第二十一章免疫學(xué)方法技術(shù)

第21章免疫學(xué)方法技術(shù)第一節(jié)

基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測(cè)方法抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學(xué)反應(yīng)（serologicalreaction)用于：抗原（微生物、細(xì)胞、激素、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物等）、抗體的檢測(cè)。特異性抗原抗體反應(yīng)的可見性適當(dāng)?shù)谋壤蜐舛瓤赡嫘钥乖贵w反應(yīng)的特點(diǎn)應(yīng)用1、利用已知抗原檢測(cè)未知抗體（1）檢測(cè)病原微生物的相應(yīng)抗體以輔助診斷疾?。簜?、流行性乙型腦炎、AIDS病等。（2）檢測(cè)自身抗體—診斷自身免疫?。篠LE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。2、利用已知抗體檢測(cè)未知抗原（1）鑒定病原菌：診斷疾?。?）檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原：檢測(cè)甲胎蛋白以診斷肝癌（3）檢測(cè)血型抗原、HLA抗原：鑒定血型，親子鑒定（4）檢測(cè)藥物半抗原：確認(rèn)運(yùn)動(dòng)員是否服用興奮劑沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參與反應(yīng)中和反應(yīng)2341免疫標(biāo)記凝集反應(yīng)2435Ag-Ab

反應(yīng)的基本類型一、凝集反應(yīng)（agglutinationreaction）概念：細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原或包被有抗原的顆粒狀物質(zhì)（如聚苯乙烯乳膠等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團(tuán)，稱為凝集反應(yīng)。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。細(xì)菌的鑒定和血型的檢查檢測(cè)病原體可溶性抗原，病原體感染后產(chǎn)生的抗體二、沉淀反應(yīng)（precipitation）概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、細(xì)胞裂解物、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，出現(xiàn)不透明的沉淀物。在液體中進(jìn)行出現(xiàn)絮狀沉淀，在半固體瓊脂凝膠上進(jìn)行，形成白色的沉淀。1．單向免疫擴(kuò)散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴(kuò)散(doubleimmunodiffusion)3．免疫電泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比濁(immunonephelometry)

1、單向免疫擴(kuò)散（singleimmunodiffusion）：可溶性抗原在含相應(yīng)抗體的瓊脂凝膠中進(jìn)行的擴(kuò)散，為一種半定量試驗(yàn)。環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)2、雙向免疫擴(kuò)散（doule

immunodiffusion）：抗原與抗體在瓊脂板中相互擴(kuò)散而形成一定類型的沉淀線的方法。常用于抗原或抗體的定性檢測(cè)、組成和兩種抗原相關(guān)性分析。3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。

1）簡(jiǎn)易免疫電泳先將抗原樣品在瓊脂中進(jìn)行電泳分離，可將蛋白質(zhì)抗原分子分成不同的區(qū)帶，然后將抗血清加入瓊脂板橫槽中，使二者進(jìn)行雙向擴(kuò)散，當(dāng)比例合適時(shí)即形成特異性的沉淀線，2）對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)3）火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis)，抗原在電場(chǎng)下通過(guò)含有一定量抗體的瓊脂凝膠，并于抗體發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀帶。可定量分析。4、免疫比濁在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時(shí)間形成免疫復(fù)合物，液體混濁。用濁度計(jì)測(cè)量反應(yīng)體系的濁度，可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依據(jù)濁度推算樣品中抗原含量。三、補(bǔ)體參與的反應(yīng)溶菌反應(yīng)細(xì)菌與相應(yīng)Ab結(jié)合，可激活補(bǔ)體，使細(xì)菌溶解。主要發(fā)生于霍亂弧菌等G+菌，可用于細(xì)菌鑒定。溶血反應(yīng)紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合，通過(guò)激活補(bǔ)體使紅細(xì)胞溶解，可作為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)的指示系統(tǒng)。補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)是一種在補(bǔ)體參與的條件下，以綿羊紅細(xì)胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來(lái)測(cè)定有無(wú)相應(yīng)抗原或抗體的血清學(xué)試驗(yàn)。第二節(jié)免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）概念：用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體（或抗原）進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)。標(biāo)記物質(zhì)未改變抗原抗體的免疫學(xué)特性，同時(shí)標(biāo)記物極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對(duì)微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測(cè)。免疫標(biāo)記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)。熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、羅丹明（紅色熒光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶免疫熒光檢測(cè)法（IFA）放射免疫檢測(cè)法（RIA）酶免疫檢測(cè)法（EIA）1．抗體制備。多克隆抗體單克隆抗體，2．標(biāo)記物與標(biāo)記方法。放射性同位素、酶、熒光分子、化學(xué)和生物發(fā)光系統(tǒng)。免疫分析基本環(huán)節(jié)3．分析方式設(shè)計(jì)：

