文章解讀多位點(diǎn)取樣測序揭示多發(fā)性骨髓瘤基因組空間異質(zhì)性

文章解讀多位點(diǎn)取樣測序揭示多發(fā)性骨髓瘤基因組空間異質(zhì)性在多發(fā)性骨髓瘤中，惡性漿細(xì)胞在骨髓內(nèi)擴(kuò)張。由于骨髓是充分灌注的，可以預(yù)期到惡性漿細(xì)胞的更優(yōu)克隆的快速傳播。然而，在醫(yī)學(xué)成像卻中經(jīng)常觀察到多發(fā)性骨髓瘤的不均衡分布。在本研究中，研究者對包括51例患者的髂骨活檢和基于放射學(xué)引導(dǎo)取樣的病灶標(biāo)本進(jìn)行多區(qū)域測序，以了解空間克隆的結(jié)構(gòu)。超過75％的患者存在空間基因組異質(zhì)性，其中包括CDKN2C和TP53的失活以及影響促分裂原活化蛋白激酶基因的突變。研究表明，空間異質(zhì)性的程度與活檢局部病灶的大小正相關(guān)，與晚期克隆的區(qū)域性生長一致。研究結(jié)果支持了多發(fā)性骨髓瘤在早期階段進(jìn)行克隆更替、晚期階段進(jìn)行區(qū)域進(jìn)化的疾病進(jìn)展模型。本研究提示多區(qū)域測序研究對于了解患者的異質(zhì)性和多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展過程至關(guān)重要。文章題目：Spatialgenomicheterogeneityinmultiplemyelomarevealedbymulti-regionsequencing研究人員：來自阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)骨髓瘤研究所的研究人員發(fā)表時間：2017.08期刊名稱：Nature

Communications影響因子：12.124研究背景多發(fā)性骨髓瘤（MM）是抗體分泌B細(xì)胞漿細(xì)胞（PC）的惡性進(jìn)化物。MM不是一種單一的疾病，而是由一些以特定染色體變異為特征的分子亞型構(gòu)成。與腫瘤進(jìn)化相關(guān)的獲得性基因組變異事件進(jìn)一步導(dǎo)致患者間和患者自身內(nèi)的克隆異質(zhì)性，進(jìn)而導(dǎo)致不同的臨床結(jié)果。多發(fā)性骨髓瘤是一個特別有趣的模型系統(tǒng)，它的突變負(fù)荷位于常見的腫瘤突變范圍之內(nèi)——介于基因復(fù)雜的固體惡性腫瘤和分布在整個骨髓、較少受解剖限制、基因簡單的白血病之間，因此可以借此深入了解癌癥的分子進(jìn)展。根據(jù)達(dá)爾文理論模型，順序性的突變的獲得可以使得克隆細(xì)胞更好地適應(yīng)微環(huán)境，導(dǎo)致更優(yōu)克隆的生長勝過先前占優(yōu)勢的克隆。與白血病類似，MM主要在骨髓中生長，因此推測多發(fā)性骨髓瘤可以通過外周循環(huán)在多個位點(diǎn)之間自由移動或者轉(zhuǎn)移，該推測與使用流式細(xì)胞術(shù)在外周血中觀察到少量骨髓瘤克隆細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致?；诹魇郊?xì)胞的觀察結(jié)果，可以預(yù)期與實(shí)體癌癥相反，多發(fā)性骨髓瘤在整個含骨髓的骨骼系統(tǒng)中快速和均勻地分布更優(yōu)克隆。然而，對于多發(fā)性骨髓瘤而言，這一預(yù)期并未得到證實(shí)，事實(shí)上，正電子發(fā)射斷層掃描（PET）的全身成像結(jié)果與疾病的不均衡分布一致。80％以上的新診斷患者只在有限區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)惡性腫瘤局部病灶；所謂局部病灶，常常呈現(xiàn)出彌漫性間質(zhì)性生長模式。