DB37-T 4754.1-2024動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)　第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4754.1—20241Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part1:ClassicalswineAnimaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part1:Classicalswinefevervirulentstrainandvaccinestrain2024090320241003山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB37/T4754《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)》的第1部分。DB37/T4754已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。引 言基（Classicalswinefever，CSFV）20501熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)技術(shù)的操作，便于檢測(cè)技術(shù)在豬瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)技術(shù)的操作，便于檢測(cè)技術(shù)在豬瘟臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、檢驗(yàn)檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應(yīng)用。222RT-PCR3PCR動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒范圍本文件規(guī)定了豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)。本文件適用于豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒的鑒別檢測(cè)。（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。RT-PCR126bp335bpSYBRGreenDNATmTm注：SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。水：GB/T6682（DEPC）取1mLDEPC1000mL，24h，12115min，2℃～8（PBS）取Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mLpH7.4，1000mL，12115min，2℃～8（3%）。稱取3g100mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）。稱取4g100mL。商品化病毒核酸提取試劑盒。RT-PCR：DEPCDEPC，pH6.5～8.5PCR0.01g≥12000r/min6000r/min-70樣品采樣工具35min～10min，2min1602h采樣NY/T5411.5mL（）1/104EDTA1mLPBS1mL32mLPBS樣品的運(yùn)輸及保存2～824h2～82435樣品處理54DEPC10000r/min5min，54DEPC10000r/min5min，410000r/min5min0.5mL10000r/min5min0.5mL10000r/min5min0.5mL核酸抽提進(jìn)行豬瘟病毒檢測(cè)時(shí)，生物安全按照GB19489執(zhí)行，采用商品化試劑盒提取病毒核酸。熒光RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系的配制見(jiàn)附錄B。加樣在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和提取的試樣溶液2μL，1min測(cè)定SYBRGreenI425min；9510s；510207210.1/s979結(jié)果判定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.1.1豬瘟病毒疫苗弱毒CtTm81.5±0.5Ct值＜30.0Tm81.5℃±0.5熔解峰，參見(jiàn)附錄C（圖C.1）CtTm83.3±0.9Ct值＜30.0Tm83.3℃±0.9熔解峰，參見(jiàn)附錄C（圖C.2）陰陽(yáng)性結(jié)果的判定CtTm81.5±0.5CtTm81.5±0.530.0＜CtTm81.5±0.5CtTm83.3±0.9CtTm83.3±0.930.0＜CtTm83.3±0.9附錄A（資料性）引物引物名稱和序列見(jiàn)表A.1。表A.1引物名稱和序列引物名稱引物序列（5′—3′）豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT豬瘟病毒強(qiáng)毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT豬瘟病毒強(qiáng)毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物用DEPC水溶解并稀釋至100μmol/L10μmol/L保存供檢測(cè)使用。附錄B（資料性）熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制RT-PCRB.1表B.1RT-PCR試劑1個(gè)檢測(cè)反應(yīng)的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5ExTaqHS（5U/μL）0.5豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物1.0豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物1.0RNaseFreedH2O7.5試樣溶液2.0uL總體積25.0μLRT-PCRB.2表B.2豬瘟病毒強(qiáng)毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系試劑1個(gè)檢測(cè)反應(yīng)的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5ExTaqHS（5U/μL）0.5豬瘟病毒強(qiáng)毒上游引物1.0豬瘟病毒強(qiáng)毒下游引物1.0RNaseFreedH2O7.5試樣溶液2.0uL總體積25.0μL附錄C（資料性）豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強(qiáng)毒溶解曲線分析圖豬瘟病毒疫苗弱毒熔解曲線分析見(jiàn)圖C.1。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：1——豬瘟病毒疫苗弱毒；2——