分子生物學(xué)3重點(diǎn)

密碼子的簡(jiǎn)并性由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象叫簡(jiǎn)并(degeneracy)。對(duì)應(yīng)于同一氨基酸的密碼子叫同義密碼子。密碼子：MRNA上每3個(gè)相鄰的核苷酸編碼PRO多肽鏈中的一個(gè)AA,這三個(gè)核苷酸就稱為一個(gè)密碼子或三聯(lián)體密碼。操縱子：操縱子是原核生物基因表達(dá)的單元，它包括被協(xié)同調(diào)節(jié)的基因(結(jié)構(gòu)基因)和被調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物所識(shí)別的調(diào)控元件。內(nèi)含子：斷裂基因中外顯子的間插序列，可參與前體RNA的轉(zhuǎn)錄，但其轉(zhuǎn)錄的RNA序列于轉(zhuǎn)錄后的加工中被切除，不包括于成熟的RNA分子中．同尾酶：有些來源不同的限制酶，識(shí)別及切割序列各不相同，但卻能產(chǎn)出相同的粘性末端，這類限制酶稱為同尾酶。星號(hào)活性,在非理想的條件下，內(nèi)切酶切割與識(shí)別位點(diǎn)相似但不完全相同的序列，這一現(xiàn)象稱星號(hào)活性。開放閱讀框(ORF)從mRNA5端起始密碼子AUG到3端終止密碼子之間的核苷酸序列,各個(gè)三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個(gè)蛋白質(zhì)多肽鏈,稱為開放閱讀框架氨基酸的等電點(diǎn)：當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(diǎn)亞克?。菏强寺?shí)驗(yàn)中最簡(jiǎn)單的一種，即將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體的轉(zhuǎn)移，這一過程被稱為亞克隆。生物大分子：是指生物體內(nèi)由分子量較低的基本結(jié)構(gòu)單位首尾相連形成的多聚化合物。包括核酸、蛋白質(zhì)和多糖?；?DNA分子中含有特定遺傳信息的核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)的功能單位；是合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必需的全部核酸序列。外顯子：斷裂基因中含有蛋白質(zhì)編碼信息的部分．每個(gè)外顯子均編碼一個(gè)完整蛋白質(zhì)的特定部分重疊基因：指兩個(gè)或兩個(gè)以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。移動(dòng)基因：是基因組中可移動(dòng)的一段ＤＮＡ序列，可將其本身從基因組內(nèi)的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移至另一位置．（能將自身插入到宿主基因組新位點(diǎn)的特異的DNA序列）。假基因：具有與功能基因相似的序列，但不能翻譯為功能蛋白質(zhì)的基因片段．通常是由先前的功能基因積累突變而形成的?；蛲蛔儯菏侵敢粋€(gè)基因內(nèi)部可以遺傳的結(jié)構(gòu)改變，是基因分子內(nèi)部在某種條件作用下所發(fā)生的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的改變，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)蛋白或酶的改變，從而影響有機(jī)體的大小、品質(zhì)、顏色、結(jié)構(gòu)和生長率等性狀的改變。C值：通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量。C值悖理：生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加。單核苷酸多態(tài)性(SNP)：在基因組水平由單個(gè)核苷酸差異所引起的DNA序列多態(tài)性。質(zhì)粒：是位于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的可自主復(fù)制的遺傳成分，可賦予宿主細(xì)胞一定的生物性狀?；蜉d體：能將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。細(xì)菌質(zhì)粒：是獨(dú)立于宿主基因組復(fù)制、編碼抗生素抗性基因的小型環(huán)狀DNA分子、運(yùn)載克隆DNA的常用載體、。穿梭質(zhì)粒：是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可以在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體．黏粒：一類由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體?；蛭膸欤菏莵碜阅成锏牟煌珼NA序列的總集，這些DNA序列都被克隆進(jìn)了載體，以便于純化、貯存與分析?；蚪M文庫：將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段克隆到某種載體上，再轉(zhuǎn)化細(xì)菌而形成的集合。簡(jiǎn)稱G-文庫。cDNA文庫：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的mRNA全部經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合,又稱c文庫。插入失活效應(yīng)：因DNA片段的插入而導(dǎo)致編碼基因失活的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化率：每毫克轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA所產(chǎn)生的具抗生素抗性的克隆數(shù)。