局部病灶的數(shù)量（平均每個患者18）預(yù)示腫瘤的進(jìn)展。為了避免取樣偏差，研究者的診斷取樣方法包括由介入性放射引導(dǎo)的局部病灶取樣和傳統(tǒng)的髂骨活檢。研究者開展應(yīng)用來自臨床的配對樣本的基因組分析。通過對42個新診斷的和11個已經(jīng)治療過的多發(fā)性骨髓瘤患者多區(qū)域測序，研究者證實(shí)了大多數(shù)患者的空間層面的基因組異質(zhì)性。此外，研究者表明空間異質(zhì)性的程度與活檢局部病灶大小正相關(guān)，符合晚期克隆的生長過程。研究者認(rèn)為多區(qū)域測序?qū)τ诹私饣颊邇?nèi)部的異質(zhì)性和多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)化過程至關(guān)重要。研究方法樣本選擇：對42例新診斷的可獲得DNA的患者隨機(jī)采集的髂嵴診斷樣本（RNAS）和CT引導(dǎo)的細(xì)針抽吸物（FNAS）進(jìn)行空間基因組分析（圖

1）。研究治療對空間異質(zhì)性的影響使用來自11名患者的樣品進(jìn)行分析，其中兩名患者也在新診斷患者組中（圖

1）。位點(diǎn)特異性高風(fēng)險克隆的預(yù)后影響研究使用了263名患者的配對的RNAS/FNASGEP70數(shù)據(jù)。研究成果圖1染色體臂層面的異質(zhì)性研究者使用高分辨率單核苷酸多態(tài)性（SNP）微陣列和全外顯子（WES）數(shù)據(jù)來檢測拷貝數(shù)變異（CNA）。為了說明這種方法對亞克隆檢測的靈敏度（閾值：~20％），研究者只使用以克隆的方式起碼出現(xiàn)在配對樣品當(dāng)中的一個的拷貝數(shù)變異?；谶@一策略，研究者發(fā)現(xiàn)在42例新診斷的患者中有17（40％）例染色體景觀存在空間異質(zhì)，就平均而言，每個樣本有三個不共有的拷貝數(shù)變異（范圍在1-28之間，圖2a）。研究者們還發(fā)現(xiàn)所有的常用預(yù)后指標(biāo)在其樣本中都出現(xiàn)空間異質(zhì)。關(guān)鍵的不良預(yù)后指標(biāo)del（17p）在6例患者中有2例（33％）顯示空間異質(zhì)；其次是MYC基因座（t（MYC））的易位，16例患者中有4例（25％）攜帶這種易位（圖2a）。盡管1p的刪除缺失和1q21的擴(kuò)增，與進(jìn)展相關(guān)的重要變化經(jīng)常在不同的空間位置之間共有，但在21位患者中有4位（19％），呈現(xiàn)出局部變異特性（圖2a）。有趣的是，雜合性缺失（LOH），例如1q的雜合性缺失，往往導(dǎo)致空間異質(zhì)性，并且在9名患者（21％，補(bǔ)充數(shù)據(jù)2）中是普遍存在的。染色體1和4的變化是空間異質(zhì)性最常見的貢獻(xiàn)者（n=7），其次是染色體5和8個（n=6），包括缺失，擴(kuò)增和雜合性缺失LOH。突變水平上的異質(zhì)性研究者對非沉默SNV和Indel進(jìn)行了綜合分析，其中不普遍但可檢測的突變被歸類為“非共有”(Unshared)。普遍存在的突變，在配對樣本之間的癌細(xì)胞克隆比例（CCF）至少有三倍差異的，也稱為共有異質(zhì)（“shared-diff”）。研究者將這些共有異質(zhì)變異也歸類為異質(zhì)性突變，因?yàn)樗鼈兾稽c(diǎn)之間的克隆結(jié)構(gòu)非常的不一致。突變分析的表明，空間層面的基因組異質(zhì)性比在CNA水平上看到的更顯著（圖2c）。