血片制作與染色

瘧原蟲(chóng)血片制作及染色技術(shù)2024/11/71血片制作所需設(shè)備載玻片具有磨砂面，且規(guī)格是玻片寬度乘長(zhǎng)度在25.2*75.2mm，厚度1mm~1.2mm為好。推玻片有專用的。但現(xiàn)在一般選擇邊緣光滑整齊的載玻片替代推玻片。采血針使用一次性的采血針。玻片盒木制/塑料均可以。75%酒精棉球用于采血部位的消毒。記號(hào)筆/B2鉛筆用于載玻片上編寫號(hào)碼。Whatman(沃特曼)903號(hào)；將濾紙切成10*2cm大小的紙片，以口徑為1.2cm的大孔管，在濾紙上壓出兩個(gè)圓形印跡備用。載玻片的清洗

載玻片用以涂制血膜的載玻片，必須清潔無(wú)油跡。有油跡的載玻片涂制的厚血膜容易脫落，薄血膜涂不均勻。新玻片處理應(yīng)浸于有液態(tài)洗滌劑清水中10~20分鐘，然后用干凈棉巾逐個(gè)擦拭，再用清水沖洗干凈，晾干后用干凈柔軟的棉巾擦亮備用。也可以95%的乙醇浸泡5~10分鐘，再用紗布擦干擦亮備用。舊玻片處理用過(guò)的玻片浸泡洗滌劑溶液中1~2天或者浸泡于煮沸好的5%肥皂水中1~2小時(shí)，逐個(gè)擦去玻片上的舊血膜痕跡，用清水漂洗干凈擦干擦亮。洗凈載玻片處理每10~20張用白紙包好或者裝原玻片盒里再放入塑料袋內(nèi)，保存于干燥環(huán)境中備用。2024/11/73取血部位及方法取血部位及方法

取血部位以耳垂較為合適，也可在無(wú)名手指末端采血，嬰兒可從拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位后，以一次性采血針迅速刺入取血部位1~2毫米深，然后用左手大拇指、食指和右手中指協(xié)同擠出血滴。2024/11/74采血時(shí)間取血時(shí)機(jī)現(xiàn)癥病人一般可隨時(shí)取血，瘧疾普查時(shí)可不考慮取血時(shí)機(jī)。但在診斷或需要某期瘧原蟲(chóng)作標(biāo)本時(shí)，則應(yīng)掌握適宜的取血時(shí)機(jī)。間日瘧在寒熱發(fā)作時(shí)，外周血液中主要可見(jiàn)環(huán)狀體期；發(fā)作后數(shù)小時(shí)，環(huán)狀體發(fā)育到滋養(yǎng)體期，瘧色素形成，形態(tài)較易辯認(rèn)，為診斷瘧疾的有利時(shí)機(jī)；36~48小時(shí)，可檢出裂殖體；發(fā)作一、二次后，配子體出現(xiàn)較多。惡性瘧較理想的取血時(shí)間是在發(fā)作后至20小時(shí)內(nèi)取血，初發(fā)患者退熱后常查不到瘧原蟲(chóng)。2024/11/75涂制血膜規(guī)則用于檢查瘧原蟲(chóng)的血涂片有兩種：一種是將血液涂呈薄膜狀，稱薄血膜；一種是血液涂成圓盤狀，稱厚血膜。薄血膜上的血細(xì)胞要求平輔在玻片上面。涂片順序，先厚后薄；位置分配，血片自左向右：薄-厚-標(biāo)簽；推薄片用玻片短邊。制作厚血膜制作薄血膜