轉(zhuǎn)化：是細(xì)菌吸收外源DNA，通常是質(zhì)粒DNA的過程，質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)入具有特定遺傳性狀的大腸桿菌菌株而被克隆。酵母人工染色體(YAC)：酵母人工染色體是將酵母染色體復(fù)制與分離所需的序列與大片段目的DNA連接而構(gòu)成的，可克隆外源片段的長度可大于1Mb。細(xì)菌人工染色體（BAC載體）（BAC)：在大腸桿菌F因子的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，能容納長達(dá)100-350KB的插入序列。單核苷酸多態(tài)性(SNP)：在基因組水平由單個(gè)核苷酸差異所引起的DNA序列多態(tài)性。限制酶：限制性內(nèi)切核酶，又稱限制酶，是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶。單位酶：在建議使用的緩沖液及溫度下，在20ul反應(yīng)液中反應(yīng)1小時(shí)，使1ulDNA完全消化所需的酶量。同裂酶：來源不同的限制酶，能識(shí)別和切割相同的序列，這類限制酶稱為同裂酶。黏末端：具有突出末端的限制性酶解反應(yīng)的產(chǎn)物的末端稱為黏末端。核酸分子雜交：互補(bǔ)的核苷酸序列通過堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜交雙鏈dna分子的過程。反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）：一細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為模版，采用特異性引物、loig-dT或隨機(jī)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在以cDNA作為模版，通過特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因。逆轉(zhuǎn)錄：以細(xì)胞內(nèi)總RNA或MRNA為模板，利用特異性引物olig-dT或隨機(jī)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用反轉(zhuǎn)錄成CDNA，再以CDNA作為模板，通過特異性引物，PCR擴(kuò)增目的基因。微管：是細(xì)胞骨架真核生物纖毛和鞭毛以及許多細(xì)胞表面毛狀結(jié)構(gòu)的主要組分。a-互補(bǔ)：宿主和質(zhì)粒編碼的片段單獨(dú)時(shí)沒有酶活性，但他們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的PRO,這樣LACZ基因在宿主細(xì)胞與質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，成為A-互補(bǔ)。PRO生物合成：又稱翻譯，是指由RNA將基因DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)變成AA序列的過程TM：溶解溫度，通常把熱變性過程中A260達(dá)到最大值一半時(shí)的溫度稱為該DNA的溶解溫度。變性：在物理、化學(xué)因素影響下，DNA堿基對(duì)間的氫鍵斷裂，雙螺旋解開，這是一個(gè)躍變過程，伴有A260增加，DNA的功能喪失。復(fù)性：在一定條件下，變性DNA單鏈間堿基重新恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，伴有A260減少，DNA的功能恢復(fù)。感受態(tài)細(xì)胞：用CA2+處理大腸桿菌細(xì)胞，可使之成為易接受質(zhì)粒DNA的感受態(tài)細(xì)胞。啟動(dòng)子：是一段特定的直接與RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始與否的DNA序列。結(jié)構(gòu)域:在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多臺(tái)進(jìn)一步卷曲折疊成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立、近似球形的三維實(shí)體，再由兩個(gè)或兩個(gè)以上這樣的三維實(shí)體締合成三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種相對(duì)獨(dú)立三維實(shí)體稱為結(jié)構(gòu)域。啟動(dòng)子：是一段特定的直接與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始與否的DNA序列。DNA連接：DNA連接酶可以修復(fù)雙鏈DNA骨架的斷裂，催化限制酶酶解反應(yīng)的逆反應(yīng)，使退火的互補(bǔ)粘性末端共價(jià)連接在一起，形成新的DNA分子。1、瓊脂糖凝膠電泳原理在一定PH條件下，每一種分子都具有特定的電荷，大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)他們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上二形成緊密的泳動(dòng)帶，當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶染色，在紫外光下至少可以檢出1-10NG的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置，當(dāng)電場(chǎng)加載于具導(dǎo)電性的緩沖液中的瓊脂糖凝膠上后，DNA片段在凝膠中依據(jù)其大小和形狀以一定的速率向正極方向移動(dòng)(DNA具有很高的負(fù)電性)較小的線性片段比較大片段移動(dòng)得快，因?yàn)檩^大片段會(huì)被構(gòu)成凝膠的瓊脂糖纖維網(wǎng)的障礙所阻滯。