基因組編輯技術(shù)專題

基因組編輯技術(shù)專題1整理課件自從證明DNA是遺傳物質(zhì)以后，人類就開始了通過改變DNA來改造生物體生理機理和功能的嘗試。1973年，斯坦利·N·科恩(StanleyN.Cohen)和赫伯特·W·博耶(HerbertW.Boyer)成功將蛙的DNA插入到細(xì)菌中。

20世紀(jì)70年代，基因泰克(Genetech)公司對大腸桿菌進(jìn)行基因改造，使其帶有一個人源基因(這個基因是人工合成的)，最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素。

1974年，，加利福尼亞州索克生物研究所(SalkInstituteforBiologicalStudies)的RudolfJaenisch通過將SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。2整理課件基因突變技術(shù)：物理誘變、化學(xué)誘變…轉(zhuǎn)基因技術(shù)：T-DNA插入RNA干擾技術(shù)：dsRNA、ArtificialmiRNA核外遺傳技術(shù)：質(zhì)粒、人工染色體同源重組技術(shù)：e.g.傳統(tǒng)的基因敲除小鼠無法控制突變位點不能精確控制外源基因插入位點對靶基因抑制不徹底、不特異難以穩(wěn)定的遺傳費時費力費錢，難以大量應(yīng)用并引起一系列生物倫理的問題…現(xiàn)狀3整理課件4整理課件基因組編輯技術(shù)基因組編輯技術(shù)（genomeediting）是一種可以在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。也稱為基因打靶（Genetargeting）。技術(shù)的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點改造基因組的目的。5整理課件歷史1993年前ZFN就已開始出現(xiàn)，迄今已發(fā)展了20多年才有今天的成就；2009年底出現(xiàn)的TALEN似乎一夜之間呈現(xiàn)出取代ZFN的架勢；2012年底CRISPR/Cas已顯現(xiàn)出取代TALEN的巨大潛力，在2013年成為現(xiàn)實。榮譽2011年：ZFN，

TALEN和Meganuclease—2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN—2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被認(rèn)為是諾貝爾獎級別的成果，華人科學(xué)家張峰已因此獲得生物醫(yī)學(xué)大獎。基因組編輯技術(shù)應(yīng)用基因組巡航導(dǎo)彈，分子剪刀，DNA外科醫(yī)生定點突變，定點修飾（包括得到轉(zhuǎn)基因），轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因治療（如遺傳?。?整理課件基因編輯的三大利器ZFN

(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）特異性DNA識別域非特異性核酸內(nèi)切酶+7整理課件ZFN原理ZFN=蛋白的DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個），每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基。8整理課件核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA

兩條ZFN之間具有被稱為“間隔區(qū)”的spacer結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的長度以5～6bp為宜，7bp也能正常工作，合理的“間隔區(qū)”設(shè)計才能保證ZFN二聚體擁有最佳的工作空間。9整理課件ZFN技術(shù)的缺陷DNA識別域雖然具有較強的特異性識別能力，但是其識別的序列長度比較有限。因為ZFN剪切的過程不完全依賴同源二聚體的形成，所以一旦形成異源二聚體，就很可能造成脫靶效應(yīng)；如果出現(xiàn)脫靶，可能導(dǎo)致DNA的錯配和序列改變，產(chǎn)生較強的細(xì)胞毒性。當(dāng)這些不良影響積累過多，超過細(xì)胞修復(fù)機制承受的范圍時，便會引起細(xì)胞的凋亡。另一方面，該手段在細(xì)胞內(nèi)部操作的精確程度不足，則可能會引起相關(guān)基因突變，引發(fā)癌癥等。ZFN作為基因治療的手段之一，如果在生物體內(nèi)使用，可能會引發(fā)免疫反應(yīng)。而現(xiàn)有的研究手段尚不能預(yù)測引入的ZNF蛋白是否會引起免疫系統(tǒng)的進(jìn)攻。到目前為止，ZFN技術(shù)只能用于體外操作（invitro），在對人體提取的細(xì)胞進(jìn)行處理之后，再導(dǎo)入回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。10整理課件TALENTALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術(shù)?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自植物細(xì)菌Xanthomonassp.(黃單胞菌)的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系,一個模塊單元識別一個堿基，簡單且特異性極好。通過組合各類模塊，可對任意核苷酸序列進(jìn)行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控。目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應(yīng)用。11整理課件TALEN原理典型的TALEN由一個包含核定位信號（NLS）的N端結(jié)構(gòu)域、一個包含可識別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域，以及一個具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。DNA識別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個左右），每個TAL蛋白識別并結(jié)合一個對應(yīng)的堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時切割雙鏈DNA12整理課件全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。