在新診斷的患者中分別有32例（76％）和30例（71％）發(fā)現(xiàn)非共有和共有異質(zhì)突變，所有CAN差異患者也在突變水平上表現(xiàn)出異質(zhì)性。值得注意的是，異質(zhì)性突變的比例在患者之間差異也很大：有三個患者顯示>50％的非共有突變，另外三個的患者沒有顯示任何可檢測的基因組異質(zhì)性。每個患者的非沉默突變總數(shù)（中位數(shù)為50，范圍：19-435，圖2b）與未共有和共有異質(zhì)突變的比例沒有顯著相關(guān)性（Spearman秩相關(guān)ρ=0.3（P=0.055）和ρ=0（P=1））。治療與空間異質(zhì)性聯(lián)合藥物化療（如全面療法（TT））的治療目標(biāo)，是增加藥物反應(yīng)的深度和根除殘留的耐藥性克隆。因此，對于最初的對藥物有響應(yīng)的患者，研究者預(yù)計復(fù)發(fā)癌是由高強(qiáng)度藥物篩選之后所遺留下來的數(shù)量有限的克隆所組成，從而導(dǎo)致空間異質(zhì)性降低。為了驗(yàn)證這個假設(shè)，研究者分析了一組在MM治療的不同階段嚴(yán)重治療的患者（圖1）。所有患者均在1號染色體上呈現(xiàn)不良預(yù)后標(biāo)記，除2例外均有MAPK通路基因突變，表明治療有較強(qiáng)的選擇壓力（圖2d）。然而，研究者仍然觀察到1q的持續(xù)事件，導(dǎo)致這個區(qū)域在兩個患者的特定部位進(jìn)一步擴(kuò)增（分別為5VS4和4VS3拷貝），RB1的區(qū)域限制性雙等位基因失活，以及具有由NRAS和KRAS突變定義的兩個空間分離的顯性克隆的情況（圖2a，d）。染色體和突變水平的異質(zhì)性平均水平?jīng)]有顯著偏離新診斷患者的相應(yīng)值（Wilcoxon檢驗(yàn)，P>0.05）?？傊?，這些結(jié)果表明，克隆的選擇性和治療的選擇性壓力與進(jìn)一步的腫瘤局部進(jìn)化有關(guān)。圖2位點(diǎn)特異性的高風(fēng)險克隆驅(qū)動腫瘤進(jìn)展基于包括熒光原位雜交和基因表達(dá)譜（GEP）數(shù)據(jù)在內(nèi)的風(fēng)險分層已成為多發(fā)性骨髓瘤常規(guī)診斷的一個組成部分，可用于指導(dǎo)臨床治療。在所分析的一組患者中，25％（13例）顯示不同部位之間GEP70風(fēng)險狀態(tài)的差異，比如，1號病人（圖3a）。在這種情況下，在髂骨處的顯性GEP70低風(fēng)險克隆具有HRD核型，并且還包含位點(diǎn)特異性t（MYC）和BRAFV600E突變。重要的是，與髂骨克隆形成對比，L4上的優(yōu)勢克隆是GEP70高風(fēng)險相關(guān)的，伴隨著超高風(fēng)險的TP53雙等位基因缺失和涉及染色體臂1p的不良事件。通過靶向測序（654×）確認(rèn)了L4處BRAF缺失突變。在這種情況下，基于單獨(dú)評估髂嵴標(biāo)本的診斷方法會錯誤地將該患者歸類為GEP70低風(fēng)險組，如果對BRAFV600E使用靶向治療方法，則將在GEP70高風(fēng)險癌癥部位失敗。為了解這一概念的臨床意義并闡明位點(diǎn)特異的高?？寺〉念A(yù)后影響，研究者額外分析了的263名患者。這些病例具有成對的髂骨取樣樣本和計算機(jī)斷層掃描（CT）輔助的局灶病灶抽吸物的GEP70風(fēng)險評分。該系列的中位隨訪時間為4.8年，13％（34名患者，僅局部病灶類風(fēng)險高的20名）具有不一致的GEP70評分。生存分析顯示GEP70高危的克隆的非均勻分布情況的結(jié)果很差，這與存在兩個位點(diǎn)部位的GEP70高風(fēng)險患者（28例）的結(jié)果相似（Cox模型，P=0.2，F(xiàn)ig.3b）。