第四章-目的基因的分離

第四章目的基因的分離

教學(xué)要求：

掌握常用的目的基因制備方法目的基因的分離基本原理及應(yīng)用

原核生物基因的組成

真核生物基因的組成

真核生物基因的轉(zhuǎn)錄

結(jié)構(gòu)基因

結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）是指一類不僅可轉(zhuǎn)錄成信使RNA（mRNA），而且可翻譯成多肽鏈，從而構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（包括催化各種生化反應(yīng)的酶）的基因。第一節(jié)目的基因的制備

直接分離法構(gòu)建基因組文庫分離法構(gòu)建cDNA基因文庫分離法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴增目的基因基因的化學(xué)合成

什么是基因？基因是指攜帶有遺傳信息的DNA序列，是控制性狀的基本遺傳單位亦即一段具有功能性的DNA序列?；蛲ㄟ^指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來表達(dá)自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現(xiàn)。

目的基因基因工程的主要目的是使優(yōu)良性狀相關(guān)的基因聚集在同一生物體中，創(chuàng)造出具有高度應(yīng)用價值的新物種。為此，必須從現(xiàn)有的生物群體中，根據(jù)需要分離出用于克隆的此類基因。通常將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離、改造、擴增或表達(dá)的特定基因或DNA片斷，稱為目的基因。生物界的長期進(jìn)化積累了大量對人類有用的基因，這是一個寶貴的資源。2012年1月5日報道，美國誕生了首例轉(zhuǎn)基因猴，它們的基因來自六個不同的胚胎。一、直接分離法限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法基因分離的物理化學(xué)法“鳥槍法”1、限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法適用于從簡單的基因組中分離目的基因（例如質(zhì)?；虿《荆┮讯ㄎ唬焊鶕?jù)目的基因兩側(cè)的已知的酶切位點，一次就可以獲得。已定序：只需要用已知序列的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行一次或者多次酶切，分離純化所需的DNA片段，與適當(dāng)載體連接。未定序或無定位：也只需酶切分析，隨后再通過部分酶切，構(gòu)建一個簡單的基因文庫，然后釣出目的基因。優(yōu)點由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。缺點目的基因易被切碎。2、基因分離的物理化學(xué)法

基本原理是DNA分子的兩條鏈存在著G≡C、A﹦T堿基配對，其中GC間存在著3個氫鍵，AT間存在著2個氫鍵。如果不同基因的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)如浮力密度、解鏈溫度等也有明顯不同，采用相應(yīng)的方法即可達(dá)到從生物基因組分離目的基因的目的。密度梯度離心法（富含GC的片段浮力密度大，使用精密的密度梯度超速離心技術(shù)）單鏈酶解法（富含GC的片段Tm高）分子雜交法（堿基互補配對）缺點：僅在理論上有重要意義，在實踐上很難應(yīng)用。密度梯度離心法單鏈酶解法分子雜交法物理化學(xué)法富含GC的片段浮力密度大富含GC的片段Tm高堿基互補配對非洲爪蟾5SDNA海膽DNA大腸桿菌乳糖操縱子的β-半乳糖苷酶3、“鳥槍法”（Shotgun）將目的DNA隨機地處理成大小不同的片段，再將這些片段的序列連接起來的測序方法。最初主要用于測定微生物基因組序列。后來，“生物鬼才”文特爾（CraigVenter）及其公司美國塞萊拉公司先后利用改進(jìn)的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測序工作，證明了它在測定大基因組上的可行性和有效性。使用多種限制性內(nèi)切酶或超聲波等方法將生物細(xì)胞染色體DNA切割成基因水平的許多片段將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合，將重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫結(jié)合篩選的方法從眾多的轉(zhuǎn)化子中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離回收將重疊的序列進(jìn)行拼接，最終得到DNA序列主要操作步驟：

1999年12月用“逐個克隆法”獲得第一條人類染色體—22號染色體完成序列

2000年3月用“全基因組鳥槍法”獲得果蠅全基因組序列。中國科學(xué)院2004年12月9日在北京宣布，國際雞基因組計劃取得重大成果：利用經(jīng)濟、快速、高效的測序方法――“鳥槍法”，我國科學(xué)家不僅和國際同行共同繪制出以紅原雞為對象的雞基因框架圖譜，而且領(lǐng)銜繪制出了烏雞、肉雞、蛋雞等四種不同雞種之間的遺傳差異圖譜。優(yōu)點：

