第21章 高效液相色譜課件

第21章高效液相色譜

高效液相色譜法第21章高效液相色譜概述流動相是液體的色譜法稱為液相色譜(liquidchromatography,LC)液相色譜可分為平板色譜和柱色譜。前者如紙色譜和薄層色譜，后者如離子交換色譜等。現(xiàn)代高效液相色譜不同于傳統(tǒng)液相色譜主要采用了高效色譜柱與高壓輸液泵。第21章高效液相色譜高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1。高效液相色譜配備了高效分離柱，比經(jīng)典層析柱分離效率高。配有高靈敏度的檢測器。第21章高效液相色譜氣相色譜法與液相色譜法比較液相色譜法不受試樣揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，非常適合分離生物大分子，離子型化合物、不穩(wěn)定天然產(chǎn)物以及各種高分子化合物等。高效液相色譜法流動相可選用不同極性的液體，流動相對組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對組分作用的劇烈競爭，對分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。第21章高效液相色譜高效液相色譜法包括四種基本類型：分配色譜吸附色譜（液固色譜）離子交換色譜尺寸排斥色譜（凝膠色譜）第21章高效液相色譜第21章高效液相色譜21-1液相色譜的柱效一、液相色譜的速率理論速率理論是在分析氣相色譜分離原理后得出的速率方程，這個方程作適當(dāng)修改后也適用于液相色譜。與氣相色譜不同的是：由于液態(tài)流動相密度比氣態(tài)流動相高4~5數(shù)量級，因此液相色譜分子擴(kuò)散項(xiàng)可忽略不計。流動傳質(zhì)阻力項(xiàng)與氣相色譜有較大不同，見圖21-2、21-3第21章高效液相色譜第21章高效液相色譜在液相色譜中，可采用減小填料的孔穴深度、粒徑、采用低粘度及流低速流動相、適當(dāng)提高柱溫等方式操作提高柱效。第21章高效液相色譜二、液相色譜的柱外展寬以前對色譜峰展寬因素的討論只限于柱分離，液相色譜的柱外因素對譜峰寬度的影響也很大，進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管件、檢測器等，這是由于流動相在管壁鄰近區(qū)的流速明顯低于管中心區(qū)，導(dǎo)致柱外展寬。氣相色譜譜峰展寬的主要因素是縱向擴(kuò)散，而液相色譜則較大程度上受到柱外展寬的影響。第21章高效液相色譜21-2高效液相色譜儀高效液相色譜儀一般分為四個部分高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)。圖21-5除上述四個系統(tǒng)外，高效液相色譜儀還可能配備其它一些附屬部件，如梯度洗脫、自動進(jìn)樣、數(shù)據(jù)處理裝置等。一、高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜分離柱所用固定相顆粒極細(xì)，對流動相阻力很大，靠重力作用是不可能使流動相通過分離柱，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。高壓輸液系統(tǒng)由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成。核心部件是高壓輸液泵第21章高效液相色譜第21章高效液相色譜第21章高效液相色譜一、高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液泵的性能要求：高壓輸液泵應(yīng)具備密封性好，輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。此外，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好。高壓輸液泵按其操作原理可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動相粘度和柱滲透無關(guān)。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化。如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。第21章高效液相色譜機(jī)械往復(fù)色譜輸液泵第21章高效液相色譜二、進(jìn)樣系統(tǒng)因高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外擴(kuò)寬（又稱柱外效應(yīng)）對色譜分離影響很大。柱外展寬主要發(fā)生在進(jìn)樣系統(tǒng)與連接管件及檢測器中，其中進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此設(shè)計一個好的進(jìn)樣系統(tǒng)至關(guān)重要。常用的進(jìn)樣方式有三種：直接注射式進(jìn)樣、停留進(jìn)樣、高壓六通閥進(jìn)樣。第21章高效液相色譜第21章高效液相色譜三、色譜柱在高壓液相色譜中一般采用優(yōu)質(zhì)不銹鋼管制備，一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm；凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm；制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般采用勻漿法填充法裝柱，先將填料調(diào)成懸浮的勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。目前這種裝柱法可達(dá)到每米柱效8萬塔板數(shù)。

第21章高效液相色譜四、檢測系統(tǒng)在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器：它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器：它對試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，介電常數(shù)檢測器等。表21-1列出了常用檢測器及特性第21章高效液相色譜第21章高效液相色譜五、附屬系統(tǒng)

它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。第21章高效液相色譜21-3分配色譜在液-液分配色譜是四種液相色譜方法中最為廣泛的一種,流動相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性和非極性，水溶性和油溶性，離子型和非離子型化合物。分離原理與液-液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。第21章高效液相色譜分配色譜分液液色譜與分配色譜兩類。液液色譜的固定相是通過物理吸附的方法將固定液涂在載體表面，鍵合相色譜的固定相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體上。第21章高效液相色譜一、化學(xué)鍵合固定相鍵合固定相一般采用硅膠為基體，利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分子間成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分兩類（1）疏水基團(tuán)：如不同鏈長的烷烴（C8和C18。）和苯基等（2）極性基團(tuán)如氨丙基（—C3H6NH2），氰乙基（—C2H4CN）、二醇與氨基等。第21章高效液相色譜正相分配色譜和反相分配色譜在液液色譜中，為了減少固定液的流失，選擇流動相盡可能與固定相極性差別越顯著越好。。根據(jù)所使用的流動相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。如果采用流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。第21章高效液相色譜二、固定相與流動相色選擇色譜柱類型的選擇固定相的極性與分析物的極性粗略匹配，用極性明顯不同的流動相洗脫（能成功分離）。流動相的極性與分析物的極性粗略匹配，用極性明顯不同的固定相（不能成功分離）。固定相的極性與分析物的極性極為匹配，以流動極性的差異洗脫分析物（保留時間太長）。