免疫學(xué)檢驗技術(shù)-免疫原和抗血清的制備

知識目標1.掌握：免疫原和佐劑的概念（重點）。2.熟悉：抗血清制備時免疫動物的選擇和免疫方案的制定

?？寡逯苽涞牧鞒蹋y點）。3.了解：蛋白質(zhì)的分離和純化方法

；佐劑的應(yīng)用。能力目標1.熟練掌握免疫原的制備方法。2.學(xué)會抗血清的制備方法。素質(zhì)目標細心、耐心、免疫學(xué)基本思維教學(xué)目標免疫原和佐劑的概念。抗血清制備時免疫動物的選擇和免疫方案的制定

。抗血清制備的流程。蛋白質(zhì)的分離和純化方法

。佐劑的應(yīng)用。本章要點目錄免疫原的制備一免疫血清的制備二抗原和抗體是免疫學(xué)檢測中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測。前言第一節(jié)免疫原的制備

免疫原（immunogen）就是抗原，是指能夠刺激機體產(chǎn)生抗體并能與之發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。眾多的抗原物質(zhì)中絕少是單一組分的，所以必須從復(fù)雜的物質(zhì)中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。一、細胞性免疫原的制備1.綿羊紅細胞抗原制備采集新鮮綿羊紅細胞注入無菌并帶有玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，充分搖動15分鐘后除去纖維蛋白，再以無菌生理鹽水洗滌3次，最后配成1×106/ml濃度的細胞懸液，即可應(yīng)用。

2.細菌抗原的制備細菌抗原有菌體抗原和鞭毛抗原等，多選用典型菌株的液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。鞭毛抗原需用有動力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而菌體抗原則需要在100℃加溫2～2.5小時后應(yīng)用。

蛋白質(zhì)、酶、核酸、細菌毒素等皆為可溶性抗原，這些物質(zhì)大多來源于人和動物的組織和細胞，要想獲得此類抗原，通常要先破碎組織和細胞，再進一步提取和純化。

二、可溶性抗原的制備及鑒定1.組織勻漿的制備

高速搗碎法研磨法（一）組織和細胞中可溶性抗原的粗提

2.細胞破碎的方法⑴反復(fù)凍融法⑵超聲破碎法⑶溶菌酶處理法⑷自溶法⑸表面活性劑處理法1.超速離心法2.選擇性沉淀法3.凝膠過濾和離子交換層析4.親和層析5.電泳

（二）可溶性抗原的提純

1、超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達到彼此分離的目的。特點：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。2、選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。常用：鹽析沉淀法用硫酸銨等中性鹽中和蛋白質(zhì)表面的電荷及破壞水化膜，使蛋白質(zhì)沉淀。3、凝膠過濾法凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)4、離子交換層析法原理：帶離子基團的纖維素或凝膠可吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)因等電點不同所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。梯度洗脫時逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。5、親和層析法優(yōu)點：提取純度高、抗原抗體不失活性。

純化抗原的鑒定內(nèi)容包括含量、分子量、純度和免疫活性的鑒定等。鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫電泳法、雙向瓊脂擴散試驗等。

（三）純化抗原的鑒定

用化學(xué)合成法或基因重組法制備的抗原，稱之為人工抗原，包括人工結(jié)合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。三、人工免疫原制備

半抗原不能直接做為免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性。這種經(jīng)過人工修飾的半抗原稱之為人工合成抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。

（一）人工合成抗原制備

1.常用的載體⑴蛋白質(zhì)類⑵多肽聚合物⑶大分子聚合物

2.半抗原與載體的連接半抗原+載體（蛋白、合成載體）=完全抗原物理法或化學(xué)法連接3.人工結(jié)合免疫原的鑒定要鑒定人工結(jié)合免疫原的質(zhì)量，必須要測定偶聯(lián)在載體上的半抗原量，常用的測定方法有吸收光譜分析法和核素標記半抗原滲入法。

用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽，即人工合成抗原。

（二）人工合成抗原

將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當載體DNA分子相結(jié)合，然后引入受體細胞中（如大腸桿菌或酵母菌）使之表達，能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后可作為抗原，即基因工程抗原。

（三）基因工程抗原四、佐劑為了促進抗體的產(chǎn)生，可在注射抗原的同時，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為免疫佐劑（immunoadjuvant）,簡稱佐劑（adjuvant）。

在進行動物免疫時最常用的佐劑是福氏（Freund）佐劑，根據(jù)有無卡介苗又可分為福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑。福氏不完全佐劑是由油劑和乳化劑制成，在福氏不完全佐劑中加入卡介苗就成了福氏完全佐劑。

（一）佐劑的種類

福氏佐劑和抗原的比例為1:1。由于福氏佐劑是油劑，加入抗原后要充分混合成乳劑。

混合方法：研磨法攪拌注射器混合法注射器混合法1.改變抗原的物理性狀，延長抗原在體內(nèi)的存留時間，從而有效地刺激免疫系統(tǒng)；2.刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)，增強其抗原提呈能力；3.可加強淋巴細胞的增殖分化，促進其對抗原的處理能力。