NG可以識別THD可以識別CNI可以識別ANN可以識別G或A通過這種特異性識別，將多個Tal蛋白組裝在一起，就可以構(gòu)成可以識別目的片段的Tale蛋白。TALEN原理13整理課件TALEN的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶FokI切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過DNA的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。FokI只有在形成二聚體的時候才有內(nèi)切酶活性。TALEN原理14整理課件構(gòu)建特異性的TALEN表達(dá)載體15整理課件TALEN介導(dǎo)的基因編輯TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)兩個融合蛋白，分別與靶位點特異結(jié)合，由于兩個TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個靶位點之間剪切DNA。形成DSB時，同源重組可將需要敲入的序列組合入基因組。16整理課件TALEN元件的優(yōu)化17整理課件TALEN的技術(shù)特點任意敲除，無基因序列、細(xì)胞、物種限制，永久失活成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達(dá)95%以上打靶效率高，可完全替代RNAi技術(shù)脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應(yīng)技術(shù)簡單，只需按照常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒方法構(gòu)建Talen質(zhì)粒18整理課件19整理課件Fightinginvasion.Whenviruses(green)attackbacteria,thebacteriarespondwithDNA-targetingdefensesthatbiologistshavelearnedtoexploitforgeneticengineering.20整理課件Invasion.Streptococcusthermophilus(嗜熱鏈球菌)suchasthisonemayacquirekeydefensivesequencefrominfectiousbacteriophage,attachedattop.LactoseLacticacid發(fā)現(xiàn)21整理課件CRISPR-Cas主要由兩部分組成：1CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR（成簇、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列）-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然存在免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識別的一種獲得性免疫機制。識別切割22整理課件埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶EmmanuelleCharpentier珍妮弗·杜德娜JenniferDoudnaBreakthroughPrizeinLifeSciences23整理課件1CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)免疫過程24整理課件1CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對外源DNA特異性免疫,而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，細(xì)菌進(jìn)化了CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。25整理課件CRISPR/Cas系統(tǒng)分類：根據(jù)CRISPR—Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白的種類和同源性，可將CRISPR—Cas系統(tǒng)區(qū)分成3種類型：TYPEITYPEIITYPEIII1CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)26整理課件2Type

II

CRISPR系統(tǒng)—Cas9隨著越來越多的不同菌中的CRISPR系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，研究者們根據(jù)他們降解外源的遺傳物質(zhì)的方法，將他們分為了三類。

Type

I

and

Type

III.

這兩套系統(tǒng)由于參與的蛋白眾多，需要幾個復(fù)合物共同作用才能發(fā)揮作用，使得它不宜操作和改造。27整理課件PAM:proto-spaceradjacentmotifs(保守的間隔相鄰基序)crRNA:CRISPRRNAtracrRNA:trans-activatingCRISPRRNA3.人工改造

Type

II

CRISPR系統(tǒng)中的Cas9是個核酸酶，這個核酸酶結(jié)合兩個RNA(crRNA,

tracrRNA)就可以切割雙鏈DNA.

28整理課件3.人工改造

他們進(jìn)一步闡明了RNA和目標(biāo)DNA配對的原則，同時將crRNA-tracrRNA連接成了chimera

RNA，這樣只需要Cas9蛋白和一條定制的RNA就可以編輯特性的DNA。2012年Jennifer

A.

Doudna和Emmanuelle

Charpentier的這篇Science發(fā)現(xiàn)了一個比較簡單的CRISPR（TypeII）系統(tǒng)的機理。這一系統(tǒng)就簡單多了，一個巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA,

就可以完成識別和切割靶向的DNA。29整理課件3.人工改造他們進(jìn)一步分析了Cas9作為核酸酶的活性位點：兩個核酸酶活性域會分別切割靶DNA的兩條鏈，造成雙鏈斷裂。30整理課件Nucl.AcidsRes.-2013-DiCarlo-nar_gkt135Cas9gRNA20nt4.工作原理Cas9蛋白與向?qū)NA結(jié)合、組裝的動作是這套位點特異性的基因組修飾過程里的限速步驟。31整理課件真核系統(tǒng)的應(yīng)用1）

優(yōu)化密碼子，讓Cas9蛋白可以在哺乳動物系統(tǒng)中很好的表達(dá)。

2）

加了核定位序列(NLS)，這樣可以把Cas9送到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因組編輯。

3）

當(dāng)然，同時需要表達(dá)一個guide

RNA，把Cas9定位到靶DNA處。

4）

CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求為PAM序列（5’-NGG-3’），即靶序列后面必須為NGG才能被向?qū)NA識別，在人類基因組中平均每8個堿基就可以出現(xiàn)一個NGG。利用這個技術(shù)，就可以很方便高效廉價地在細(xì)胞上做基因編輯：包括敲除、修改、插入。4.工作原理32整理課件4.工作原理-切割后的處理NHEJ

:Non-homologousendjoining非同源性末端接合HDR:Homology-directrepair同源直接修復(fù)33整理課件進(jìn)一步用Nickase增加編輯特異性因為Cas9介導(dǎo)的靶向主要依賴于guide