2、蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)1、一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈中氨基酸的排列順序，包括二硫鍵的位置稱為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)。這是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)，它內(nèi)寓著決定蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物功能的信息。2、二級(jí)結(jié)構(gòu)：指肽鏈主鏈不同區(qū)段通過自身的相互作用，形成氫鍵，沿某一主軸盤旋折疊而形成的局部空間結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元。主要有以下類型：（1）α－螺旋（2）β－折疊（3）β－轉(zhuǎn)角（4）無規(guī)則卷曲。3、三級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鍵在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用進(jìn)一步卷曲折疊，借助次級(jí)鍵維系使α－螺旋、β－折疊片、β－轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)相互配置而形成特定的構(gòu)象。三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成使肽鏈中所有的原子都達(dá)到空間上的重新排布。4、四級(jí)結(jié)構(gòu)：指由相同或不同的稱作亞基（subunit）的亞單位按照一定排布方式聚合而成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力是疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范得華力。亞基本身都具有球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)，一般只包含一條多肽鏈，也有的由二條或二條以上由二硫鍵連接的肽鏈組成。3、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制起始：全酶在σ亞基的幫助下尋找啟動(dòng)子，一旦與啟動(dòng)子結(jié)合，RNAP引起轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近至少10個(gè)堿基對(duì)解鏈，形成二元開放性啟動(dòng)子復(fù)合物。然后，RNAP中的起始位點(diǎn)和延長位點(diǎn)被相應(yīng)的三磷酸核苷酸占據(jù)，在β亞基的催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酯鍵。此時(shí)的復(fù)合物稱為三元復(fù)合物。然后σ亞基從全酶解離下來。核心酶與DNA的結(jié)合是非特異的，有利于RNA合成的延伸。延伸：RNA聚合酶沿著DNA鏈移動(dòng)，順次合成RNA鏈。DNA在移動(dòng)的聚合酶抵達(dá)之前解旋，在其經(jīng)過之后又恢復(fù)成雙螺旋。在延伸過程中起始位點(diǎn)充當(dāng)了RNA的3’端位點(diǎn)，延伸位點(diǎn)功能不變。RNA合成速度大約為30-50個(gè)nt/s。但是延伸速度是不恒定的，有時(shí)會(huì)降低速度或延宕。在通過富含G.C對(duì)的模板以后約8-10個(gè)堿基，則會(huì)出現(xiàn)一次延宕。終止：RNA聚合酶識(shí)別終止子，導(dǎo)致不再有新的核苷酸插入，該序列通常是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4、引物設(shè)計(jì)的原則1引物的長度以15-30Bp為宜2引物中的堿基分布是隨機(jī)的，應(yīng)盡量避免相同堿基的連續(xù)排列3避免兩引物間的互補(bǔ)，以免形成引物二聚體4引物一定要與模板配對(duì)5引物必須經(jīng)GENBANK查詢后，證實(shí)沒有與其他非目的DNA有高度互補(bǔ)，才能使用5、人類基因組計(jì)劃：是描述人類基因組和其他生物基因組特征，發(fā)展基因組學(xué)新技術(shù)，闡明與此相關(guān)的倫理、法學(xué)和社會(huì)影響的一個(gè)國際性研究項(xiàng)目。該計(jì)劃所產(chǎn)生的所有數(shù)據(jù)都可公共自由地使用。其主要內(nèi)容是開發(fā)基因組工具和資源，對(duì)人類和其他生物基因組進(jìn)行圖譜繪制和測(cè)序.1、闡明人類基因組序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置。2、破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我。3、解碼生命、了解生命的起源和生命體生長發(fā)育規(guī)律。4、認(rèn)識(shí)種屬之間和個(gè)體之間存在差異的起因、認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象，為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。6、P位點(diǎn)：肽酰－tRNA位點(diǎn)a、大部分在小亞基內(nèi)，小部分在大亞基內(nèi)16SrRNA的3‘末端、L2等蛋白b、能夠與起始tRNA（fMet—tRNAf）相結(jié)合，且P位點(diǎn)會(huì)影響A位點(diǎn)的活性A位點(diǎn)：氨酰基tRNA位點(diǎn)a、主要在大亞基上b、A位點(diǎn)內(nèi)mRNA表面只對(duì)特定的aa—tRNA分子,表現(xiàn)出特異性，且A位點(diǎn)結(jié)合aa—tRNA要求在P位點(diǎn)上必須有肽酰tRNA存在7、影響限制性內(nèi)切酶酶活性的因素及酶切反應(yīng)的注意事項(xiàng)1、DNA的濃度2、DNA的甲基化程度3、酶切化反應(yīng)的溫度4、核算內(nèi)切限制酶的緩沖液1質(zhì)粒的量一定要過量。

