免疫學檢測技術(shù)及其應用

免疫學檢測技術(shù)及其應用第一節(jié)體外抗原抗體結(jié)合反應的特點及影響因素一、抗原-抗體反應的特點及檢測原則特點：1.高度特異性2.表面化學基團之間的可逆結(jié)合3.適宜的抗原抗體濃度和比例4.抗原抗體反應的兩個階段：

1）抗原抗體特異性結(jié)合階段

2）可見反應階段2021/1/52一、抗原-抗體反應的特點1、高度特異性：抗原表位與抗體分子CDR的互補結(jié)合是抗原-抗體反應的化學本質(zhì)。2021/1/532、表面化學基團的可逆性抗原與相應抗體除空間構(gòu)型具有互補性外，兩者主要是通過分子表面的氫鍵、疏水鍵、靜電和范德華力非共價結(jié)合。親合力（avidity）:

指抗體分子的抗原結(jié)合部位與抗原表位之間的結(jié)合強度2021/1/54在一定濃度范圍內(nèi)，二者比例合適，可出現(xiàn)肉眼可見的反應物；若比例不合適，即抗原或抗體過剩時，可形成小分子抗原-抗體復合物。此種小分子復合物多呈游離狀態(tài)，不能為肉眼所見。

3、適宜的抗原抗體濃度和比例2021/1/554、抗原-抗體反應的兩個階段①抗原-抗體特異性結(jié)合階段：特點：反應快，數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完成。

②反應可見階段：特點：所需時間較長，從數(shù)分鐘、數(shù)小時到數(shù)日不等，且受電解質(zhì)、溫度和酸堿度等因素影響。2021/1/561.電解質(zhì)：在電解質(zhì)作用下，抗原-抗體復合物失去較多負電荷，使彼此連接出現(xiàn)肉眼可見的凝集或沉淀現(xiàn)象。試驗中常用0.85%的NaCl溶液作為稀釋液，提供適當濃度的電解質(zhì)。二、抗原-抗體反應的影響因素

2021/1/57提高濃度可增加抗原與抗體分子碰撞機會，加速抗原-抗體復合物的形成。通常抗原-抗體反應的最適溫度是37℃。2.溫度3.酸堿度

抗原-抗體反應的最適pH值在6-8之間。pH過高或過低，均可影響抗原或抗體的理化性狀，影響試驗的可靠性。

2021/1/58三、抗原-抗體反應類型和檢測方法1.凝集反應2.沉淀反應3.免疫標記技術(shù)根據(jù)抗原的性質(zhì)、參與反應的成分和反應呈現(xiàn)的結(jié)果，將抗原-抗體反應分為四類：2021/1/59（一）凝集反應直接凝集：玻片法、試管法間接凝集間接乳膠凝集：ASO試驗、RF試驗間接血球凝集：間接凝集抑制試驗：免疫妊娠試驗Coombs試驗：直接法、間接法2021/1/510（一）凝集反應：概念：細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結(jié)合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。類型：2021/1/5111、直接凝集反應（directagglutination）概念：顆粒性抗原直接與相應抗體結(jié)合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。檢測方法：（1）玻片法：特點定性試驗；用已知抗體檢測未知抗原；本法簡捷快速；2021/1/512（2）試管法：特點半定量試驗；用已知抗原檢測未知抗體的相對含量。應用肥達反應——傷寒或副傷寒；外斐氏反應——立克次體病瑞特反應——布氏菌病2021/1/5132、間接凝集反應（indirectagglutination）概念：將已知可溶性抗原或抗體與免疫無關(guān)的載體顆粒結(jié)合形成致敏顆粒后，再與相應抗體或抗原進行反應出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。

應用抗鏈“O”試驗（ASO）——風濕病類風濕因子測定（RF試驗）——類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）2021/1/5142、沉淀反應速率散射比濁/免疫比濁瓊脂擴散單向瓊脂擴散雙向瓊脂擴散免疫電泳技術(shù)免疫電泳火箭免疫電泳對流免疫電泳2021/1/515特點：定量試驗；敏感性較高。應用：測定血清中IgG、IgM、IgA等含量和C3、C4等補體含量（1）單向瓊脂擴散試驗（singleagardiffusion）2021/1/516單項瓊脂擴散試驗：