不需要高密度的圖譜

速度快、簡單、成本低缺點：

拼接組裝困難，尤其在重復(fù)序列多的區(qū)域主要用于重復(fù)序列少、相對簡單的原核生物基因組中國科學(xué)家的水稻基因組計劃“提供了一個有關(guān)鳥槍測序法速度和效率的極好范例”。二、構(gòu)建基因組文庫分離法1、基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）

從生物組織細(xì)胞提取出全部DNA，用物理方法或酶法將DNA降解成預(yù)期大小的片段，然后將這些片段與適當(dāng)?shù)妮d體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞，這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細(xì)胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體。2、基本步驟①細(xì)胞染色體大分子DNA提取和大片段的制備；②載體DNA的制備；③載體與外源大片段的連接；④體外包裝及基因組DNA文庫的擴增；⑤重組DNA的篩選和鑒定。

3、基因組DNA文庫的特點1975年，Clarke和Carbon提出計算重組子數(shù)目的公式：N=ln（1-P）/ln（1-f）式中，N為所需的重組子的數(shù)目；f為單個重組體中插入片段平均大小與基因組DNA總量之比；P為選出某一基因的概率（通常期望為99%）。以人

-珠蛋白基因為例，分子量約為1.5Kb。那么如果要構(gòu)建一個

-珠蛋白基因的基因組文庫（篩選到的可能性為99％

），這個基因組文庫要多大？為了使基因組文庫具有真實代表性，一般構(gòu)建基因組文庫的實際克隆數(shù)應(yīng)比上述計算值大2倍或3倍，甚至更高。對于原核和低等真核細(xì)胞，基因結(jié)構(gòu)比較簡單，基因組文庫可作為直接提供基因工程所需的各種目的基因的重要來源。較高等的真核細(xì)胞，尤其是人和哺乳動物細(xì)胞，基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，一個結(jié)構(gòu)基因往往可被數(shù)個插入序列所間隔，因此從基因組文庫中分離得到的基因片段很難直接用于體外的表達(dá)研究。但它們對真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的分析、基因表達(dá)和調(diào)控的研究有著重要作用。三、構(gòu)建cDNA基因文庫分離法

1、cDNA

基因文庫概念提取組織細(xì)胞的全部mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。2、構(gòu)建步驟

細(xì)胞總RNA的制備及mRNA的分離與完整性的確定；cDNA

第一條鏈與雙鏈cDNA

的合成及克??；cDNA

與載體的連接、噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定等。組織或細(xì)胞mRNAcDNA大小分級可供克隆的

cDNA片段載體（選擇一種）連接片段和載體將重組載體導(dǎo)入大腸桿菌（體外包裝或轉(zhuǎn)化）滴定并鑒定文庫篩選目的克隆擴增文庫長期保存3、cDNA

克隆的主要優(yōu)點特別適用于某些RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)研究篩選比較簡單易行

目的基因的選擇中出現(xiàn)假陽性的概率比較低可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究4、cDNA

克隆的主要缺點cDNA

文庫所包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫不能直接獲得基因的內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量的調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面的信息低豐度mRNA的cDNA

克隆所占的比例比較低基因組文庫與cDNA文庫的特點比較：四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴增目的基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）技術(shù)簡稱PCR技術(shù)，是一種體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。PCR這項技術(shù)是由凱利·穆利斯(KaryMullis，美國化學(xué)家)于1985年發(fā)明，1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎（還榮獲了日本頒發(fā)的45萬美元的獎金

）。1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準(zhǔn)（專利號4,683,202），Mullis是第一發(fā)明人。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。1、PCR的原理2、PCR步驟DNA變性（90℃-96℃）退火（25℃-65℃）延伸（70℃-75℃）

3、典型的PCR反應(yīng)體系

4、PCR的應(yīng)用鑒定基因親子鑒定診斷遺傳病克隆基因誘變分析遠(yuǎn)古DNA鑒定特定表型的突變體基因比較基因表達(dá)量PCR的種類反向PCR(InversePCR,IPCR)不對稱PCR(asymmetricPCR)多重PCR反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription,RT-PCR)巢式PCR(NESTPCR)遞減PCR(TouchdownPCR)熒光定量PCR（Q-PCR)PCR引物設(shè)計原則（PCR的第一步

）五、基因的化學(xué)合成

人工合成基因的方法主要有兩條途