厚血膜血量及涂片方法厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4~5微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜，血膜厚薄均勻，過(guò)厚易于脫落，過(guò)薄達(dá)不到檢出率的要求。2024/11/77薄血膜血量及涂片法薄血膜取潔凈的載玻片2張，1張平置在桌上，以左手拇指，食指夾持載玻片兩端（手指切勿接觸玻片表面），用另一張邊緣平滑（最好為磨口邊緣）的載玻片做推片，用推片一端邊緣的中點(diǎn)從取血部分刮取約1~1.5微升的血量（相當(dāng)于1/4火柴頭大小），使血滴與平置的載玻片接觸，并形成25~35度夾角，待血液向兩側(cè)擴(kuò)展約2厘米寬度時(shí)，均勻而迅速地輕輕向左推出（約2.5厘米長(zhǎng)）且邊緣帶有“舌狀”的薄血膜。2024/11/78厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4-5微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。寡闻c平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜薄血膜再取一小滴血.將血置于離厚血膜適當(dāng)?shù)木嚯x（0.5cm~0.7cm），將推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動(dòng)，使血液沿邊緣散開(kāi)，然后勻速地向前推進(jìn)，形成薄而平鋪的薄血膜。血片制作圖示厚血膜薄血膜制片流程圖示圖1.取血圖2.涂制厚血膜圖3.涂制薄血膜圖4.推片沿玻片兩側(cè)向前推進(jìn)圖5.正確的推片姿勢(shì)涂制厚、薄血膜的位置通常是將厚、薄血膜涂在一張載玻片上。方法是將載玻片分為3等分（留出標(biāo)簽或磨砂面位置后的3等分）。厚血膜涂在載玻片靠近標(biāo)簽或磨砂面方向的右1/3中央處，圓形、厚薄均勻、邊緣整齊。薄血膜涂在載玻片1/2至左1/3的中部位置，舌狀、厚薄均勻。2024/11/711標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片丁板湖北2015.4●

厚血膜

血量：4-5微升

位置：玻片右1/3處

外形：圓形，直徑0.8－1.0cm●

薄血膜

血量：1-1.5微升，位置：玻片1/2外形：薄度均勻、無(wú)劃痕、舌狀,長(zhǎng)約2.0-2.5cm顯微鏡下：紅細(xì)胞單層排列血片編號(hào)血膜制成后，立即將受檢者的個(gè)人編號(hào)寫在玻片磨砂面上（血片的編號(hào)要與血檢登記本上編號(hào)一致）以防差錯(cuò)。2024/11/713制作血膜的注意事項(xiàng)

1.

玻片清洗時(shí)，避免玻片碰撞、磨損。制作血膜的載玻片必須完全清潔而毫無(wú)油漬或污垢。制片時(shí)，手指只能持載片的邊緣，不能接觸玻片表面，以免油污使薄血膜產(chǎn)生空白區(qū)以及厚血膜脫落。作為推片的玻片邊緣一定要平滑，才能使推出的血膜均勻一致。2024/11/714制作血膜的注意事項(xiàng)2.剛涂制的血膜要平放在標(biāo)本盒內(nèi)或者實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上。厚血膜未干前勿使標(biāo)本片傾斜，以免未干的血膜傾向一側(cè)，造成血膜厚薄不均，厚處不易溶血和著色而影響檢查結(jié)果；晾干血膜時(shí)應(yīng)注意防塵、防止蒼蠅、蟑螂等昆蟲(chóng)吮吸血膜，干后應(yīng)及時(shí)裝入標(biāo)本盒內(nèi)。新木制標(biāo)本盒需敞開(kāi)放置一段時(shí)間，讓木醇揮發(fā)后才能使用，以免厚血膜血紅蛋白被其固定，不能溶血或染色效果不佳。2024/11/715制作血膜的注意事項(xiàng)3.血膜讓其自然干燥，切忌用太陽(yáng)曬或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。夏天標(biāo)本盡可能24~48小時(shí)內(nèi)固定染色；冬天也不能超過(guò)72小時(shí)。放置時(shí)間越久，厚血膜越不易溶血，染色效果也差。若不能及時(shí)染色，薄血膜宜先用甲醇固定（1~3分鐘）然后用過(guò)濾清水或自來(lái)水對(duì)厚血膜溶血，晾干后包好置干燥器于冰箱內(nèi)保存，用時(shí)將干燥器置室溫中1~2小時(shí)后取出染色。2024/11/716血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染液種類：目前所用的血片染色液，雖然名稱很多，但都是從羅門諾夫斯基氏創(chuàng)造的染液變化過(guò)來(lái)的?？偟目煞譃樗芤汉途凭芤簝纱箢?，前者包括羅氏、西氏（Simon)、J.S.B氏染液等，后者包括利氏(Leishman)、瑞氏和吉氏染液（被國(guó)家推薦使用）等。這些染液中的主要染劑都包含美蘭、伊紅和由美蘭氧化所成的天青，所以稱為多色性染劑。血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染色原理：伊紅是酸性水溶性鈉鹽，美蘭是堿性水溶性鹽酸鹽，當(dāng)它們各自溶化水中時(shí)，就離解為帶陽(yáng)電和陰電的離子。伊紅主要離解為酸性的陽(yáng)離子，在遇到堿性的蛋白質(zhì)如血紅蛋白、嗜伊紅白血球顆粒等即可結(jié)合成不易溶于水的沉淀物染成紅色。美蘭主要離解為堿性的美蘭離子，美蘭就與瘧原蟲(chóng)、淋巴和大單核細(xì)胞的胞漿、嗜堿性白細(xì)胞的顆粒等酸性蛋白質(zhì)結(jié)合染成蘭色。2024/11/718血片的染色