定量測定血清中IgG、M、A和單一補體含量方法與原理2021/1/5172、雙向瓊脂擴散試驗（doubleagardiffusion

）應用（1）定性試驗：①鑒定可溶性抗原和抗體。②分析復雜抗原成分和抗體（2）半定量試驗：免疫血清稀釋后進行的血清效價測定。2021/1/5182021/1/519優(yōu)點：敏感性同單擴散；所需時間短。應用：快速測定標本中可溶性抗原的含量。4火箭電泳（rocketelectrophoresis）

又稱電泳免疫擴散2021/1/520免疫熒光技術(shù)免疫組化技術(shù)免疫印跡技術(shù)—Westernblotting法免疫層析技術(shù)—金標免疫層析法免疫測定技術(shù)酶免疫測定法：ELISA放射免疫測定法化學發(fā)光免疫分析酶免疫組化技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫電鏡技術(shù)3、免疫標記技術(shù)2021/1/521第三節(jié)免疫細胞的檢測一、免疫細胞的分離（一）外周血單個核細胞的分離（二）淋巴細胞及其亞群的分離1.玻璃粘附分離法2.尼龍毛分離法3.E花結(jié)分離法4.免疫吸附分離法（洗淘法）5.免疫磁珠分離法（IMB法）6.流式細胞術(shù)分離法2021/1/522常用的分離方法：

葡聚糖-泛影葡胺（又稱淋巴細胞分離液）密度梯度離心法。一、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞，它們是免疫學實驗中最常用的細胞。2021/1/5232021/1/524二、淋巴細胞及其亞群的分離2、免疫磁珠（immunemagneticbead，IMB）分離法：將已知抗淋巴細胞表面標志的抗體包被聚苯乙烯培養(yǎng)板，加入淋巴細胞懸液，使表達相應表面標志的淋巴細胞結(jié)合在培養(yǎng)板上，洗脫后即可獲得具有相應表面標志的淋巴細胞。例用抗CD4抗體包被聚苯乙烯培養(yǎng)板，可將CD4+T細胞與CD8+T細胞相分離。1、免疫吸附分離法（洗淘法）：免疫磁珠由抗淋巴細胞表面標志的抗體與磁性微珠交聯(lián)結(jié)合組成。將免疫磁珠加入細胞懸液中后，可使表達相應表面標志的淋巴細胞與之結(jié)合。然后，在磁場作用下，結(jié)合相應淋巴細胞的免疫磁珠吸附在靠近磁鐵的管壁上。棄去懸液中游離的細胞，將免疫磁珠結(jié)合的細胞分離，即可獲得具有某種表面標志的淋巴細胞。該法所獲細胞純度高（93%-99%），活細胞率＞95%，比流式細胞術(shù)省時、費用低，操作簡單。2021/1/525