這一結(jié)果表明，高風(fēng)險亞克隆即使不是普遍分布也能驅(qū)動疾病預(yù)后惡化。局部病灶大小與腫瘤區(qū)域生長優(yōu)勢研究者探索是否可以使用其他疾病特征預(yù)測空間異質(zhì)性。多重檢驗(yàn)校正后的分析顯示，在新診斷的患者中，包括國際分期系統(tǒng)（ISS）25、基因組倍性、高風(fēng)險細(xì)胞遺傳學(xué)和髂骨部位的GEP70風(fēng)險狀態(tài)在內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)臨床和分子特征均未與空間異質(zhì)性有著顯著性相關(guān)（線性回歸和Wilcoxon檢驗(yàn)，P>0.05）。在較高的國際分期階段和在涉及1p缺失的髂骨部位，共有異質(zhì)突變的比例較低。當(dāng)將全身影像資料納入分析時，研究者發(fā)現(xiàn)活檢局部病灶的最大尺寸與未共有突變的比例之間存在高度顯著的正相關(guān)（Spearman相關(guān)性ρ=0.62，P<0.001）。利用局部病灶最大尺寸作為異質(zhì)性預(yù)測因子，并將1cm和2.5cm腫瘤直徑作為分組截斷值，得到三種分組，對應(yīng)著越來越高的非共有突變數(shù)量?？偨Y(jié)上述，既不是局部病灶的總數(shù)，也不是研究位點(diǎn)之間的解剖距離與空間異質(zhì)性相關(guān)。此外，以不同亞克隆成分（共有異質(zhì)型）為特征的空間異質(zhì)性不能通過任何基于圖像的參數(shù)來預(yù)測（p>0.05）。0.001）。利用局部病灶最大尺寸作為異質(zhì)性預(yù)測因子，并將1cm和2.5cm腫瘤直徑作為分組截斷值，得到三種分組，對應(yīng)著越來越高的非共有突變數(shù)量。總結(jié)上述，既不是局部病灶的總數(shù)，也不是研究位點(diǎn)之間的解剖距離與空間異質(zhì)性相關(guān)。此外，以不同亞克隆成分（共有異質(zhì)型）為特征的空間異質(zhì)性不能通過任何基于圖像的參數(shù)來預(yù)測（p>圖3疾病發(fā)展過程中的多區(qū)域進(jìn)化事件為了闡明單個局部病灶的基因組景觀輪廓是否可以代表同一患者的其他局部病灶，研究者研究了四個含有大局部病灶（>2.5cm）的患者不同克隆部位之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。為了說明“主要”事件和“分支”事件，研究者集中討論克隆畸變。這一分析的結(jié)果清楚地表明了多發(fā)性骨髓瘤進(jìn)化過程的復(fù)雜性（圖4）。在12號患者中，被分類為GEP70高風(fēng)險的四個局部病灶呈現(xiàn)出非常相似的基因組譜，共同出現(xiàn)了CDKN2C，擴(kuò)增（1q）和刪除缺失（17p13）的高風(fēng)險染色體雙等位基因缺失（圖4a）。在GEP70低風(fēng)險克隆中未發(fā)現(xiàn)這些事件。這個分析的結(jié)果表明這些局部病灶有一個共同的高風(fēng)險祖先。其他的樣本也同樣呈現(xiàn)出不一樣的進(jìn)化關(guān)系，涉及到的一些關(guān)鍵性基因可以在圖4中查看。圖4骨髓瘤的非中性進(jìn)化上面描述的腫瘤進(jìn)化模式強(qiáng)烈地表明了非中性演化。在此，引入一個區(qū)分克隆選擇與中性進(jìn)化的數(shù)學(xué)模型。該模型利用變異等位基因頻率（VAF）邊界的亞克隆突變來提供腫瘤生長動力學(xué)信息。研究者將這個模型應(yīng)用在來自于新診斷患者突變數(shù)據(jù)上，以確定多發(fā)性骨髓瘤主要進(jìn)化類型。