（一）染液的種類及染色原理染色原理：美蘭與伊紅都不能使原蟲(chóng)和白細(xì)胞的核著色，必須由天青作為媒介（染媒）才能使其著色。天青雖然也是堿性染劑，但又具有染媒作用，使原蟲(chóng)核和白細(xì)胞核等原來(lái)只能染上極淡蘭色的結(jié)構(gòu)染上顯著的酸性染劑伊紅，這樣，就使白細(xì)胞粗大的核染成顯著的既蘭又紅的紫蘭色，而較小或菲薄的原蟲(chóng)核和淋巴細(xì)胞原漿中的顆粒染成紫紅色。2024/11/719血片的染色

（一）染液的種類及染色原理注意：蛋白質(zhì)是二性電解質(zhì)，當(dāng)其處于較等電點(diǎn)為酸的溶液中時(shí)，便呈堿的作用，即與酸或陰離子結(jié)合，這就說(shuō)明為何在染液偏酸時(shí)，伊紅的著色力強(qiáng)，使紅細(xì)胞著色鮮艷而淋巴細(xì)胞和原蟲(chóng)的胞漿著色不顯著；反之，蛋白質(zhì)在偏堿的溶液中呈酸的作用而中和堿基，也就說(shuō)明為何染液偏堿時(shí)，紅細(xì)胞和嗜伊紅白細(xì)胞的顆粒等被染成紫蘭色。

伊紅在水溶液內(nèi)遇到美蘭或天青，即可互相化合而產(chǎn)生沉淀從而失去染色力，因此，吉氏染液的母液絕對(duì)不能進(jìn)水。2024/11/720血片的染色