50ul洗脫液的小抽質(zhì)粒要用16ul.

E:2ul.

Buffer:10*2ul.反應(yīng)體積20ul.正常情況下37度反應(yīng)2到3小時(shí)足夠。否則，

質(zhì)粒量少，你會(huì)看不到條帶。8、堿變法制備質(zhì)粒的原理原理：堿變性法抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性及復(fù)性的差異達(dá)到分離目的，在PH高達(dá)12.6的堿性條件，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋加共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，在用PH4.8的醋酸鹽緩沖液調(diào)至中性PH，則變性質(zhì)粒DNA恢復(fù)至原來的構(gòu)型，保存于溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一齊沉淀而被除去。9、基因組文庫定義及其主要構(gòu)建步驟基因組文庫：將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的DNA片段克隆到某種載體上，再轉(zhuǎn)化細(xì)菌而形成的集合。簡(jiǎn)稱G-文庫。構(gòu)建基因組DNA文庫的主要步驟？1、DNA片段的制備2、DNA片段與載體的連接3、重組體轉(zhuǎn)化與克隆4、篩選鑒定基因組10、藍(lán)-白篩選的原理答：藍(lán)白斑篩選：1、有些質(zhì)粒載體帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA短區(qū)段，編碼β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的N端部分（146aa)，其中插入了一個(gè)并不破壞讀框的多克隆位點(diǎn)（MCS），適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。2、宿主和質(zhì)粒編碼的片段單獨(dú)時(shí)沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣lacZ基因在宿主細(xì)胞與質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α-互補(bǔ)。3、由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。4、當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。由于這種顏色標(biāo)志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。11、外顯子：斷裂基因中含有蛋白質(zhì)編碼信息的部分．每個(gè)外顯子均編碼一個(gè)完整蛋白質(zhì)的特定部分．特點(diǎn)：1、外顯子在DNA中的次序與其mRNA一致。2、不同物種的相關(guān)基因的外顯子序列通常是保守的．利用這種保守性可以分離基因．3、外顯子通常短小，典型的外顯子編碼不到100aa.只有外顯子的突變才會(huì)影響蛋白質(zhì)的序列．4、外顯子是進(jìn)化單位？12內(nèi)含子：斷裂基因中外顯子的間插序列，可參與前體RNA的轉(zhuǎn)錄，但其轉(zhuǎn)錄的RNA序列于轉(zhuǎn)錄后的加工中被切除，不包括于成熟的RNA分子中．特點(diǎn)：1、不同斷裂基因所含的內(nèi)含子數(shù)目大不相同。2、不同來源的內(nèi)含子的分子大小相差懸殊。3、內(nèi)含子的位置通常是保守的。4、其長度變化可以很大，高等生物的基因大小主要取決于內(nèi)含子的大?。?3真核生物基因組的一般特點(diǎn)真核生物基因組的特點(diǎn)：1．基因組含有更大的DNA分子，以染色體形式儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的。注意C值悖理”。2.基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有多個(gè)復(fù)制啟始位點(diǎn)，但每個(gè)復(fù)制子的長度較小。3.基因是不連續(xù)的。4.轉(zhuǎn)錄單位一般是單順反子的。5.存在重復(fù)序列：1）高度重復(fù)序列（>105次）；2）中度重復(fù)序列（<105次）；3）單一序列。6.存在多基因家族和超基因家族。7.基因類型多樣14、基因突變的特征以及基因突變對(duì)蛋白質(zhì)序列的影響類型基因突變的特征：1、突變的重演性和可逆性2、突變的多方向性與復(fù)等位基因3、突變的有害性和有利性4、突變的稀有性和隨機(jī)性?；蛲蛔兊念愋停?）：根據(jù)突變對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸序列的影響：（1）錯(cuò)義突變:由于單個(gè)堿基替換導(dǎo)致肽鏈中的氨基酸發(fā)生改變。在DNA中一對(duì)堿基的改變引起一個(gè)mRNA密碼的改變，結(jié)果使得多肽鏈中原來的一個(gè)氨基酸，變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸，導(dǎo)致表型的改變。（2）無義突變：由于某一堿基被替換后，原來編碼某一氨基酸的密碼子突變成為終止密碼子（UAG、UAA或UGA），從而造成蛋白質(zhì)尚未全部合成就終止了翻譯，形成無功能的多肽鏈。