（二）佐劑的作用機制第二節(jié)免疫血清的制備將抗原以不同途徑免疫動物，可從動物血清中分離得到抗體，因而把這類含有抗體的血清稱為抗血清或免疫血清。天然抗原常含有多種抗原決定簇，可刺激動物體內(nèi)多個B細胞克隆針對該抗原的多種抗原決定簇產(chǎn)生不同的抗體，所以抗血清實質(zhì)上是多克隆抗體（PcAb）。多價抗原多個B細胞克?。ㄖ旅舻腂細胞）多克隆抗體抗血清的制備流程免疫動物選擇免疫方案制定動物采血抗血清分離純化及鑒定

抗血清的保存

一、免疫動物選擇1．抗原來源與免疫動物的種屬關(guān)系2．動物的個體情況

3．抗原的性質(zhì)

4．抗血清的用量及要求

二、免疫方案制定

1．免疫原的劑量2．免疫途徑

3．免疫時間間隔

次序日序（天）注射途徑注射劑量（ml）抗原11多點皮內(nèi)1.0沙門菌O抗原26靜脈0.5沙門菌O抗原311靜脈0.5沙門菌O抗原416靜脈1.0沙門菌O抗原519靜脈2.0沙門菌O抗原傷寒沙門菌O抗原免疫家兔的方案三、動物采血1．頸動脈放血法：最常用的方法2．心臟采血法：此法多用于豚鼠等小動物，技術(shù)要求高

3．靜脈采血法：可多次進行，所以可收集到的血液量較多

四、抗血清的分離純化及鑒定采集的血液多采用在室溫自然凝固，待凝塊收縮后分離血清。前者迅速，但獲得血清較少；后者時間長，但獲得血清多，而且效價穩(wěn)定。（一）抗血清的分離1.特異性抗體的純化

①親和層析法②吸附劑方法2.IgG類抗體的純化

①鹽析②凝膠過濾③離子交換和親和層析法（二）抗血清的純化1.抗體效價的鑒定

一般原則是顆粒性抗原用凝集試驗，可溶性抗原用雙向瓊脂擴散試驗。

2.抗體特異性的鑒定

常用雙向免疫擴散法進行鑒定。

（三）抗血清的鑒定3.抗體純度的鑒定

可采用免疫電泳、雙向瓊脂擴散試驗、SDS等方法鑒定。4.抗體親和力的鑒定

常用ELISA、RIA和平衡透析法等進行測定。

1.4℃保存：保存3～6個月2.-20℃～-40℃保存：保存3～5年3.冷凍真空干燥保存

：長期保存五、抗血清的保存小結(jié)免疫原的制備主要包括細胞性免疫原、可溶性抗原和人工免疫原的制備?？寡宓闹苽淞鞒讨饕獮椋好庖邉游锏倪x擇、免疫方案的制定、動物采血、抗血清的分離、純化和鑒定和抗血清的保存。知識目標1.掌握：免疫原和佐劑的概念（重點）。2.熟悉：抗血清制備時免疫動物的選擇和免疫方案的制定

?？寡逯苽涞牧鞒蹋y點）。3.了解：蛋白質(zhì)的分離和純化方法

；佐劑的應(yīng)用。能力目標1.熟練掌握免疫原的制備方法。2.學(xué)會抗血清的制備方法。素質(zhì)目標細心、耐心、免疫學(xué)基本思維教學(xué)目標免疫原和佐劑的概念。抗血清制備時免疫動物的選擇和免疫方案的制定

。抗血清制備的流程。蛋白質(zhì)的分離和純化方法

。佐劑的應(yīng)用。本章要點目錄免疫原的制備一免疫血清的制備二抗原和抗體是免疫學(xué)檢測中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測。前言第一節(jié)免疫原的制備

免疫原（immunogen）就是抗原，是指能夠刺激機體產(chǎn)生抗體并能與之發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。眾多的抗原物質(zhì)中絕少是單一組分的，所以必須從復(fù)雜的物質(zhì)中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。一、細胞性免疫原的制備1.綿羊紅細胞抗原制備采集新鮮綿羊紅細胞注入無菌并帶有玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，充分搖動15分鐘后除去纖維蛋白，再以無菌生理鹽水洗滌3次，最后配成1×106/ml濃度的細胞懸液，即可應(yīng)用。

2.細菌抗原的制備細菌抗原有菌體抗原和鞭毛抗原等，多選用典型菌株的液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。鞭毛抗原需用有動力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而菌體抗原則需要在100℃加溫2～2.5小時后應(yīng)用。

蛋白質(zhì)、酶、核酸、細菌毒素等皆為可溶性抗原，這些物質(zhì)大多來源于人和動物的組織和細胞，要想獲得此類抗原，通常要先破碎組織和細胞，再進一步提取和純化。