（二）吉氏染液母液配置方法取吉氏粉0.5克置于研缽中，加少量甘油充分研磨，再加再磨，至25毫升加完為止，倒入60或100毫升帶有玻塞的有色玻瓶中。在研缽中加少量甲醇，洗去甘油染液混入瓶?jī)?nèi)，至25毫升甲醇洗凈缽中甘油染液為止，塞緊瓶塞，充分搖勻，置于55~60℃水浴中或溫箱內(nèi)24小時(shí)或室溫內(nèi)3~5天，多加搖動(dòng)，即成原液。吉氏染液是目前較優(yōu)良的血膜染劑，即使在炎熱天氣中，亦可經(jīng)久不變。材料：1、吉氏粉0.5克2、甘油25毫升3、甲醇25毫升2024/11/721染色前薄血膜甲醇固定用甲醇固定薄血膜，平放，等待厚血膜充分干燥（要點(diǎn)：載玻片略向下傾斜。甲醇不能觸碰到厚血膜）丁板湖北2015.4甲醇固定薄片完成甲醇固定厚血膜PBS或清水溶血染色之前，厚血膜用PBS或清水進(jìn)行溶血。抽取靜脈加了抗凝劑的全血制作的血片須放置1-2天溶血，清水漂洗晾干后再染色，以防血膜脫落。采集不加抗凝劑的血液，新制作的厚血膜，血膜干燥后可直接采用邊溶血邊染色或先溶血后染色的方法染色，血膜不易脫落。但后種方法染色出的血片，鏡檢時(shí)視野里厚血膜干凈清晰，瘧原蟲(chóng)和血細(xì)胞形態(tài)清楚。圖1.在厚血膜滴加PBS或清水圖2.靜置5’~10’，棄去溶解水2024/11/724血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法血膜干燥后，用甲醇或無(wú)水酒精固定薄血膜，用清水或PBS水對(duì)厚血膜溶血，然后再進(jìn)行染色。

成批血片染色：將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液稀釋液（2毫升吉氏染液原液加中性蒸餾水或緩沖液98毫升稀釋均勻即成），同時(shí)對(duì)厚薄血膜染色30分鐘（如染液不合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得酌情增減染色時(shí)間），然后用清水輕輕將染液沖去，再用清水輕輕沖洗一次，干凈后將血片標(biāo)本（血膜面朝內(nèi)、厚血膜方向朝下）插于晾片板上，待干鏡檢。2024/11/725血片的染色

（三）吉氏染液血片染色方法單張血片染色：薄血膜經(jīng)甲醇固定干燥后，用2%吉氏染液的稀釋液1~2毫升，可用中性蒸餾水或緩沖液1~2毫升，加吉氏染液原液1~2滴，混合均勻后滴入血片標(biāo)本血膜上，染色20~30分鐘，然后用清水輕輕將片上的染液沖洗干凈，晾干鏡檢。將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入2%吉氏染液（98毫升的緩沖液或凈水中加入2毫升吉氏染液原液，混勻）浸沒(méi)血片，染色30分鐘。然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾片板上晾干，包裝，待鏡檢（如果染色效果不理想時(shí)，得酌情增減染色時(shí)間和濃度）。血片染色圖示單片染色在量筒內(nèi)先加入1-2mlPBS緩沖液或凈水，然后加入吉氏染液原液1-2滴（或按要求滴加），混勻后，均勻覆蓋在已充分干躁的厚薄血膜上，染色20-30min。清水緩緩沖洗，晾干（血膜面朝內(nèi)、厚血膜方向朝下），等待鏡檢。要點(diǎn)：量筒內(nèi)先加入PBS，再加入吉氏染液原液稀釋好的染色液必須在60分鐘內(nèi)用完，超時(shí)重新配制血片染色圖示黎莉莉湖北2011.7染色質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡下：瘧原蟲(chóng)核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色，薄血膜的紅細(xì)胞單層排列，視野干凈。

外觀：標(biāo)準(zhǔn)顏色應(yīng)為：血膜藍(lán)中帶紫色。如果血膜顏色偏紅色,說(shuō)明染色偏酸性；血膜偏藍(lán)色,則為偏堿性。外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡下影響染色效果的因素血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質(zhì)量好壞等有關(guān)外，還受到以下幾個(gè)因素的影響：（1）染料溶劑的質(zhì)量染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時(shí)所用的器具必須干凈而無(wú)水份。2024/11/729影響染色效果的因素（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常呈現(xiàn)偏堿性。染液存放時(shí)間越久，染色力越強(qiáng)。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應(yīng)加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質(zhì)量。2024/11/730影響染色效果的因素（3）染