（3）中性突變：基因中一個(gè)堿基對(duì)的變化改變mRNA的一個(gè)密碼子，產(chǎn)生氨基酸的替換，但不影響蛋白質(zhì)的功能，從mRNA信息翻譯的蛋白質(zhì)的功能上檢測(cè)不到所發(fā)生的變化。（4）沉默突變:某基因的一個(gè)堿基對(duì)的變化改變了mRNA中的一個(gè)密碼子，該密碼子與原密碼子一樣編碼相同的氨基酸，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)仍為野生型功能。（5）移碼突變:由基因內(nèi)增加或減少一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)所引起的密碼子的改變。得到較短或異常長的無功能蛋白質(zhì)。15、、質(zhì)粒的生物學(xué)特性：1、質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外能自主復(fù)制的環(huán)形雙鏈DNA分子。2、編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因的質(zhì)粒叫R質(zhì)粒。3、質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定地條件下又會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復(fù)制而復(fù)制。4、部分質(zhì)?？煞譃椋航雍闲唾|(zhì)粒（自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒）和非接合型質(zhì)粒（不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒）。5、根據(jù)每個(gè)寄主細(xì)胞中質(zhì)?？截悢?shù)的多少，可分為：嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)少，為1-3個(gè)）和松弛型復(fù)制質(zhì)粒（拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個(gè)拷貝），其分型與寄主狀況有關(guān)6、質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個(gè)寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。這樣的兩種質(zhì)粒也稱不親和質(zhì)粒。質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)選在：1、具有復(fù)制起點(diǎn)：能自主復(fù)制。2、具有抗菌素抗性基因：兩個(gè)或兩個(gè)以上。3、若干個(gè)限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）4、較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。5、作為載體的質(zhì)粒必定包括復(fù)制基因、選擇性標(biāo)記和克隆位點(diǎn)三部分16病毒基因組的一般特點(diǎn)：1、每種病毒中只有一種核酸，DNA或RNA。2、病毒核酸大小差別很大。一般DNA病毒較大，RNA病毒較小。3、大部分病毒核酸是單倍體。4、噬菌體基因組中無內(nèi)含子，但感染真核細(xì)胞的病毒基因中具有內(nèi)含子。5、有基因重疊現(xiàn)象。6、大部分DNA用于編碼蛋白質(zhì)，只有一小部分是不翻譯的。7、調(diào)控序列可以被宿主細(xì)胞所識(shí)別。17細(xì)菌基因組的一般特點(diǎn)：1、基因組相對(duì)較?。?06bp），只有一個(gè)復(fù)制其實(shí)位點(diǎn)。2、具有操控子結(jié)構(gòu)。3、基因是連續(xù)的。4、大部分DNA是用于編碼蛋白質(zhì)的，只有一小部分不翻譯的。5、基因組中僅有少數(shù)基因存在重疊現(xiàn)象。6、結(jié)構(gòu)基因是單拷貝，rRNA基因是多拷貝。18真核生物基因組的一般特點(diǎn)：1、基因組含有更大餓DNA分子，以染色體形式儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞的基因的基因組的雙份的。2、基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有多個(gè)復(fù)制啟始位點(diǎn)，但每個(gè)復(fù)制子的長度較小。3、基因是不連續(xù)的。4、轉(zhuǎn)錄單位一般是單順反子。5、存在重復(fù)序列：高度重復(fù)序列（>105次），中度重復(fù)序列（<105次），單一序列。6、存在多基因家族和超基因家族。7、基因類型多樣。19RNA分離提純?cè)恚篟NA是一種極易降解的核酸分子，存在胞質(zhì)及胞核中，利用高濃度變性異硫磬氰胍使細(xì)胞結(jié)構(gòu)迅速破碎，使RNA從細(xì)胞中釋放出來，核糖體蛋白也從RNA降解下來，高濃度異硫氰胍和硫基乙醇還可使細(xì)胞內(nèi)的各種RNA酶失活，使釋放出的RNA不易被降解。細(xì)胞裂解后存在于裂解溶液內(nèi)的有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)及細(xì)胞殘片，通過酚和氯仿等有機(jī)溶劑處理，離心，使RNA與其他組分分離，得到純化的RNA。20蛋白質(zhì)的合成體系包括以下物質(zhì)