非競(jìng)爭(zhēng)方式、競(jìng)爭(zhēng)方式；

直接法、間接法；

標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體；

均相、非均相

4.信號(hào)檢測(cè)。

與相應(yīng)的標(biāo)記物對(duì)應(yīng)。主要為分光光度法、

熒光光度法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法。

一、免疫熒光法

(immunofluorescence,IF)概念：熒光素標(biāo)記的抗體（抗原）與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（抗體）結(jié)合，借助于熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀對(duì)抗原（抗體）進(jìn)行鑒定或定位。（1）直接熒光法：熒光素直接標(biāo)記抗體，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，缺點(diǎn)是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。該法優(yōu)點(diǎn)是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標(biāo)記的二抗即可用于多種抗原的檢測(cè),但非特異性反應(yīng)亦增強(qiáng)。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示MousekidneysectionLaminin-green-fluorescentQdot?565IgG

CD31-red-fluorescentQdot?655IgG

Nuclei-blue-fluorescentHoechst33342ControlTSLPTSLP-AlexaFluor?488

Nuclei-propidiumiodide

HASMC

流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)概念：FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細(xì)胞儀，對(duì)單個(gè)細(xì)胞的表面標(biāo)志（抗原或受體）進(jìn)行快速、精確的分析和自動(dòng)檢測(cè)，并將不同類型的細(xì)胞分選收集。FCM還可對(duì)同一細(xì)胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞體積等）進(jìn)行多信息分析，為當(dāng)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項(xiàng)新技術(shù)。流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分析原理待測(cè)細(xì)胞被制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動(dòng)下進(jìn)入流動(dòng)室。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱，進(jìn)入流動(dòng)室。被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照時(shí)后發(fā)出熒光，被熒光光電倍增管接收，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的定量分析。再通過(guò)流束形成含有細(xì)胞的帶電液滴而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的分選。流式細(xì)胞儀工作原理二、酶免疫測(cè)定

(enzymeimmunoassay,EIA)概念：是用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。常用的酶為：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酯酶（AP）酶底物顯色反應(yīng)測(cè)定波長(zhǎng)辣根過(guò)氧化物酶鄰苯二胺（OPD）

3、3‘二氨基聯(lián)苯胺（DAB）

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定可溶性抗原或抗體（2）免疫細(xì)胞或組織化學(xué)測(cè)定組織中或細(xì)胞表面的抗原1.免疫細(xì)胞或免疫組化技術(shù)概念：應(yīng)用酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，對(duì)組織或細(xì)胞表面抗原進(jìn)行定性、定量、定位。ICCIHC2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)

基本原理：是將過(guò)量抗體（抗原）包被于載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）上，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測(cè)物的存在與含量的檢測(cè)技術(shù)。是酶免疫測(cè)定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測(cè)定可溶性抗原或抗體。ELISA試劑盒1.雙抗體夾心法用于檢測(cè)特異性抗原。方法：將已知抗體吸附于固相載體．加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。該試驗(yàn)所用的包被抗體與酶標(biāo)抗體應(yīng)分別針對(duì)不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無(wú)交叉反應(yīng)。2.間接法用于檢測(cè)特異性抗體。方法：將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標(biāo)本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體(酶標(biāo)抗抗體)和底物進(jìn)行測(cè)定?？乖豢苟股锼豀RP親合素＋3.競(jìng)爭(zhēng)法用于抗原和半抗原（抗原決定簇少）的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。方法：以測(cè)定抗原為例．將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測(cè)抗原和一定量的酶標(biāo)已知抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過(guò)洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。

ELISA反應(yīng)過(guò)程動(dòng)畫演示A.用已知抗原檢測(cè)分泌性特異性抗體的B細(xì)胞B.用抗細(xì)胞因子抗體檢測(cè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子

4.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)ELlSA方法的技術(shù)要點(diǎn)I與固相載體結(jié)合的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過(guò)程稱為包被(coating)，由于載體不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品為載體一般多采用物理吸附法。除載體的理化性質(zhì)外，受緩沖液的離子強(qiáng)度、pH值、包被時(shí)的溫度和時(shí)間等多種因素的影響。用抗原或抗體包被后。固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點(diǎn)，產(chǎn)生非特異吸附，導(dǎo)致本底偏高。為此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的PH9.6碳酸鹽緩沖液注滿凹孔，37℃作用1h，可以消除此種干擾。這一過(guò)程稱為封閉(blocking)。固相載體和免疫吸附劑的制備

