蛋白純化課件教學課件

蛋白純化課件蛋白純化概述蛋白純化的方法蛋白純化的步驟蛋白純化實驗操作蛋白純化的應用contents目錄CHAPTER01蛋白純化概述是指從復雜的生物樣品中分離、純化出目的蛋白的過程，是蛋白質研究中的重要環(huán)節(jié)。蛋白純化目的方法獲得高純度、高活性的目的蛋白，以便進行后續(xù)的結構和功能研究。包括離心、沉淀、萃取、層析等多種技術手段。030201蛋白純化的定義通過純化后的電泳結果，可以確定蛋白質的分子量大小。確定蛋白質的分子量通過等電聚焦電泳，可以確定蛋白質的等電點。確定蛋白質的等電點通過層析等方法，可以將目的蛋白從其他雜質中分離出來，獲得高純度的蛋白質。獲得高純度蛋白質高純度的目的蛋白是進行X射線晶體學或核磁共振結構解析的必要條件。用于結晶和結構解析蛋白純化的目的03根據蛋白質的疏水性質進行分離利用不同蛋白質分子與有機溶劑之間的親和性差異，通過疏水層析等方法進行分離。01根據蛋白質分子量大小不同進行分離利用不同層析介質對不同分子量蛋白質的吸附和解吸能力不同，從而實現分離。02根據蛋白質的電荷性質進行分離利用不同蛋白質在一定pH值下所帶電荷性質的差異，通過電泳或離子交換層析等方法進行分離。蛋白純化的基本原理CHAPTER02蛋白純化的方法鹽析法通過加入高濃度的鹽溶液，改變蛋白質的溶解度使其沉淀，常用的鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。有機溶劑沉淀法利用有機溶劑降低水的介電常數，使蛋白質發(fā)生沉淀。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇和丙酮等。聚合物沉淀法利用聚合物如聚乙二醇、聚蔗糖等與蛋白質結合形成沉淀。沉淀法將待純化的蛋白質溶液裝入透析袋中，扎緊袋口后放入緩沖液中進行透析，使小分子物質隨緩沖液滲出而去除。囊式透析將待純化的蛋白質溶液放入由半透膜制成的平板中，然后將其放入緩沖液中，使小分子物質隨緩沖液滲出而去除。平板透析透析法利用兩種不相溶的溶劑，將待純化的蛋白質從一種溶劑中轉移到另一種溶劑中，常用的溶劑有水、甲醇、乙醇、乙醚等。利用反膠束形成劑如十二烷基硫酸鈉和氯化鈉等，形成反膠束溶液，將待純化的蛋白質萃取到反膠束中，再通過離心或超濾等方法分離。萃取法反膠束萃取法兩相萃取法利用陰離子交換劑如DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖等，將待純化的蛋白質與陰離子交換劑結合，再通過改變離子強度或pH值將其洗脫下來。陰離子交換法利用陽離子交換劑如CM-纖維素、CM-葡聚糖等，將待純化的蛋白質與陽離子交換劑結合，再通過改變離子強度或pH值將其洗脫下來。陽離子交換法離子交換法凝膠過濾法原理利用凝膠顆粒的分子篩作用，將待純化的蛋白質按大小進行分離。不同大小的蛋白質在通過凝膠顆粒時受到的阻力不同，從而以不同的速度移動，最終實現分離。應用凝膠過濾法常用于分離純化蛋白質、酶、核酸等生物大分子，尤其適用于分離分子量相近的蛋白質或多肽。CHAPTER03蛋白純化的步驟選擇合適的生物樣品，如細胞、組織或培養(yǎng)液，確保樣品中目標蛋白的含量較高。