二、可溶性抗原的制備及鑒定1.組織勻漿的制備

高速搗碎法研磨法（一）組織和細胞中可溶性抗原的粗提

2.細胞破碎的方法⑴反復(fù)凍融法⑵超聲破碎法⑶溶菌酶處理法⑷自溶法⑸表面活性劑處理法1.超速離心法2.選擇性沉淀法3.凝膠過濾和離子交換層析4.親和層析5.電泳

（二）可溶性抗原的提純

1、超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達到彼此分離的目的。特點：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。2、選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。特點：簡單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。常用：鹽析沉淀法用硫酸銨等中性鹽中和蛋白質(zhì)表面的電荷及破壞水化膜，使蛋白質(zhì)沉淀。3、凝膠過濾法凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)4、離子交換層析法原理：帶離子基團的纖維素或凝膠可吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)因等電點不同所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。梯度洗脫時逐步增加流動相的離子強度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競爭纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等幾個部分而被洗脫下來，達到分離純化的目的。5、親和層析法優(yōu)點：提取純度高、抗原抗體不失活性。

純化抗原的鑒定內(nèi)容包括含量、分子量、純度和免疫活性的鑒定等。鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫電泳法、雙向瓊脂擴散試驗等。

（三）純化抗原的鑒定

用化學(xué)合成法或基因重組法制備的抗原，稱之為人工抗原，包括人工結(jié)合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。三、人工免疫原制備

半抗原不能直接做為免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性。這種經(jīng)過人工修飾的半抗原稱之為人工合成抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。

（一）人工合成抗原制備

1.常用的載體⑴蛋白質(zhì)類⑵多肽聚合物⑶大分子聚合物

2.半抗原與載體的連接半抗原+載體（蛋白、合成載體）=完全抗原物理法或化學(xué)法連接3.人工結(jié)合免疫原的鑒定要鑒定人工結(jié)合免疫原的質(zhì)量，必須要測定偶聯(lián)在載體上的半抗原量，常用的測定方法有吸收光譜分析法和核素標記半抗原滲入法。

用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽，即人工合成抗原。

（二）人工合成抗原

將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當載體DNA分子相結(jié)合，然后引入受體細胞中（如大腸桿菌或酵母菌）使之表達，能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后可作為抗原，即基因工程抗原。

（三）基因工程抗原四、佐劑為了促進抗體的產(chǎn)生，可在注射抗原的同時，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為免疫佐劑（immunoadjuvant）,簡稱佐劑（adjuvant）。

在進行動物免疫時最常用的佐劑是福氏（Freund）佐劑，根據(jù)有無卡介苗又可分為福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑。福氏不完全佐劑是由油劑和乳化劑制成，在福氏不完全佐劑中加入卡介苗就成了福氏完全佐劑。

（一）佐劑的種類

福氏佐劑和抗原的比例為1:1。由于福氏佐劑是油劑，加入抗原后要充分混合成乳劑。

混合方法：研磨法攪拌注射器混合法注射器混合法1.改變抗原的物理性狀，延長抗原在體內(nèi)的存留時間，從而有效地刺激免疫系統(tǒng)；2.刺激單核-吞噬細胞系統(tǒng)，增強其抗原提呈能力；3.可加強淋巴細胞的增殖分化，促進其對抗原的處理能力。

（二）佐劑的作用機制知識目標1.掌握：免疫原和佐劑的概念（重點）。2.熟悉：抗血清制備時免疫動物的選擇和免疫方案的制定

?？寡逯苽涞牧鞒蹋y點）。3.了解：蛋白質(zhì)的分離和純化方法

；佐劑的應(yīng)用。能力目標1.熟練掌握免疫原的制備方法。2.學(xué)會抗血清的制備方法。素質(zhì)目標細心、耐心、免疫學(xué)基本思維教學(xué)目標免疫原和佐劑的概念。抗血清制備時免疫動物的選擇和免疫方案的制定

。抗血清制備的流程。蛋白質(zhì)的分離和純化方法

。佐劑的應(yīng)用。本章要點目錄免疫原的制備一免疫血清的制備二

將抗原以不同途徑免疫動物，可從動物血清中分離得到抗體，因而把這類含有抗體的血清稱為抗血清或免疫血清。天然抗原常含有多種抗原決定簇，可刺激動物體內(nèi)多個B細胞克隆針對該抗原的多種抗原決定簇產(chǎn)生不同的抗體，所以抗血清實質(zhì)上是多克隆抗體（PcAb）。免疫血清的制備二多價抗原多個B細胞克?。ㄖ旅舻腂細胞）多克隆抗體抗血清的制備流程免疫動物選擇免疫方案制定動物采血抗血清分離純化及鑒定

抗血清的保存

一、免疫動物選擇1．抗原來源與免疫動物的種屬關(guān)系2．動物的個體情況

3．抗原的性質(zhì)

4．抗血清的用量及要求

二、免疫方案制定

1．免疫原的劑量2．免疫途徑

3．免疫時間間隔

次序日序（天）注射途徑注射劑量（ml）抗原11多點皮內(nèi)1.0沙門菌O抗原26靜脈0.5沙門菌O抗原