ELlSA方法的技術(shù)要點(diǎn)II抗原和抗體用于制備酶標(biāo)記物和包被固相載體的抗原要求純度高，抗原性完整；抗體需特異、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，并具有較高的比活性。如將抗體IgG用木瓜蛋白酶水解為Fab片段，再與酶連接，可以減少非特異性吸附，檢測(cè)效果更佳。McAb的應(yīng)用，進(jìn)一步提高ELISA法的特異性和靈敏度。使用針對(duì)抗原分子中不同決定簇的兩種McAb分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體用于雙位點(diǎn)夾心法，簡(jiǎn)化了操作程序。通常采用特異性較高的McAb作為固相包被抗體，與酶標(biāo)記的多克隆抗體相結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果更為滿意。在ELISA法中，用于標(biāo)記抗體或抗原的酶與免疫酶組織化學(xué)技術(shù)基本上相同。但所用底物被酶裂解后，應(yīng)能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(jì)(酶標(biāo)儀)測(cè)量光密度值，籍以定量測(cè)定樣品中待撿抗原或抗體的含量。ELlSA方法的技術(shù)要點(diǎn)III常用的酶及其底物

辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)

OPD,TMB堿性磷酸酶 (AP)

PNP半乳糖苷酶 (Gal)

NPG葡萄糖氧化酶 (GOP) PAP三、放射免疫測(cè)定法

(Radioimmunoassay,RIA)概念：是用放射性核素標(biāo)記抗原進(jìn)行的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測(cè)的敏感性達(dá)pg水平。常用于標(biāo)記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長(zhǎng)激素、藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。結(jié)合相游離相基本原理：RIA是標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原對(duì)有限量抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。

Ag*AbAg

標(biāo)記抗原特異性抗體待測(cè)抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab

和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測(cè)定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性示意圖RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線

7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）四、化學(xué)發(fā)光免疫分析概念：將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標(biāo)記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過(guò)氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過(guò)自動(dòng)發(fā)光分析儀測(cè)定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測(cè)血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。靈敏，無(wú)污染，可用于替代放射免疫。五、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)(immunogoldlabelingtechnique)

概念：是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫標(biāo)記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。電鏡：高電子密度試紙：膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化。膠體金是氯金酸(HAuCl4)的水溶膠顆粒，具有高電子密度，在電鏡中顆粒致密，易于辨認(rèn)，定位比酶反應(yīng)物精確。膠體金標(biāo)記舉例：膠體金試紙檢測(cè)尿HCG早孕尿試紙條：兩條杠，檢測(cè)迅速，靈敏度高1）干燥試紙條膠體金免疫快速檢測(cè)HCG原理2）加樣1.雙抗體夾心法-大分子抗原3）反應(yīng)和遷徙4）陽(yáng)性結(jié)果：兩條紅線5）陰性結(jié)果：一條紅線膠體金免疫試紙構(gòu)造六、免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)將含有目標(biāo)蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。Westernblotmethod包括5個(gè)步驟：1)固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。2)封閉：保持膜上沒有特殊抗體結(jié)合的場(chǎng)所，使場(chǎng)所處于飽和狀態(tài)，用以保護(hù)特異性抗體結(jié)合到膜上,并與蛋白質(zhì)反應(yīng)。3)初級(jí)抗體(第一抗體)是特異性的。4)第二抗體或配體試劑對(duì)于初級(jí)抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。5)適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。第三節(jié)

檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其功能的體外試驗(yàn)單個(gè)核細(xì)胞的分離

淋巴細(xì)胞亞群的分離T細(xì)胞功能檢測(cè)B細(xì)胞功能檢測(cè)種類免疫細(xì)胞及其亞類分離、鑒定和檢測(cè)淋巴細(xì)胞功能測(cè)定