1.原料:20種氨基酸

2.直接模板:mRNA

3.特異的運(yùn)載工具:tRNA

4.合成場(chǎng)所:核蛋白體(rRNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體)

5.蛋白質(zhì)合成過程所需的酶:氨基酰-tRNA合成酶,轉(zhuǎn)肽酶和轉(zhuǎn)位酶

6.蛋白質(zhì)因子:起始因子(IF),延長因子(EF)和釋放因子(RF)

7.供能物質(zhì):ATP,GTP

8.無機(jī)離子:K+,Mg2+21、蛋白質(zhì)合成過程中的模板是什么有何特點(diǎn)原核生物,真核生物的模板在功能上有何差異(二)1.mRNA是翻譯的直接模板

2.mRNA特點(diǎn):種類多,分子長短不一(因?yàn)橛伤幋a的多肽鏈長度不同)且壽命短

3.原核,真核生物mRNA功能的不同點(diǎn):

原核生物:一種mRNA往往為功能相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)編碼,是多順反子.

真核生物:①真核生物mRNA比原核生物多

②一個(gè)mRNA一般只為一種蛋白質(zhì)編碼,是單順反子

③經(jīng)加工修飾成熟后,mRNA才起模板作用22、蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制4.1起始

①30S亞基與mRNA的結(jié)合:在一定Mg2+的生理?xiàng)l件下,核糖體亞基很容易締合,所以70S核糖體在IF3作用下解離,然后再形成30S-IF3復(fù)合物,接著與mRNA結(jié)合.

②30S-IF3-mRNA與起始tRNA結(jié)合:在IF1和IF2的作用下和GTP的參與下,30S-IF3-mRNA與起始fMet-tRNAf結(jié)合,形成30S起始復(fù)合物30S-mRNA-fMet-tRNAf-GTP-IF1-IF2,并釋放出IF3.

③70S起始復(fù)合物的形成:50S的加入和GTP的水解,形成70S起始復(fù)合物70S-mRNA-fMet-tRNAf,釋放出IF1和IF2.fMet-tRNAf位于核糖體的P位上.

4.2延伸

①aa-tRNA與核糖體結(jié)合:在氨酰tRNA合成酶催化下,氨基酸被專一的tRNA所攜帶,生成aa-tRNA在EF-Tu和GTP作用下強(qiáng)烈促進(jìn)aa-tRNA與核糖體A位結(jié)合.

②肽鍵形成:aa-tRNA結(jié)合于核糖體A位后,在肽基轉(zhuǎn)移酶催化下,將P位tRNA上的肽基通過其羧基與A位tRNA上氨基酸的α-氨基連接,形成肽鍵.

③移位:肽鍵形成后,核糖體處在前移位狀態(tài),這時(shí)占領(lǐng)P位的是去?；痶RNA,A位為肽基tRNA,然后進(jìn)行移位,核糖體與mRNA相對(duì)移動(dòng)一個(gè)密碼子距離,肽基tRNA從A位移至P位,去酰化tRNA離開P位,移位被EF-G催化,隨之GTP水解,并導(dǎo)致EF-G釋放.