熒光激活細胞分類儀（簡稱流式細胞儀）集光學、流體力學、電力學和計算機技術(shù)于一體，可對細胞作多參數(shù)定量測定和綜合分析。

是借助熒光激活細胞分類儀（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）將熒光抗體標記的細胞進行快速準確鑒定和分類的技術(shù)。3、流式細胞術(shù)（flowcytometry）分離法：程序原理將待測細胞懸液與熒光素標記的抗體反應后，在壓力作用下（細胞）排成單列經(jīng)噴嘴噴出形成液滴射流（每個液滴包裹一個細胞）；在液滴射流與高速聚焦激光束相交處，液滴中細胞受激發(fā)光照射可產(chǎn)生散射光并激發(fā)各種熒光信號；熒光信號被光電檢測器接受可轉(zhuǎn)化為電信號；電信號經(jīng)加工處理存儲于計算機中，再用分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理和圖像顯示，快速準確獲得結(jié)果。流式細胞儀的主要用途①定量分析鑒定活細胞表面表達的特異分子；②免疫細胞分類和百分計數(shù)；③白血病和淋巴瘤的免疫學分型；④細胞周期和細胞凋亡檢測。此外，流式細胞儀還具有分選功能，借助光電效應、微滴通過電場時出現(xiàn)不同偏向，可分類收集所需的細胞及其亞群。分選純度高達95%以上，且可保持細胞活性，可進一步研究使用。2021/1/5262021/1/527一、淋巴細胞功能測定二、免疫細胞功能測定（一）T細胞增殖試驗1、特異性T細胞增殖試驗：2、非特異性T細胞增殖試驗：（二）B細胞增殖試驗1、抗體形成細胞測定試驗（溶血空斑試驗）：2、酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）：（三）細胞毒試驗3、凋亡細胞檢測法2、乳酸脫氫酶釋放法1、51Cr釋放法形態(tài)學檢測法瓊脂糖電泳法TUNEL法流式細胞術(shù)檢測法二、吞噬細胞功能測定（一）中性粒細胞趨化功能的測定（二）中性粒細胞吞噬功能測定（三）巨噬細胞吞噬功能測定2021/1/528一、淋巴細胞功能測定第三節(jié)免疫細胞功能測定（一）T細胞增殖試驗T細胞增殖試驗是檢測機體細胞免疫功能常用的技術(shù)。根據(jù)刺激物不同，T細胞增殖可分為兩種方式：1、特異性T細胞增殖試驗：用某種特異性抗原如結(jié)核菌素（OT）刺激相應抗原特異性T細胞活化，并使之增殖。2、非特異性T細胞增殖試驗：是用絲裂原（如PHA、ConA）或抗CD3單克隆抗體等非特異性多克隆激活T細胞，并使之增殖。在增殖過程中，細胞DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成增加，細胞形態(tài)改變，最終導致細胞增殖分化。常用檢測方法：2021/1/529（一）T細胞增殖試驗1、3H-TdR摻入法：取外周血單個核細胞（PBMC）與PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前8-15小時加入氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR

）。在細胞增殖過程中，

3H-TdR可摻入細胞新合成的DNA中，摻入量與細胞增殖水平成正比。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞，用液體閃爍儀測定樣品的放射活性，可反映細胞的增殖狀況。該法靈敏可靠，應用廣泛，但需特殊儀器，且易發(fā)生放射性污染。常用檢測方法：2021/1/530（一）T細胞增殖試驗2、MTT法：

MTT是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑。取外周血單個核細胞與PHA共同培養(yǎng)，在培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入MTT。常用檢測方法：在細胞增殖過程中，MTT可摻入細胞，并作為胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的底物參與反應，形成褐色甲臜顆粒。甲臜生成量與細胞增殖水平成正比，當甲臜被鹽酸異丙醇或二甲基亞砜溶解后，借助酶標測定儀檢測細胞培養(yǎng)物OD值，即可反映細胞的增殖水平。

該法靈敏度不如3H-TdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。2021/1/531（二）B細胞增殖試驗1、抗體形成細胞測定試驗：又稱溶血空斑形成細胞試驗（plaqueformingcellassay，PFC）或溶血空斑試驗（hemolyticplaqueassay）可用來檢測產(chǎn)生抗體的B細胞數(shù)量。方法①將綿羊紅細胞免疫4天后的小鼠脾細胞（內(nèi)含綿羊紅細胞致敏的B細胞——抗體形成細胞）與綿羊紅細胞在凝膠介質(zhì)中混勻；②傾注于平皿板進行孵育，使抗體形成細胞（antibodyformingcell，AFC）周圍的綿羊紅細胞被AFC產(chǎn)生的抗體致敏；③在平皿板表面加豚鼠新鮮補體進行二次孵育，致敏綿羊紅細胞激活補體而發(fā)生溶解，在AFC周圍出現(xiàn)肉眼可見的溶血空斑。