樣品來源采用物理或化學方法破碎細胞，釋放細胞內的蛋白質。細胞破碎通過離心、過濾等方法去除細胞碎片、顆粒物等雜質。去除雜質樣品準備沉淀與溶解通過調節(jié)溶液的pH值、離子強度或添加有機溶劑，使蛋白質沉淀，再通過溶解將蛋白質重新溶解在適宜的緩沖液中。凝膠電泳分離利用電泳技術將蛋白質在凝膠上進行分離，根據蛋白質的電荷和大小進行分離。離心分離根據蛋白質的密度和大小差異，采用離心法進行初步分離。粗分離利用特定的配基與蛋白質結合，通過洗脫液將目標蛋白質與配基分離。親和色譜利用蛋白質的電荷性質進行分離，通過改變溶液的離子強度，將目標蛋白質與其他蛋白質分離開。離子交換色譜利用蛋白質的疏水性質進行分離，通過調節(jié)溶液的離子強度和有機溶劑濃度，使目標蛋白質與其他蛋白質分離開。疏水相互作用色譜精細分離質譜分析對純化的蛋白質進行質譜分析，確定蛋白質的氨基酸序列和修飾情況。Westernblot利用特異性抗體檢測目標蛋白質的存在，進一步驗證蛋白質的純度和含量。SDS電泳通過電泳分離蛋白質，并用考馬斯亮藍染色法檢測蛋白質的純度。純度檢測與鑒定CHAPTER04蛋白純化實驗操作實驗器材離心機、層析柱、注射器、試管等。試劑緩沖液、洗滌劑、蛋白質樣品等。實驗材料準備1.準備實驗器材和試劑，確保其清潔和完好。2.根據實驗需求，配置適當的緩沖液和洗滌劑。3.將蛋白質樣品加入離心機中進行離心分離。實驗材料準備5.收集洗脫液并進行檢測，確定蛋白質的純度和濃度。6.對實驗結果進行分析和總結。4.使用注射器將上清液注入層析柱中，進行層析分離。實驗材料準備層析分離使用注射器將上清液注入層析柱中，根據蛋白質的性質選擇合適的洗脫液進行洗脫。實驗前準備確保實驗器材和試劑的清潔和完好，準備好實驗記錄本。樣品處理將蛋白質樣品加入離心機中進行離心分離，收集上清液。檢測收集洗脫液并進行檢測，確定蛋白質的純度和濃度。結果分析對實驗結果進行分析和總結，評估蛋白質的純度，確定后續(xù)處理方法。實驗操作流程實驗結果分析通過檢測洗脫液中的蛋白質成分，評估蛋白質的純度。詳細記錄實驗數據和結果，包括洗脫液的體積、蛋白質濃度等。根據實驗數據和結果，分析蛋白質的性質和純度，確定后續(xù)處理方法。總結實驗過程和結果，評估實驗的優(yōu)缺點，提出改進意見和建議。蛋白質純度評估數據記錄結果分析總結CHAPTER05蛋白純化的應用蛋白純化技術用于分離和純化藥物靶點蛋白，為藥物研發(fā)提供關鍵的活性成分。藥物研發(fā)通過純化抗原蛋白，用于疫苗的制備，確保疫苗的安全性和有效性。疫苗制備純化的特異性蛋白可用于診斷疾病，如腫瘤標志物、免疫疾病相關蛋白等。疾病診斷生物醫(yī)藥領域抗性分析純化植物抗性蛋白，研究植物抗病、抗蟲、抗逆的分子機制。營養(yǎng)與施肥純化植物生長相關蛋白，研究植物營養(yǎng)需求和施肥管理。品種鑒定通過純化農作物中的特異性蛋白，進行品種鑒定和純度分析。農業(yè)領域123純化食品中的功能蛋白，用于食品成分分析和質量控制。食品成分分析利用蛋白純化技術，開發(fā)具有特定功能的食品添加劑和配料。功能性食品研發(fā)研究食品加工過程中蛋白質的變化和作用，優(yōu)化加工工藝。食品加工技術優(yōu)化食品工業(yè)領域純化特定環(huán)