RNA和目標(biāo)DNA20左右的堿基的配對，大家開始重視脫靶效應(yīng)（off-target）。ZhangFengMIT&PKU很快，MIT的張峰在Cell上發(fā)表了Double

Nick的方法。Cas9會在目標(biāo)DNA上切兩刀，如果把其中一個核酸酶活性位點突變掉，它就變成了一個切口酶。用兩對這樣的sgRNA把這種切口酶帶到基因組上的特異位點，這樣就大大提高了靶向的特異性。4.工作原理34整理課件4.工作原理35整理課件CRISPR/Cas9的特點和優(yōu)勢操作簡單，靶向精確性更高。sgRNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配，Cas9才會對DNA進(jìn)行剪切。編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZENs更簡單方便，用于CRISPR的sgRNA識別序列僅需20個核苷酸。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由RNA調(diào)控的對DNA的修飾，其基因修飾可遺傳。基因修飾率高，基因調(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。無物種限制。實驗周期短，最快僅需2個月，節(jié)省大量時間和成本。3636整理課件CRISPR技術(shù)存在問題和解決方案目前不清楚向?qū)NA分子的特異性作用機脫靶效應(yīng)（off-targeteffect）。Joung的工作顯示，與向?qū)NA序列類似的非靶點DNA片段也能夠被切斷、激活或者失活，即存在明顯的脫靶效應(yīng)。新方法解決CRISPR-Cas系統(tǒng)難點可減弱甚至消除消除脫靶效應(yīng)

利用計算機模型。調(diào)整導(dǎo)向RNA序列的量計算高目標(biāo)效應(yīng)和低脫靶效應(yīng)間最優(yōu)平衡點最新研究表明，增長RNA鏈可以提高RNA的結(jié)合效率。所以張峰教授對RNA片段結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，包含一段穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，能更有效的引導(dǎo)Cas9發(fā)揮作用37整理課件1）基因敲除：如果想使某個基因的功能喪失，可以在這個基因上產(chǎn)生DSB，NHEJ修復(fù)的過程中往往會產(chǎn)生DNA的插入或刪除（indel），造成移碼突變，從而實現(xiàn)基因敲除。2）特異突變引入：如果想把某個特異的突變引入到基因組上，需要通過同源重組來實現(xiàn)，這時候要提供一個含有特異突變同源模版。正常情況下同源重組效率非常低，而在這個位點產(chǎn)生DSB會極大的提高重組效率，從而實現(xiàn)特異突變的引入。3）定點轉(zhuǎn)基因：與特異突變引入的原理一樣，在同源模版中間加入一個轉(zhuǎn)基因，這個轉(zhuǎn)基因在DSB修復(fù)過程中會被拷貝到基因組中，從而實現(xiàn)定點轉(zhuǎn)基因。通過定點轉(zhuǎn)基因的方法可以把基因插入到人的基因組AAVS1位點，這個位點是一個開放位點，支持轉(zhuǎn)基因長期穩(wěn)定的表達(dá)，破壞這個位點對細(xì)胞沒有不良影響，因此被廣泛利用。應(yīng)用（理論上）38整理課件應(yīng)用（理論上）轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活特異性的干擾表觀遺傳學(xué)調(diào)控在活細(xì)胞中成像DNA位點RNA的操作人體基因治療生態(tài)工程分子生物學(xué)工具開發(fā)構(gòu)建突變體庫遺傳篩選基因組編輯技術(shù)改良39整理課件ElizabethPennisi.

TheCRISPRCraze.Science23August2013;DOI:

10.1126/science.341.6148.833基因組編輯（基于DSB）NHEJHDR基因干擾基因激活原理設(shè)想一下：一個人（Cas9）拿著一把鑰匙（gRNA）去開一棟大樓中的某個房間。40整理課件應(yīng)用—水稻Indel(33%)NatureProtocols

doi:10.1038/nprot.2014.15741整理課件測序分析轉(zhuǎn)基因株系3個靶位點突變（體細(xì)胞突變形成嵌合體）：應(yīng)用—擬南芥42整理課件SchematicDiagramofAssemblingCas9/sgRNAConstructandSelectingTargetSitesinPDS1AgrobacteriumWeconstructplasmids

thatcarrying4/3/2/1sgRNAstargetingPtPDS1gene,respectively.應(yīng)用—楊樹43整理課件應(yīng)用—楊樹44整理課件TheBigFragmentChangesattheDesignedCas9TargetingSitesinPtPDSGeneAbigfragmentinversionmutantofPtPDS1AbigfragmentdeletionmutantofPtPDS1應(yīng)用—楊樹45整理課件應(yīng)用—果蠅A.Bassett,J.-L.Liu/Methods69(2014)128–136HRMA:High-resolutionmeltinganalysis(高分辨率熔解曲線分析)46整理課件A.Ba