一個溶血空斑代表一個抗體形成細胞（漿細胞），通過計算溶血空斑數(shù)目即可得知B細胞增殖分化和產(chǎn)生抗體的能力。溶血空斑試驗可分為直接法和間接法。上法為直接溶血空斑試驗法，可用來檢測分泌IgM的抗體形成細胞。檢測分泌IgG或其它類別Ig的抗體形成細胞須用間接法。間接法前兩步與直接法相同，第三步需先加入抗IgG或其他類別Ig的抗體（抗-抗體）后，再加豚鼠新鮮補體進行觀察。2021/1/5322021/1/533（二）B細胞增殖試驗2、酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）：方法與原理用已知抗原包被固相載體（硝酸纖維素膜/PVDF膜），加入相應抗原致敏的B細胞（抗體形成細胞）共同孵育后，當抗原致敏的B細胞通過膜表面抗原識別受體（mIgM）接受固相表面相應抗原刺激后，可分泌抗體并與固相表面相應抗原特異性結(jié)合；去除細胞和未結(jié)合的抗體，加入酶標記第二抗體，通過底物顯色，可在分泌抗體的B細胞所在處呈現(xiàn)有色斑點。

一個斑點代表一個抗體形成細胞（漿細胞），通過計算斑點數(shù)目即可得知B細胞增殖分化和產(chǎn)生抗體的能力。2021/1/534（三）細胞毒試驗1、51Cr釋放法：方法與原理將Na251CrO4標記的靶細胞與待檢效應細胞（CTL或NK）按一定比例混合培養(yǎng)一定時間后，若效應細胞能夠殺傷靶細胞，則51Cr可從破壞的靶細胞內(nèi)釋放。應用γ計數(shù)儀測定培養(yǎng)上清中51Cr的放射活性（cpm），即可反映效應細胞的殺傷活性。本試驗是根據(jù)細胞毒性T細胞（CTL）和NK細胞可直接對某些靶細胞產(chǎn)生殺傷作用建立的，主要用于腫瘤免疫、移植排斥反應和病毒感染等方面的研究。常用檢測方法計數(shù)公式：細胞毒活性（%）=最大釋放對照孔cpm均值-自然釋放對照孔cpm均值試驗孔cpm均值-自然釋放對照孔cpm均值×100%2021/1/535（三）細胞毒試驗2、乳酸脫氫酶釋放法：方法與原理將效應細胞與靶細胞按一定比例混合孵育，若靶細胞被殺傷，則存在于胞內(nèi)的乳酸脫氫酶（LDH）釋放。用光度計測定培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶活性（通過加入LDH底物顯色），根據(jù)計算公式可獲得效應細胞的殺傷活性。計數(shù)公式：細胞殺傷活性（%）=最大釋放對照孔OD值-自然釋放對照孔OD值試驗孔OD值-自然釋放對照孔OD值×100%2021/1/536（三）細胞毒試驗3、凋亡細胞檢測法：靶細胞與效應細胞相互作用后，可通過細胞凋亡途徑損傷破壞。（1）形態(tài)學檢測法：凋亡細胞形態(tài)學主要特征為體積縮小，胞質(zhì)濃縮；核染色質(zhì)密度增高，呈現(xiàn)濃染的半月狀、斑塊狀或核著邊現(xiàn)象；細胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體。（2）瓊脂糖電泳法：凋亡細胞DNA可被核酸酶在核小體單位之間隨機切斷，產(chǎn)生180-200bp（核小體單位長度）及其倍數(shù)的寡核苷酸片段，在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)階梯狀DNA區(qū)帶圖譜，借此可判定細胞凋亡。靶細胞凋亡的檢測方法

