？蛋白質(zhì)分子表面的親水區(qū)域，聚集了許多水分子，鹽濃度高時(shí)，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，沉淀。鹽析（（NH4）2SO4）蛋白質(zhì)的沉淀中性鹽沉淀有機(jī)溶劑沉淀重金屬鹽沉淀生物堿沉淀1.定義：某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。三.蛋白質(zhì)的變性蛋白質(zhì)的變性即蛋白質(zhì)保持一級(jí)結(jié)構(gòu)不變的情況下，二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。變性蛋白質(zhì)有哪些特征？生物活性的喪失一些側(cè)鏈基團(tuán)的暴露某些物理化學(xué)性質(zhì)的改變2.變性因素：（1）物理因素——有哪些？加熱（70~100℃）、劇烈振蕩或攪拌例如鹵水（少量MgCl2）點(diǎn)豆腐、煎炒烹炸紫外線、X射線、超生波例如皮膚粗糙、白內(nèi)障、殺菌（2）化學(xué)因素——有哪些？強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、甲醛、重金屬鹽、三氯醋酸、磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇。例如胃酸、硫酸銅殺菌、烈酒（3）機(jī)理分子機(jī)理？變性因素破壞了維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的各種次級(jí)鍵以及二硫鍵。重金屬——與-SH生成不溶性的硫化物濃乙醇、去污劑——破壞疏水作用力大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。四.蛋白質(zhì)的紫外吸收第七節(jié)

蛋白質(zhì)的分離純化和一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定一.分離純化的一般原則1.用物理和化學(xué)的方法進(jìn)行粗提。2.利用沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑分級(jí)分離，色譜、電泳等方法進(jìn)行純化。3.蛋白質(zhì)結(jié)晶。1.根據(jù)分子大小的分離方法

透析和超過(guò)濾、密度梯度離心、凝膠過(guò)濾2.利用溶解度差別的分離方法等電點(diǎn)沉淀法、鹽溶與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀3.根據(jù)電荷不同的分離方法電泳、離子交換法4.蛋白質(zhì)的選擇吸附分離

5.根據(jù)配體特異性的分離親和層析二、分離純化的方法三.蛋白質(zhì)的分析測(cè)定1.蛋白質(zhì)含量測(cè)定

凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、紫外吸收法、考馬斯亮藍(lán)法

2.蛋白質(zhì)的純度的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳

3.蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的測(cè)定

凝膠過(guò)濾法、SDS蛋白質(zhì)的分子量一般在一萬(wàn)至一百萬(wàn)（1道爾頓＝1×C12絕對(duì)質(zhì)量/12≈1.66×10-27千克）之間常用的測(cè)定方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過(guò)濾法等。凝膠法只適于球狀蛋白分子測(cè)量蛋白質(zhì)混合樣60000~80000轉(zhuǎn)/分重力60萬(wàn)～80萬(wàn)倍四.蛋白質(zhì)氨基酸序列的測(cè)定蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。

樣品必需純（>97%以上）；知道蛋白質(zhì)的分子量；知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)。測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。1.測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的要求2.測(cè)定步驟(1)多肽鏈的拆分(2)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目(3)二硫鍵的斷裂(4)測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比；(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序(8)確定肽段在多肽鏈中的次序(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定選擇題1.在下列有關(guān)谷胱甘肽的敘述中,正確的是()

A.谷胱甘肽中含有胱氨酸

B.谷胱甘肽是體內(nèi)重要的氧化劑

C.谷胱甘肽谷氨酸的α-羧基是游離的

D.谷胱甘肽的C-端是主要的功能基團(tuán)2.在有關(guān)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的描述中,錯(cuò)誤的是()A.具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈都有生物學(xué)活性

B.三級(jí)結(jié)構(gòu)是單體蛋白質(zhì)或亞基的空間結(jié)構(gòu)

C.三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性由次級(jí)鍵維持

D.親水基團(tuán)多位于三級(jí)結(jié)構(gòu)的表面3.

在有關(guān)蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的描述中,正確的是()A.蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性由二硫鍵維系

B.四級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)保持生物學(xué)活性的必要條件

C.蛋白質(zhì)都有四級(jí)結(jié)構(gòu)

D.蛋白質(zhì)亞基間由非共價(jià)鍵聚合

4.每一種完整蛋白質(zhì)分子必定具有（）

A.α–螺旋B.-折疊

C.三級(jí)結(jié)構(gòu)D.四級(jí)結(jié)構(gòu)5.鹽析法沉淀蛋白質(zhì)的原理A.中和電荷，破壞水化膜B.鹽與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性蛋白鹽C.調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的等電點(diǎn)D.降低蛋白質(zhì)溶液的介電常數(shù)A.B.C.D.

6.空間結(jié)構(gòu)包括（）Aα-螺旋Bβ-折疊C結(jié)構(gòu)域D亞基E超二級(jí)結(jié)構(gòu)7.右手α-螺旋是一種很穩(wěn)定的構(gòu)象，穩(wěn)定的主要原因（）A螺旋內(nèi)有芳香氨基酸殘基B螺旋內(nèi)所有肽鍵的-NH與CO都參與氫鍵形成C側(cè)鏈基團(tuán)從螺旋中向外伸出，不彼此作用D每一個(gè)碳碳連鍵的旋轉(zhuǎn)度都相同8.β-轉(zhuǎn)角中肽鏈主鏈出現(xiàn)（）A800B1800C600D1500

10.變性蛋白質(zhì)溶解度減少的原因是（）A蛋白質(zhì)分子表面電荷減少B蛋白質(zhì)分子表面極性殘基減少