4.3終止

肽鏈延伸過程中,當(dāng)終止密碼子UAA,UGA,UAG出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí),沒有相應(yīng)的aa-tRNA可以與之結(jié)合,而釋放因子在GTP存在下,卻能識(shí)別這些密碼子并與之結(jié)合,激活肽基轉(zhuǎn)移酶,把P位上的肽基轉(zhuǎn)移至水分子,即水解P位上多肽與tRNA之間的鍵,接著新生的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放,完成多肽鏈的合成.釋放因子RF具有GTPase的活力,它催化GTP水解,使肽鏈與核糖體脫離.23\原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄的相同點(diǎn)與不同點(diǎn)原核生物真核生物一個(gè)RNA聚合酶三個(gè)RNA聚合酶不同啟動(dòng)子之間有相當(dāng)大的同源性各個(gè)啟動(dòng)子之間的差異很大聚合酶直接同啟動(dòng)子結(jié)合聚合酶通過轉(zhuǎn)錄因子的相互作用進(jìn)行結(jié)合沒有增強(qiáng)子有增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄作用的終止靠幾個(gè)U前面形成莖環(huán)轉(zhuǎn)錄作用的終止靠在轉(zhuǎn)錄過程特殊的核酸內(nèi)切酶切割的序列介導(dǎo)的啟動(dòng)子通常位于基因的上游核聚酶Ⅲ的啟動(dòng)子位于被轉(zhuǎn)錄的序列中轉(zhuǎn)錄單位常常含有多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄單位只含一個(gè)基因真核生物載體舉例：1、穿梭質(zhì)粒載體。2、桿狀病毒載體。3、哺乳動(dòng)物病毒載體。4、狂犬病毒載體。純化基因組DNA的方法：1、真核生物：制備細(xì)胞核，再用蛋白酶降解和分相提?。ǚ?、氯仿）除去蛋白質(zhì)、脂類及其他雜質(zhì)大分子。2、真核生物：可以直接抽提DNA。用該法制備的基因組DNA由染色體斷裂而形成的數(shù)百kb大小的長片段構(gòu)成。常用的RNA酶抑制劑：焦炭酸二乙酯（DEPC）、異硫氰酸胍、氧釩核糖核苷復(fù)合物、RNA酶的蛋白抑制劑。影響限制酶活性的因素：1、DNA的濃度。2、DNA的甲基化程度。3、酶切消化反應(yīng)的溫度。4、核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液。重組DNA技術(shù)的基本原理：1、目的基因的獲取。2、克隆載體的選擇與構(gòu)建。3、外源基因與載體的連接。4、重組DNA導(dǎo)入受體菌。5、重組體的篩選。6、克隆基因的表達(dá)。DNA克隆的基本過程：1、分：分離目的基因。2、切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割。3、接：目的基因與載體結(jié)合。4、轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌。5、篩：篩選出含有重組體的受菌體。重組體篩選的方法：1、直接篩選法：抗藥性選擇、分子雜交法。2、間接篩選法：核酸水平（酶切圖譜、核酸探針、PCR、序列測(cè)定），蛋白質(zhì)水平（免疫學(xué)的技術(shù)、SDS、Westernblot、ELISA、放免、免疫沉淀、熒光抗體等）?？寺NA的鑒定方法：1、瓊脂糖凝膠電泳。2、限制性酶切圖譜。3、PCR鑒定。4、分子雜交。5、序列測(cè)定。分離細(xì)胞器的離心方法（3種）。差速離心法速率區(qū)帶離心法等密度離心法點(diǎn)突變分為：①同義突變；②錯(cuò)義突變；③無義突變；④終止密碼突變。3種完成基因組測(cè)序的動(dòng)物：雞狗人DNA探針分類非放射性放射性質(zhì)粒DNA的制備：小量法：堿裂解法大量法：CSCL密度梯度離心法。蛋白質(zhì)分析法:凝膠過濾層析，超速離心，離子交換層析原核生物多肽鏈的合成過程：1、肽鏈合成的起始2、肽鏈的延長3、肽鏈合成的終止和釋放。15、影響轉(zhuǎn)化效率的因素1細(xì)菌的生長狀態(tài)2試劑的質(zhì)量3、外源DNA的質(zhì)量與數(shù)量4、器皿的潔凈度5、污染—盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行16、T4dna連接酶的功能T4DNA連接酶可以修復(fù)雙鏈DNA骨架的斷裂，催化限制酶酶解反應(yīng)的逆反應(yīng)，使退火的互補(bǔ)黏性末端共價(jià)連接在一起，形成新的DNA分子。主要是催化雙鏈DNA一端的3’-OH與另一雙鏈DNA5’端的磷酸根形成3’,5’-磷酸二酯鍵，使具有相同粘末端或平端的DNA末端連接起來。15、重組DNA技術(shù)的基本原理1、目的基因的獲取2、克隆載體的選擇與構(gòu)建3、外源基因與載體的連接4、重組DNA導(dǎo)入受體菌5、重組體的篩選6、克隆基因的表達(dá)16、DNA克隆的基本過程分：分離目的基因。切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割接：目的基因與載體結(jié)合轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌篩：篩選出含有重組體的受菌體一病毒DNA的提取1.CTAB法提取。2.采用UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒：具體方法按照試劑盒上所