2021/1/537（三）細胞毒試驗（3）TUNEL法：在細胞培養(yǎng)液中加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxyribonucleotidyl，TdT）和生物素標記的核苷酸，TdT能在游離的DNA3/端缺口連接標記的核苷酸，利用親和素-生物素-酶放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可標示凋亡細胞。（4）流式細胞術(shù)：本法所用標記核苷酸多為dUTP，故稱TUNEL法（TdTdependentdUTP-biotinnickendlabeling）凋亡細胞因核斷裂呈亞二倍體，用FACS分析亞二倍體數(shù)目，可指示細胞凋亡程度；凋亡細胞表面暴露的膜磷脂成分，能與熒光標記的磷脂結(jié)合蛋白（annexinV）結(jié)合，采用FACS分析，可檢測懸浮細胞中凋亡細胞的頻率。2021/1/538二、吞噬細胞功能測定吞噬細胞包括中性粒細胞和巨噬細胞。用外周血單個核細胞分離的方法，收集紅細胞上層即為中性粒細胞。中性粒細胞在趨化因子（如細菌、補體裂解產(chǎn)物C3a/C5a、IL-8等）作用下，可定向移行聚集到感染炎癥部位，發(fā)揮非特異性抗感染免疫作用。在體外，測定中性粒細胞向趨化因子移行的數(shù)量和距離，可得知其趨化功能的強弱。（一）中性粒細胞趨化功能的測定常用方法：

1、瓊脂糖平皿法

2、微孔濾膜法2021/1/539趨化移動指數(shù)計算公式用含有小牛血清的培養(yǎng)液制備瓊脂糖凝膠板，然后在凝膠板同一直線上打三個孔間距相等的孔，中孔加待測中性粒細胞懸液，兩側(cè)孔分別加趨化因子和對照用培養(yǎng)液；凝膠板置濕盒內(nèi)37℃，5%CO2溫浴2-3小時后，用戊二醛固定，取瓊脂層染色，干后置顯微鏡下或用攝影儀放大，測定中孔中性粒細胞從孔緣向兩側(cè)移行的距離。中性粒細胞向?qū)φ湛滓苿拥木嚯x表示其隨意運動的能力。2、微孔濾膜法：又稱Boyden小室法1、瓊脂糖平皿法移動指數(shù)=趨化運動移行的距離/隨意運動移行的距離特制48孔趨化小室，被孔徑為3μm的聚碳濾膜分為上下兩室。上室加待測中性粒細胞懸液，下室加趨化因子或?qū)φ张囵B(yǎng)液。將趨化小室置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，上室內(nèi)中性粒細胞遷移至濾膜朝下的一面，即細胞面，濾膜另一面為非細胞面。取下濾膜，將其非細胞面在盛有PBS緩沖液的平皿中沾濕后，在清洗片上洗去非細胞面上的細胞。再將濾膜置甲醇液中固定，經(jīng)Giemsa染色后，在高倍鏡下計數(shù)，隨機選取5個視野，計數(shù)細胞取均值。趨化指數(shù)=實驗組趨化的細胞數(shù)/對照組趨化的細胞數(shù)，趨化指數(shù)大于2時有意義。2021/1/540（二）中性粒細胞吞噬功能測定1、顯微鏡檢查法：將中性粒細胞與白色念珠菌或表皮葡萄球菌共育一定時間后，取樣制片，經(jīng)美藍染色后，在油鏡下觀察中性粒細胞對細菌的吞噬情況，計數(shù)吞噬細菌和未吞噬細菌的中性粒細胞數(shù)及每個中性粒細胞吞噬的細胞數(shù)。按下列公式計算吞噬率和吞噬指數(shù)吞噬率（%）=（吞噬細菌的中性粒細胞數(shù)/200個中性粒細胞）×100%吞噬指數(shù)=200個中性粒細胞中所吞噬的細菌總數(shù)200個吞噬細菌的中性粒細胞×100%2021/1/541（二）中性粒細胞吞噬功能測定2、硝基藍四氮唑試驗：在抗凝血或白細胞懸液中加入硝基藍四氮唑（nitrobluetetrazolium，NBT）溶液后，由于中性粒細胞在殺菌過程中產(chǎn)生的超氧陰離子（O2-）能使被吞入細胞內(nèi)的NBT還原成不溶解的暗藍色甲臜，而成為NBT陽性細胞。因此光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞百分率，即反映中性粒細胞的殺傷功能。3、熒光標記物試驗：將熒光標記的生物顆粒（如大腸桿菌、白色念珠菌等）與白細胞懸液混合，溫育一定時間后加入臺盼藍并洗滌，以去除未被吞噬的熒光顆粒，