T細(xì)胞的鑒定和檢測(cè)B細(xì)胞的鑒定和檢測(cè)一、免疫細(xì)胞及亞類分離、鑒定和檢測(cè)（一）外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離葡聚糖-泛影葡胺（又稱淋巴細(xì)胞分離液）：密度梯度離心法淋巴細(xì)胞分離液血小板淋巴細(xì)胞分離液淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞紅細(xì)胞和粒細(xì)胞1.0301.0751.075-1.0901.090-1.092各細(xì)胞與分離液的密度進(jìn)一步純化淋巴細(xì)胞，鋪于培養(yǎng)皿上，由于單核細(xì)胞易與玻璃黏附而滯留于平皿表面，未吸附的細(xì)胞即主要是淋巴細(xì)胞。（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離尼龍棉分離法E花結(jié)分離法洗淘法流式細(xì)胞術(shù)混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過(guò)尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，多數(shù)T細(xì)胞則通過(guò)尼龍毛柱人T細(xì)胞與SRBC結(jié)合形成E花結(jié)，經(jīng)密度梯度離心，花結(jié)形成細(xì)胞沉于管底；用低滲裂解花結(jié)中的SRBC即獲得T細(xì)胞。將已知抗特定標(biāo)志的抗體包被培養(yǎng)板，加入淋巴細(xì)胞懸液，相應(yīng)的細(xì)胞即結(jié)合于培養(yǎng)板表面，與懸液中的其他細(xì)胞分離。借助熒光活化細(xì)胞分類儀對(duì)細(xì)胞快速鑒定和分類、并進(jìn)行多參數(shù)定量測(cè)定和綜合分析的技術(shù)。磁分離技術(shù)將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，與表達(dá)相應(yīng)膜抗原的細(xì)胞結(jié)合，應(yīng)用強(qiáng)磁場(chǎng)分離所吸附的細(xì)胞，從而對(duì)特定的細(xì)胞進(jìn)行分選1、E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)（三）T細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)可用于T細(xì)胞的鑒定和檢測(cè)。綿羊紅細(xì)胞+人外周血淋巴細(xì)胞

4℃1~2h花環(huán)樣細(xì)胞集團(tuán)正常人外周血中E玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的60~80%。T細(xì)胞CD2/E受體SRBC/綿羊紅細(xì)胞（三）T細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)2、T細(xì)胞單克隆抗體對(duì)T細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)所用的Ab主要有：CD3McAb、CD4McAb和CD8McAb。方法：免疫熒光間接法。外周血淋巴細(xì)胞+分別用小鼠抗人CD3、CD4、CD8McAb（第一Ab）+熒光素標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體（第二Ab）→熒光顯微鏡觀察。小鼠抗人McAb熒光標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體（三）T細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)2、T細(xì)胞單克隆抗體對(duì)T細(xì)胞及其亞群的鑒定和檢測(cè)結(jié)果：（1）被CD3McAb著染熒光的細(xì)胞是總T細(xì)胞。包括：TH、TH1、TH2、TC、TS細(xì)胞。（2）被CD4McAb著染熒光的細(xì)胞是TH、TH1、TH2

（3）被CD8McAb著染熒光的細(xì)胞是TC、TS細(xì)胞。計(jì)數(shù)：

100～200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算出染陽(yáng)性細(xì)胞百分率：

CD3T細(xì)胞占65～80%。CD4T細(xì)胞占50~60%。

CD8T細(xì)胞占20~30%，

CD4T細(xì)胞與CD8T細(xì)胞比值約2：1。

SmIgM/D是B細(xì)胞表面特有的標(biāo)志。通過(guò)對(duì)該種標(biāo)志的檢測(cè)，可對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。方法：免疫熒光直接法。熒光素標(biāo)記的兔抗人IgM/D抗體+外周血淋巴細(xì)胞→直接免疫熒光染色。著染熒光的細(xì)胞B細(xì)胞。占淋巴細(xì)胞總數(shù)的8~12%。（四）B細(xì)胞鑒定和檢測(cè)兔抗人IgM/D抗體二、淋巴細(xì)胞功能測(cè)定1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)2、細(xì)胞毒性試驗(yàn)（LMC-T）T細(xì)胞功能檢測(cè)1、溶血空斑試驗(yàn)2、定量溶血分光光度測(cè)定法B細(xì)胞功能檢測(cè)1、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)原理：T細(xì)胞特異性Ag或有絲分裂原淋巴母細(xì)胞（體積更大、代謝旺盛）根據(jù)其轉(zhuǎn)化程度和轉(zhuǎn)化率，測(cè)定機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)（1）非特異性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（2）特異性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（一）T細(xì)胞功能檢測(cè)

T細(xì)胞

植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）淋巴母細(xì)胞。

（有絲分裂原）正常人T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率約為70%。（1）非特異性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)