在99個樣品中，有62個樣品由于少于12個突變處于指定的VAF邊界內(nèi)（補(bǔ)充數(shù)據(jù)5），因此沒有被當(dāng)作中性生長。其余37個樣本沒有呈現(xiàn)中性生長的VAF分布特征（R2≥0.98，在補(bǔ)充圖9中顯示了兩個例子）。進(jìn)一步的克隆性分析顯示，在25個異質(zhì)性突變的患者中，不同的克隆在不同位點(diǎn)占優(yōu)勢，進(jìn)一步表明多發(fā)性骨髓瘤是克隆選擇而不是中性進(jìn)化生長模式。討論該多區(qū)域取樣基因組分析是第一個描述多發(fā)性骨髓瘤空間異質(zhì)性的系統(tǒng)研究。到目前為止，多發(fā)性骨髓瘤被認(rèn)為是一種適用達(dá)爾文進(jìn)化理論，更優(yōu)克隆選擇性替代先前的不適合亞克隆，并進(jìn)一步擴(kuò)散的腫瘤。最近，在實(shí)體實(shí)體瘤領(lǐng)域中引入了替代進(jìn)化模型，為解釋空間異質(zhì)性提供了新的方法。癌癥生長的確可以是中性的，突變的分布由它們出現(xiàn)的時間點(diǎn)決定，而不是由它們內(nèi)在的適應(yīng)性優(yōu)勢決定。使用數(shù)學(xué)模型預(yù)測中性進(jìn)化動力學(xué)，三分之一的癌癥顯示了這種中性類型的進(jìn)化。然而，這項研究的結(jié)果使科學(xué)家將多發(fā)性骨髓瘤歸為憑借非中性克隆進(jìn)化在克隆群體內(nèi)形成競爭力，并且適應(yīng)微環(huán)境的惡性腫瘤類屬。支持非中性進(jìn)化的證據(jù)包括：（1）特定位點(diǎn)的驅(qū)動性突變是一種常見的現(xiàn)象，但這在中性進(jìn)化系統(tǒng)中是不常見的，畢竟突變的分布由其時間點(diǎn)決定，中性進(jìn)化系統(tǒng)中關(guān)鍵驅(qū)動突變通常是多點(diǎn)共有的事件；（2）沒有觀察到腫瘤遵循在中性進(jìn)化中才會出現(xiàn)的中性生長模式冪律分布；（3）異質(zhì)性突變常常具有較高的亞克隆百分比（CCF≥0.8），該現(xiàn)象支持不同位點(diǎn)富集特定克隆的模型；（4）非共有突變和拷貝數(shù)變異程度與局部病灶的大小呈現(xiàn)正相關(guān)性，這與非共有突變和異質(zhì)化拷貝數(shù)變異驅(qū)動病灶生長一致。圖5因此，克隆競爭是多局部病灶患者腫瘤空間異質(zhì)性增加的最可能的解釋。漿細(xì)胞生物學(xué)的一個重要特性就是長期生存漿細(xì)胞和新漿母細(xì)胞為了有限的骨髓空間存活生態(tài)位的競爭，競爭失敗一方將會凋亡。這種對骨髓空間微環(huán)境的依賴性通常也適用于惡性漿細(xì)胞，另外一點(diǎn)，漿細(xì)胞通常不能在體外存活。在不同骨髓空間已經(jīng)被高級克隆占據(jù)的情況下，額外的競爭性克隆的適應(yīng)水平需要更先進(jìn)才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移侵染和克隆替換。因此，在疾病的后期階段，當(dāng)幾乎所有的生態(tài)位被占據(jù)，區(qū)域限制性的進(jìn)化將會出現(xiàn)，而不是后來克隆清掃替換先前克隆，也就是說由于后來克隆無法做到擁有絕對優(yōu)勢清掃替換已有克隆，只好多種克隆在有限的生態(tài)位同時生存。這種現(xiàn)象通過在四個不同的地點(diǎn)對四個不同的顯性克隆的描述來突出。研究者認(rèn)為，與中性的“大爆炸”進(jìn)化模型類比，在成功入侵某一位點(diǎn)之后替換該腫瘤位點(diǎn)已有的優(yōu)勢克隆的困難可能僅僅是類似于區(qū)域性